Summary
Este protocolo presenta un modelo de ratón estandarizado de expansión de sutura y un método de visualización 3D para estudiar los cambios mecanobiológicos de la sutura y la remodelación ósea bajo carga de fuerza de tracción.
Abstract
Las suturas craneofaciales juegan un papel crucial más allá de ser articulaciones fibrosas que conectan los huesos craneofaciales; También sirven como nicho principal para el crecimiento de los huesos del calvario y la cara, albergando células madre mesenquimales y osteoprogenitores. Como la mayoría de los huesos craneofaciales se desarrollan a través de la osificación intramembranosa, las regiones marginales de las suturas actúan como puntos de iniciación. Debido a esta importancia, estas suturas se han convertido en objetivos intrigantes en terapias ortopédicas como la expansión de la bóveda craneal asistida por resorte, la expansión maxilar rápida y la protracción maxilar. Bajo la fuerza de trazado ortopédico, las células madre de sutura se activan rápidamente, convirtiéndose en una fuente dinámica para la remodelación ósea durante la expansión. A pesar de su importancia, los cambios fisiológicos durante los períodos de remodelación ósea siguen siendo poco conocidos. Los métodos tradicionales de corte, principalmente en la dirección sagital, no capturan los cambios integrales que ocurren a lo largo de toda la sutura. Este estudio estableció un modelo estándar de ratón para la expansión de la sutura sagital. Para visualizar completamente los cambios de remodelación ósea después de la expansión de la sutura, el método de limpieza de tejido PEGASOS se combinó con tinción de EdU de montaje completo y doble marcaje quelante de calcio. Esto permitió la visualización de células altamente proliferantes y la formación de hueso nuevo en todos los huesos del calvario después de la expansión. Este protocolo ofrece un modelo de ratón de expansión de sutura estandarizado y un método de visualización en 3D, que arroja luz sobre los cambios mecanobiológicos en las suturas y la remodelación ósea bajo carga de fuerza de tracción.
Introduction
Las suturas craneofaciales son tejidos fibrosos que conectan los huesos craneofaciales y desempeñan un papel esencial en el crecimiento y la remodelación de los huesos craneofaciales. La estructura de la sutura se asemeja a un río, proporcionando un flujo de recursos celulares para nutrir y construir la "orilla del río", conocidos como frentes osteogénicos, que contribuyen a la formación de huesos craneofaciales a través de la osteogénesis intramembranosa1.
El interés en las suturas craneofaciales ha sido impulsado por las necesidades clínicas de comprender el cierre prematuro de las suturas craneales y la disfunción de la sutura facial, que puede conducir a deformidades craneofaciales e incluso afecciones potencialmente mortales en los niños. La suturectomía abierta se utiliza de forma rutinaria en el tratamiento clínico, pero el seguimiento a largo plazo ha demostrado una recurrencia incompleta de la reosificación en algunos pacientes2. La craneotomía mínimamente invasiva asistida por resortes de expansión o la craniectomía endoscópica con rayas puede proporcionar un enfoque más seguro para preservar la sutura potencial en lugar de descartar los tejidos3. Del mismo modo, las terapias ortopédicas, como las mascarillas y los aparatos de expansión, han sido ampliamente utilizadas para tratar la hipoplasia maxilar sagital u horizontal, y algunos estudios han ampliado la limitación de edad para tratar a pacientes adultos mediante expansores palatinos asistidos por minitornillos 4,5,6. Además, la regeneración de la sutura craneal con células madre mesenquimales (MSC) combinadas con materiales biodegradables es una terapia potencial en el futuro, que ofrece una dirección novedosa para el tratamiento de enfermedades relacionadas7. Sin embargo, la función, el proceso o mecanismo regulador de las suturas sigue siendo difícil de alcanzar.
El remodelado óseo consiste principalmente en un equilibrio entre la formación ósea realizada por los osteoblastos y la resorción ósea realizada por los osteoclastos, donde la diferenciación osteogénica de las células madre estimuladas por señales mecánicas juega un papel importante. Después de décadas de investigación, se ha encontrado que las suturas craneofaciales son nichos de células madre mesenquimales altamente plásticas8. Las células madre de sutura (SuSC) son un grupo heterogéneo de células madre, pertenecientes a las células madre mesenquimales (MSC) o a las células madre óseas (SSC). Las SuSC se marcan in vivo mediante cuatro marcadores, que incluyen Gli1, Axin2, Prrx1 y Ctsk. Las SuSC Gli1+ , en particular, han verificado estrictamente las características biológicas de las células madre, no solo exhibiendo una alta expresión de marcadores típicos de MSC, sino que también demostrando un excelente potencial osteogénico y condrogénico9. Investigaciones anteriores han demostrado que los SuSC Gli1+ contribuyen activamente a la formación de hueso nuevo bajo la fuerza de tracción, identificándolos como la fuente de células madre de sutura que apoyan la osteogénesis por distracción10.
