Summary
Detta protokoll presenterar en standardiserad suturexpansionsmusmodell och en 3D-visualiseringsmetod för att studera de mekanobiologiska förändringarna i suturen och benombyggnad under dragkraftsbelastning.
Abstract
Kraniofaciala suturer spelar en avgörande roll utöver att vara fibrösa leder som förbinder kraniofaciala ben; De fungerar också som den primära nischen för kalvariell och ansiktsbentillväxt, och innehåller mesenkymala stamceller och osteoprogenitorer. Eftersom de flesta kraniofaciala ben utvecklas genom intramembranös förbening, fungerar suturernas marginella regioner som initieringspunkter. På grund av denna betydelse har dessa suturer blivit spännande mål i ortopediska terapier som fjäderassisterad kranialvalvsexpansion, snabb maxillär expansion och maxillär protraktion. Under ortopedisk spårningskraft aktiveras suturstamceller snabbt och blir en dynamisk källa för benombyggnad under expansion. Trots deras betydelse är de fysiologiska förändringarna under benombyggnadsperioder fortfarande dåligt förstådda. Traditionella snittningsmetoder, främst i sagittal riktning, fångar inte de omfattande förändringar som sker genom hela suturen. Denna studie etablerade en standardmusmodell för sagittal suturexpansion. För att fullt ut visualisera förändringar i benombyggnad efter suturexpansion kombinerades PEGASOS-vävnadsrensningsmetoden med helmonterad EdU-färgning och dubbelmärkning av kalciumkelatering. Detta möjliggjorde visualisering av celler med hög tillväxt och nybildning av ben över hela kalvarialbenet efter expansion. Detta protokoll erbjuder en standardiserad suturexpansionsmusmodell och en 3D-visualiseringsmetod, som belyser de mekanobiologiska förändringarna i suturer och benombyggnad under dragkraftsbelastning.
Introduction
Kraniofaciala suturer är fibrösa vävnader som förbinder kraniofaciala ben och spelar viktiga roller i tillväxten och ombyggnaden av kraniofaciala ben. Suturens struktur liknar en flod, vilket ger ett flöde av cellresurser för att ge näring och bygga "flodbanken", känd som de osteogena fronterna, som bidrar till bildandet av kraniofaciala ben via intramembranös osteogenes1.
Intresset för kraniofaciala suturer har drivits av kliniska behov av att förstå för tidig stängning av kranialsuturer och ansiktssuturdysfunktion, vilket kan leda till kraniofaciala missbildningar och till och med livshotande tillstånd hos barn. Öppen suturektomi används rutinmässigt vid klinisk behandling, men långtidsuppföljning har visat ofullständiga återfall av benbildning hos vissa patienter2. Minimalinvasiv kraniotomi med hjälp av expansionsfjädrar eller endoskopisk ranjeektomi kan ge ett säkrare tillvägagångssätt för att bevara den potentiella suturen snarare än att kassera vävnaderna3. På liknande sätt har ortopediska terapier som ansiktsmasker och expansionsapparater använts i stor utsträckning för att behandla sagittal eller horisontell maxillär hypoplasi, med vissa studier som utvidgar åldersgränsen till att behandla vuxna patienter via miniskruvassisterade palatala expanders 4,5,6. Dessutom är kranial suturregenerering med mesenkymala stamceller (MSC) i kombination med biologiskt nedbrytbara material en potentiell terapi i framtiden, vilket erbjuder en ny riktning för behandling av relaterade sjukdomar7. Funktionsprocessen eller regleringsmekanismen för suturer är dock fortfarande svårfångad.
Benremodellering består huvudsakligen av en balans mellan benbildning utförd av osteoblaster och benresorption utförd av osteoklaster, där osteogen differentiering av stamceller stimulerad av mekaniska signaler spelar en viktig roll. Efter årtionden av forskning har det visat sig att kraniofaciala suturer är mycket plastiska mesenkymala stamcellsnischer8. Suturstamceller (SuSC) är en heterogen grupp av stamceller som tillhör mesenkymala stamceller (MSC) eller benstamceller (SSC). SuSC märks in vivo med fyra markörer, inklusive Gli1, Axin2, Prrx1 och Ctsk. Gli1+ SuSCs, i synnerhet, har strikt verifierat stamcellernas biologiska egenskaper, inte bara genom att uppvisa ett högt uttryck av typiska MSC-markörer utan också genom att uppvisa utmärkt osteogen och kondrogen potential9. Tidigare forskning har visat att Gli1+ SuSC aktivt bidrar till nybildning av ben under dragkraft