En el pasado, se estudiaron in vitro extensas características mecánicas de las células madre a través de Flexcell, flexión de cuatro puntos, sistema de carga de microimanes y otros. Aunque se han identificado in vitro células mesenquimales derivadas de suturas craneales de ratón 11, y recientemente también se han aislado células madre mesenquimales de sutura humana12, la respuesta biomecánica de las células de sutura sigue sin estar clara en el sistema in vitro. Para profundizar en el proceso de remodelación ósea, se ha establecido un modelo de expansión de sutura basado en el cultivo aislado de órganos de la calvaria, allanando el camino para establecer un modelo de expansión de sutura útil in vivo 1,13. Los conejos14 y las ratas15 han sido los animales más utilizados en la investigación básica para la expansión de las suturas. Sin embargo, los ratones son los modelos animales preferidos para explorar enfermedades humanas debido a su genoma altamente homólogo con los humanos, numerosas líneas de modificación genética y una fuerte capacidad de hibridación reproductiva. Los modelos de ratón existentes de expansión de la sutura craneal suelen basarse en alambres de resorte de ortodoncia de acero inoxidable para aplicar fuerza de tracción a la sutura sagital16,17. En estos modelos, se hacen dos orificios a cada lado de los huesos parietales para fijar el dispositivo de expansión, y los cables se incrustan debajo de la piel, lo que puede afectar el modo de activación celular.
En cuanto al método de visualización, la observación bidimensional de cortes en la dirección sagital se ha adoptado generalmente durante décadas. Sin embargo, teniendo en cuenta que el remodelado óseo es un proceso dinámico tridimensional complejo, la obtención de información tridimensional completa se ha convertido en una necesidad urgente. La técnica de transparencia tisular PEGASOS surgió para cumplir con este requerimiento18,19. Ofrece ventajas únicas para la transparencia de los tejidos duros y blandos, lo que permite reproducir el proceso completo de remodelación ósea en un espacio tridimensional.
Para obtener una comprensión más profunda y completa de los cambios fisiológicos en los períodos de remodelación ósea, se estableció un modelo estándar de ratón de expansión de sutura sagital con un ajuste de resorte entre los soportes hechos a mano10. Con un procedimiento estandarizado de grabado y unión con ácido, el dispositivo de expansión podría adherirse firmemente al hueso craneal, generando una fuerza de tracción perpendicular a la sutura sagital. Además, se aplicó el método de limpieza de tejido PEGASOS después del doble marcaje del hueso mineralizado después de la expansión para visualizar completamente los cambios en el modelado óseo después de la expansión de la sutura.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales del Noveno Hospital Popular de Shanghái, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (SH9H-2023-A616-SB). En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6 de 4 semanas de edad. Todos los instrumentos utilizados fueron esterilizados antes del procedimiento.
1. Elaboración del modelo de expansión de sutura
- Preparación de dos soportes de retención.
- Use alambre australiano de 0.014 '' o alambre de acero inoxidable (consulte la tabla de materiales) para hacer un bucle helicoidal con alicates de alambre ligero. El diámetro del bucle es de 2 mm, y la cola de 1 mm está reservada en dos lados (Figura 1A).
- Esterilice los alambres y los soportes para la cirugía en un autoclave, esterilizador de plasma o esterilizante frío adecuado (por ejemplo, glutaraldehído).
- Preparación de los muelles.
- Prepare resortes de acero inoxidable personalizados.
NOTA: En este estudio se utiliza el resorte de presión con un diámetro de alambre de 0,2 mm, un diámetro externo de 1,5 mm, un espacio de intervalo de 1 mm y una longitud de 7 mm (Figura 1B). Cada muelle de compresión de 1 mm obtuvo un empuje de unos 30 g. - Corte el resorte en una longitud disponible antes de fraguar. Confirme la fuerza del resorte especializado antes del experimento.
NOTA: Los tamaños de los resortes varían siempre que la magnitud de la fuerza sea la misma en experimentos paralelos. La fuerza se mide mediante un instrumento de prueba uniaxial de mesa o un pequeño dinamómetro electrónico (ver Tabla de Materiales) si la condición es limitada. El cambio de longitud se evalúa según la magnitud de la fuerza (Figura 1C-E). En particular, es necesario cambiar el valor de carga de la fuerza del resorte en función de la edad, la condición ósea del ratón y los objetos de investigación. - Prepare un alambre australiano recto o un alambre recto de acero de 7 mm de longitud y haga dos hojas de papel con diámetros de 2 mm para usar como barreras (Figura 1F).
- Prepare resortes de acero inoxidable personalizados.
2. Cirugía de expansión de la sutura sagital
- Anestesia: Anestesiar a los ratones con tiletamina (25 mg/kg), zolazepam (25 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg). Al mismo tiempo, aplique ungüento oftálmico estéril en los ojos para evitar que se sequen las córneas. Juzgue la profundidad de la anestesia de los ratones a través de un pellizco en el dedo del pie.
NOTA: Las siguientes características indican que el ratón está anestesiado correctamente: respiración lenta y constante, debilidad de las extremidades, relajación muscular, desaparición del reflejo de acupuntura de la piel y del reflejo de los párpados, así como un reflejo corneal más débil. - Eliminación y desinfección del pelo: Retire con cuidado el pelo de la parte superior de la cabeza con crema depilatoria; Evite tocarse los ojos. Poco después, use rondas alternas de yodoforo y alcohol al 75% para desinfectar el sitio quirúrgico. Administrar meloxicam (1 mg/kg) como analgesia a los ratones mediante inyección subcutánea.
- Fijación de la posición del cuerpo: Coloque el ratón acostado boca abajo y use cintas quirúrgicas para fijar las extremidades en la mesa de operaciones.
- Colgajo abierto del cuero cabelludo: Utilice unas tijeras quirúrgicas para realizar un colgajo arqueado a lo largo del cuero cabelludo cerca del cuello del ratón, exponiendo completamente la sutura sagital y el cráneo circundante. Después de eso, fije el colgajo del cuero cabelludo con una sutura 6-0 en la mesa de operaciones.
- Pega los soportes de retención después del grabado ácido.
- Secar el cráneo y grabarlo con ácido fosfórico al 37% durante 20 s, y utilizar solución salina normal para limpiar el grabado ácido (Figura 2A). Un residuo calcáreo será evidente después de secar el cráneo con la pera de pipeta de goma.
- Cementar los dos soportes (preparados en el paso 1.1) a ambos lados de los huesos parietales a 3 mm de las suturas sagitales con un adhesivo fotopolimerizable (Figura 2B).
- Restablezca el colgajo del cuero cabelludo.
- Vuelva a colocar manualmente el colgajo del cuero cabelludo (Figura 2C). Etiquete la posición de los soportes, corte dos pequeños agujeros en el cuero cabelludo en la posición correspondiente de los soportes de retención bilaterales y luego restablezca el cuero cabelludo con solapa.
- Al mismo tiempo, pasa los pequeños bucles a través de los agujeros para exponer la superficie de la piel. Suturar la incisión curva con una sutura 6-0 (Figura 2D). Se permiten de uno a tres días para la recuperación de la piel. Administrar meloxicam (1 mg/kg) a los ratones mediante inyección subcutánea cada 24 h durante 1 a 3 días.
NOTA: Después de la cirugía, verifique diariamente la actividad del cuero cabelludo del ratón y si los soportes se caen. Existen varios tipos de piel en materia de color y grosor; La piel sana del cuero cabelludo mantendrá el color original y los bordes de la piel se fusionarán gradualmente después de la sutura. Si se encuentra una infección en el cuero cabelludo, o si el dispositivo quirúrgico se ha caído, retire al ratón del estudio y apasifíquelo.
- Instale el resorte y el cable guía.
- Corte el resorte 1 mm más largo que la distancia entre los dos soportes.
- Comprima el resorte de presión seleccionado y colóquelo entre las pequeñas bobinas a ambos lados.
- Pase el alambre de acero inoxidable a través de las pequeñas bobinas y el resorte, y suelte el resorte para obtener un empuje inicial de aproximadamente 30 g.
- Compruebe que el cuero cabelludo debajo del área del resorte del mouse no tenga ninguna compresión.
- Después de confirmar que la unión es firme y no está suelta, pegue dos trozos de papel entre el resorte y los soportes con un adhesivo fotopolimerizable para colocar barreras en ambos extremos del resorte (Figura 2E, F).
3. Doble etiquetado de huesos mineralizados
- Preparación de la solución madre.
- Prepare una solución de dilución con agua destilada que contenga 0,9% de NaCl y 2% de NaHCO3.
- Utilice la solución diluyente para preparar 20 mg/ml de complejo de alizarina dihidratado y 10 mg/ml de calceína (consulte la tabla de materiales).
- Ajuste el pH a 7,4 con un dispositivo de medición de pH. Enjuague la sonda de pH entre mediciones para garantizar lecturas precisas.
- Coloque el tinte en un recipiente estéril y guárdelo en un refrigerador a 4 ° C; Se utiliza papel de aluminio para mantener la luz fuera.
- Prepare la solución de trabajo. Antes de la inyección, diluir la solución madre a 1 mg/ml para el calcio y 2 mg/ml para el complejo de alizarina dihidratado utilizando una solución de disolución.
- Inyectar intraperitonealmente 5 mg/kg de verde de calceína y 20 mg/kg de rojo de alizarina en dos puntos de tiempo para etiquetar los huesos mineralizados y analizar los cambios entre dos tiempos. Generalmente, recoja las muestras 12-14 h después de la inyección.
NOTA: Caliente los tintes antes de la inyección y asegúrese de que el tiempo de inyección no sea inferior a 3 minutos. El intervalo de inyección depende del tiempo de expansión. En este estudio, el rojo de alizarina y el verde de calceína se inyectaron durante la noche (O/N) antes de la expansión y O/N antes de la recolección, respectivamente. - Recoja los huesos enteros de la pantorrilla preparados para el procedimiento de limpieza de tejidos un día después de la segunda inyección.
4. Tinción de EdU
- Inyección intraperitoneal: Inyectar EdU por vía intraperitoneal 2 h antes de la eutanasia de los ratones (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). La dosis es de 1 mg/10 g de peso corporal.
- Preparación del cóctel de etiquetado: Mezclar solución salina tamponada con Tris (100 mmol/L final, pH 7,6), CuSO4 (4 mmol/L final), Sulfo-cianina 3 Azide (2-5 μmol/L final) y Ascorbato de Sodio (100 mmol/L final, hecho fresco cada uso) (ver Tabla de Materiales).
- Tinción de montaje completo de EdU: Después del paso de decoloración del tejido en el método de limpieza de tejidos PEGASOS (paso 7), coloque las muestras en el cóctel de etiquetado durante 1 día a temperatura ambiente (RT).
5. Imágenes de microtomografía computarizada
- Fijación y almacenamiento de tejidos: Fijar los huesos de la pantorrilla en paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 °C O/N y almacenarlos en PFA al 0,5% antes de escanear.
- Escaneo y análisis: Escanee las muestras con un sistema de imágenes de microtomografía computarizada (μCT) con alta resolución y un tamaño de vóxel de 7 μm.
6. Preparación de la solución de trabajo para la limpieza de tejidos PEGASOS
- Poliformaldehído (PFA) al 4%: Disuelva 4 g de polvo de PFA en 1× PBS a 100 ml.
- Solución de perfusión cardíaca: Heparina al 0,02%, es decir, 20 mg de heparina en polvo disuelto en 1× PBS a 100 mL; alternativamente, utilice 0,05 mol/L de EDTA, es decir, 0,05 mol de ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) (véase la Tabla de materiales), disuelto en una solución acuosa desionizada hasta un volumen total de 1 L.
- Solución de descalcificación: 0,5 mol/L de EDTA, es decir, 0,5 mol de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), disuelto en una solución acuosa desionizada hasta un volumen total de 1 L.
- Solución de decoloración: Quadrol al 25%, que son 250 ml de Quadrol (N, N, N', N' - Tetrakis (2-hidroxipropil) etilendiamina) (ver Tabla de materiales) disuelto en agua desionizada hasta un volumen total de 1 L.
NOTA: Debido a la viscosidad de Quadrol, se puede calentar a 60 °C para aumentar su fluidez antes de la configuración. - Solución desengrasante: terc-butanol (tB) al 30%, 50%, 70% (ver Tabla de Materiales), preparada con agua por fracción volumétrica.
NOTA: Teniendo en cuenta que la tB pura es cristalina a temperatura ambiente, debe calentarse a 60 °C hasta que se disuelva antes de poder utilizarse. Posteriormente, se añade entre un 3% y un 5% (v/v) de trietanolamina (TEA) para regular el pH de la solución >9,5. - Solución de deshidratación: Solución TB-PEG, 70% tB + 27% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), en la que PEG-MMA es poli (etilenglicol) metil éter metacrilato con un peso molecular medio de 500 (poli (etilenglicol) metacrilato 500, PEG-MMA 500) (ver Tabla de Materiales).
- Solución transparente: solución BB-PEG, 75% BB + 22% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), en la que BB es benzoato de bencilo (BB).
7. Transparencia de los huesos del calvario con el método PEGASOS
- Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de anestésicos (paso 2.1) y juzgar la profundidad de la anestesia del ratón a través de la reacción de pellizco para asegurarse de que no haya reacción de resistencia antes de la perfusión cardíaca.
- Realizar perfusión y fijación cardíaca.
- Sostenga el abdomen del ratón hacia arriba, fije las extremidades con cinta adhesiva y corte con cuidado a lo largo de la circunferencia del tórax para exponerlo por completo.
- Inmediatamente después de realizar una pequeña incisión en la aurícula derecha con unas tijeras oftálmicas, inserte una aguja de perfusión 22 G en el ápice del ventrículo izquierdo.
NOTA: Solo se inserta la punta de la aguja para evitar dañar la válvula cardíaca a través de una inserción excesiva. De lo contrario, el líquido de perfusión cardíaca entrará en la circulación pulmonar, afectando el efecto de perfusión de la circulación sistémica. - Empuje el líquido de perfusión cardíaca de 30-50 ml (paso 6.2) en la jeringa. Se puede ver que el hígado gradualmente se vuelve pálido de rojo brillante.
- Después de que el líquido de salida de la aurícula derecha se vuelva completamente transparente, infunda una solución de PFA al 4% en el mismo volumen. La operación de perfusión de PFA se lleva a cabo en una campana ventilada.
- Diseccionar y separar los tejidos y órganos, y fijarlos durante la noche con PFA al 4% a 4 °C.
- Descalcificación de tejidos: Para muestras procesadas por tinción de EdU, colocar el tejido duro fijado en una solución de EDTA (pH 7,0) 0,5 mol/L (10 mL) en una mesa vibratoria a 37 °C durante aproximadamente 2 días y cambiar el líquido diariamente.
NOTA: Omita el proceso de descalcificación en el método PEGASOS normalizado para los huesos marcados con agente quelante de calcio para preservar completamente la señalización. La descalcificación es necesaria para tratar los huesos y visualizar la fluorescencia endógena o las señales inmunoteñidas de montaje completo. - Decoloración de los tejidos: Colocar los huesos fijos del calvario en una solución de Quadrol al 25% (20 mL) en una mesa agitadora a 37 °C durante 1 día, y cambiar el líquido una vez.
NOTA: El tiempo de decoloración está relacionado con el contenido de hemo en el tejido. Observe el color del líquido de tratamiento, ya que la profundidad del color representa la necesidad de continuar con el tratamiento de reemplazo de líquidos. - Tinción de EdU: Enjuague las muestras en 1× PBS durante 5 min (tres veces) y luego sumérjalas en el cóctel de etiquetado durante 1 día. Después de eso, enjuague las muestras en 1× PBS durante 1 h (tres veces).
- Desengrasado y deshidratación de tejidos
- Coloque los tejidos en soluciones de 30 % tB, 50 % tB y 70 % tB en secuencia para realizar la disminución del gradiente en una mesa vibratoria a 37 °C. Colocar en cada concentración durante aproximadamente 2 h.
- Posteriormente, deshidratar las muestras en solución TB-PEG durante 6 h sobre una mesa vibratoria a 37 °C.
NOTA: El tiempo de procesamiento anterior puede aumentarse o disminuirse según el número de tejidos.
- Transparencia del tejido: Colocar el tejido completamente deshidratado en una solución BB-PEG sobre una mesa agitadora a 37 °C (2-4 h) hasta que esté transparente. Actualmente, las muestras se pueden almacenar hasta 1-2 años.
NOTA: Después de limpiar casi por completo, abra la tapa del tubo para exponer las muestras y el medio al aire con agitación para mejorar aún más la transparencia. Este método es adecuado para mejorar la transparencia de los tejidos y órganos individuales, así como de toda la cabeza y el cuerpo de ratones jóvenes. Sin embargo, para la transparencia de todo el cuerpo de ratones adultos, los pasos anteriores deben realizarse utilizando un método de perfusión de ciclo completo.
8. Imágenes
NOTA: En este estudio se utilizó microscopía confocal para la visualización en 3D de tejidos transparentes. La microscopía de lámina de luz también es apropiada para este protocolo. Se ha verificado que varios sistemas operativos están disponibles antes. Aquí, se toma como ejemplo un sistema operativo de microscopio confocal láser (ver Tabla de materiales).
- De acuerdo con el manual del usuario, siga los pasos correctos para abrir la interfaz de operación confocal láser y LAS AF. Encienda el láser requerido en diferentes canales de disparo y ajuste la potencia. Establezca la ruta óptica y la longitud de onda correspondiente, 561 nm para el rojo de alizarina y 488 nm para el verde de calceína, cualquiera de los cuales se utiliza para la señal EdU de acuerdo con el cóctel de etiquetado.
- Coloque las muestras transparentes en la placa de Petri de vidrio cóncavo que puede transportar muestras gruesas, cajas de inclusión o dispositivos de colocación de fabricación propia, como pegamento impermeable, para sumergir las muestras transparentes en un líquido transparente.
- Seleccione una lente de objetivo de baja potencia para localizar rápidamente la muestra. Haga una visión general de todo el tejido de la pantorrilla con la función de escaneo rápido y encuentre el área de interés para la obtención de imágenes.
- Ajuste la potencia de salida, seleccione el modo de escaneo y ajuste primero los coeficientes de disparo (resolución, velocidad de escaneo, factor de zoom, calidad de imagen, ruido de fondo medio, etc.).
NOTA: Generalmente, Smart Gain oscila entre 500 y 800 (tanto la señal como el ruido cambian); Smart Offset es lo más cercano posible a 0 al tiempo que garantiza la calidad de la imagen (para reducir el ruido de fondo). Cuando la ganancia PMT es superior a 800, o la ganancia HyD es superior al 100%, y el brillo sigue siendo insuficiente, la intensidad del láser se puede aumentar adecuadamente, pero en principio, cuanto más baja, mejor. - Establezca la distancia axial Z rango y el paso Z, que se profundiza desde el lado menos profundo de la organización transparente; es decir, establecer los lados más profundos y menos profundos.
NOTA: Confirme la clasificación y la distancia de trabajo para cada lente. Ajuste con cuidado el rango Z y no opere la distancia de trabajo excediendo el límite de la lente seleccionada. El "z-Galvo" se puede seleccionar cuando se necesita una regulación fina. - Vuelva a ajustar los parámetros de disparo y comience a disparar. Una vez completado, fusione y procese las imágenes a través del módulo multifuncional. Finalmente, guarde y apague el instrumento en el orden indicado.
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Representative Results
Utilizando este protocolo, se ha establecido un modelo de ratón para la expansión de la sutura sagital (Figura 1-2). Para la visualización en 3D de los cambios en el modelado óseo después de la expansión de la sutura, se aplicó el método de limpieza de tejido PEGASOS a todos los huesos del calvario después de la expansión. Después de la perfusión, se separaron los huesos del calvario (Figura 3A) y se continuó con el proceso PEGASOS apropiado (Tabla 1 y Tabla 2). Sorprendentemente, los huesos del calvario se volvieron casi transparentes después del proceso completo de PEGASOS, independientemente de si se realizó la descalcificación (Figura 3B, C).
Para visualizar rápidamente los cambios después de la expansión, se utilizó μCT en las muestras recolectadas y fijadas. En comparación con el grupo control (Figura 4A), la sutura craneal se expandió gradual y significativamente después de aplicar fuerza durante 1 día (Figura 4B). Al quinto día, aparecieron protuberancias óseas esponjosas en el borde óseo (Figura 4C).
Para la visualización tridimensional de la tasa de yuxtaposición de mineralización en toda la sutura después de la expansión, se empleó el método de doble marcaje junto con la eficiente técnica PEGASOS, incluso en huesos calvariales no descalcificados (Figura 5). En condiciones fisiológicas, hubo cambios menores entre las señales de marcaje previas y posteriores (Figura 5A), mientras que la carga de fuerza activó significativamente la osteogénesis. El patrón en zigzag del hueso recién mineralizado, marcado con un solo marcador amarillo-verde cálcico, se ensanchó después de expandirse durante 7 días (Figura 5B, C). En la visualización tridimensional de alta resolución, los cambios en el patrón de los huesos marginales indicaron el proceso de remodelación ósea después de la expansión de la sutura, y el grado de hueso recién formado varió en ambos lados de las suturas (Figura 5C).
Además, para visualizar la tasa de proliferación de las células tras la expansión de la sutura, se intentó la incorporación de EdU de montaje completo utilizando el método de limpieza tisular PEGASOS con un proceso de calcificación. Con éxito, el marcaje fue eficiente y bien conservado en los tejidos aclarados. En el grupo control, varias células EdU+ se distribuyeron de forma difusa a lo largo de las suturas (Figura 6A), lo que podría ser importante para la remodelación ósea fisiológica y posiblemente pasarse por alto en el corte 2D. Al expandirse durante 1 día, las células proliferantes alcanzaron su punto máximo en el centro y los bordes de las suturas (Figura 6B). A medida que la sutura se ensanchaba, el número de células proliferantes disminuía con el tiempo, llegando al día 7 (Figura 6C). Las células resaltadas eran pequeñas células redondas en la médula ósea, lo que indica células sanguíneas, que diferían de las células de sutura EdU+ (Figura 6C).
Figura 1: Se prepararon los materiales vitales para la cirugía. Los soportes de retención estaban hechos de alambre de acero inoxidable. Sus diámetros eran de 2 mm, y las colas de 1 mm se reservaban en dos lados (A). Se aplicó el resorte de presión con un diámetro de alambre de 0,2 mm, un diámetro externo de 1,5 mm, un espacio de intervalo de 1 mm (B). La fuerza de tracción fue detectada por un dinametro (C,D). Cada compresión de resorte de 1 mm obtuvo un empuje de aproximadamente 30 g (E) en este experimento. Se cortaron trozos de papel en forma de cometas de 2 mm de diámetro para utilizarlos como barreras (F). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Proceso quirúrgico para el modelo de ratón con expansión de sutura. Después de voltear el colgajo de la pantorrilla, se realizó el grabado ácido (A) y la unión (B) en la posición donde quedarían expuestos los soportes de retención. Después de restablecer el colgajo del cuero cabelludo (C), los soportes se expusieron en la posición marcada (D). Se colocó un resorte entre dos soportes para ejercer fuerza de expansión sobre la sutura de la calvaria, y se fijaron dos trozos de papel en ambos extremos del resorte como barreras (E, F) después de confirmar que los soportes estaban firmemente unidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Se aplicó el procedimiento de limpieza tisular PEGASOS para dos huesos de la pantorrilla con o sin descalcificación. Después de la perfusión, se separaron los huesos del calvario, con algunos tejidos blandos manchados de sangre y adheridos (A). Los huesos del calvario que han experimentado el proceso de descalcificación (B) o con no descalcificación (C) fueron casi completamente transparentes después de todo el proceso de PEGASOS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Suturas de la pantorrilla expandidas gradualmente después del ejercicio de la fuerza de tracción. Imágenes de μCT de sutura sagital sin carga de fuerza (A) y después de carga de fuerza durante 1 día y 5 días (B,C). Barra de escala: 100 μm. Exp = expansión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Osteogénesis activada después de la expansión de la sutura en imágenes 3D. (A-C) Visualización tridimensional de suturas sagitales de doble marcado aclaradas por el método PEGASOS. El rojo de alizarina y el verde de calceína se inyectaron intraperitonealmente durante la noche antes de la expansión y antes de la eutanasia después de la expansión durante 7 días (B,C), respectivamente, en comparación con el grupo de control sin carga mecánica en los mismos puntos de tiempo (A). Se utilizó una lente de 5x para adquirir las imágenes de sutura completa de manera eficiente (A, B), y la imagen de la caja en (B) se amplió en (C, C', C'') con una lente de 10x. Barra de escala en A,B: 100 μm, C: 150 μm. Exp = expansión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Las células de sutura proliferaron en gran medida tras la carga de fuerza de tracción en imágenes en 3D. Los ensayos de incorporación de montaje completo combinados con el método de limpieza de tejidos PEGASOS mostraron las células proliferantes en toda la sutura cuando estaban en silencio (A) o después de la carga forzada durante 1 día y 7 días (B, C). Imagen con una lente de 10x. Las líneas discontinuas delinean dos bordes para las suturas sagitales. Barra de escala: 100 μm. Exp = expansión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Procesos | Soluciones | Tiempo y temperatura |
| 1. Inyección intraperitoneal | 1 mg/10 g de EdU | 2 h antes de la eutanasia de los ratones |
| 2. Perfusión | 0,02% de heparina y 0,05 mol/L de EDTA | / |
| 3. Fijación | 4% PFA | O/N, 4 °C |
| 4. Descalcificación | 10% de EDTA | 2 días, 37 °C |
| 5. Decoloración | 25% Quadrol | 1 día, 37 °C |
| 6. Tinción de EdU | Cóctel de etiquetado | 1 día, RT |
| 7. Desengrasado | 30% terc-butanol | 2 h, 37 °C |
| 50% terc-butanol | 2 h, 37 °C | |
| 70% terc-butanol | 2 h, 37 °C | |
| 8. Deshidratación | Solución TB-PEG | 3 h*2, 37 °C |
| 9. Compensación | Solución BB-PEG | 2 h, 37 °C |
Tabla 1: Procedimiento de limpieza tisular PEGASOS para huesos del calvario con tinción de EdU.
| Procesos | Soluciones | Tiempo y temperatura |
| 1. Inyección intraperitoneal | 20 mg/kg rojo de alizarina | durante la noche antes de la expansión |
| 2. Inyección intraperitoneal | 5 mg/kg de Calceína | durante la noche antes de la recogida |
| 3. Perfusión | 0,02% de heparina y 0,05 mol/L de EDTA | / |
| 4. Fijación | 4% PFA | O/N, 4 °C |
| 5. Decoloración | 25% Quadrol | 1 día, 37 °C |
Tabla 2: Procedimiento de limpieza tisular PEGASOS para huesos del calvario con doble marcaje de huesos mineralizados por verde de calceína y rojo de alizarina.
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Discussion
Se aplicó un modelo de ratón de expansión de sutura estándar para observar los cambios morfológicos regulares que ocurren cada semana durante todo el ciclo de remodelación de un mes de duración10. Este modelo es útil para investigar la remodelación y regeneración ósea del calvario mediante la expansión de las suturas del calvario, así como para estudiar varias células de sutura in vivo. Para presentar completamente los resultados de dicha investigación, se necesita una visualización tridimensional de los tejidos teñidos. Por lo tanto, la tecnología PEGASOS, conocida por su eficiencia en la eliminación de tejidos duros19,20, se combinó con el etiquetado dual y la tinción de EdU para revelar tasas de mineralización expandidas y células proliferantes durante el proceso de expansión.
En cuanto a la cirugía de expansión de suturas, uno de los pasos clave es la unión del anillo de retención. Para asegurar una unión firme con la superficie ósea, estandarizamos el proceso de grabado y unión al ácido en la parte inferior del anillo de retención. Los pequeños bucles en el anillo de retención deben ser perpendiculares a la superficie ósea y corresponder a pequeños orificios en el cuero cabelludo. Después de suturar el cuero cabelludo, los pequeños bucles deben exponerse a la superficie de la piel a través de pequeños orificios en un estado natural y equilibrado para evitar que el anillo de retención se colapse durante la instalación del resorte de aplicación forzada y el alambre guía, lo que podría provocar el fracaso de la cirugía. Además, la selección de un resorte de aplicación de fuerza adecuado es vital para una cirugía exitosa, ya que facilita la instalación del resorte al tiempo que evita que el anillo de retención se caiga y logre la aplicación de fuerza deseada.
En comparación con los modelos anteriores, este modelo ofrece varias ventajas. En primer lugar, previene la formación de defectos óseos circulares en el hueso parietal, preservando el modo de activación celular. Además, la fuerza se puede eliminar en cualquier momento desmontando el resorte, lo que lo hace adecuado para establecer un modelo de recurrencia después del estiramiento por tensión. La conveniencia de desmontar el resorte también garantiza un daño secundario mínimo a los animales de experimentación. Además, la magnitud mecánica de la tensión de tracción se puede ajustar fácilmente cambiando la fuerza del resorte. Es importante destacar que este modelo mantiene el entorno fisiológico natural alrededor de la sutura craneal, lo que garantiza la precisión de los resultados experimentales.
Sin embargo, existen algunas limitaciones en este modelo de expansión. En primer lugar, existe el riesgo de que el anillo de retención se caiga si la fuerza es excesiva. Los principiantes deben realizar ejercicios preliminares en la instalación de resortes para mitigar este riesgo. En segundo lugar, existe el riesgo de infección al abrir el cuero cabelludo y exponer el cráneo, por lo que la desinfección del instrumento es esencial, y acortar la duración de la cirugía es beneficioso para la curación. El exceso de anestesia también puede provocar la muerte de ratones.
En cuanto al método PEGASOS pasivo, es aplicable para lograr la transparencia en tejidos y órganos individuales, así como en toda la cabeza y el cuerpo de ratones jóvenes. Si bien es eficiente para los huesos enteros del calvario, se requiere un tiempo de procesamiento más largo para muestras más grandes, especialmente para tejidos óseos enteros o tejidos óseos largos a granel con articulaciones. Es importante tener en cuenta que la descalcificación del tejido no debe realizarse cuando se utiliza el protocolo de doble etiquetado, ya que interfiere con el proceso de tinción. El método de limpieza de tejidos PEGASOS también es flexible, lo que permite la combinación con varios métodos de etiquetado, no limitado a la incorporación de EdU o el doble etiquetado de calcio, sino también la fluorescencia endógena en modelos de ratón transgénicos o la tinción de colorantes o anticuerpos de montaje completo, todos con fluorescencia bien conservada.
Con efectos estables y alta repetibilidad, este modelo de expansión de sutura es adecuado para varias cepas de ratones transgénicos de diferentes edades. La capacidad de ajustar la magnitud de la tensión de tracción y la fuerza de retirada en cualquier momento permite una investigación conveniente sobre la recurrencia después de la estimulación por estrés. Al combinar el método de doble marcaje de huesos mineralizados con la técnica de limpieza de tejidos PEGASOS, podemos observar la distribución espacio-temporal tridimensional de las células madre de sutura craneal durante el remodelado óseo, lo que permite profundizar en la exploración de la relación entre las SUSC y el estrés mecánico, así como sus mecanismos específicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos la plataforma de laboratorio y la asistencia del Instituto del Oído, Facultad de Medicina de la Universidad Jiaotong de Shanghai. Este trabajo contó con el apoyo del Programa Pujiang de Shanghái (22PJ1409200); Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.11932012); Fundación de Investigación Científica Postdoctoral del Noveno Hospital Popular de Shanghái, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái; Financiación del programa de investigación fundamental del Noveno Hospital Popular afiliado a la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (JYZZ154).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
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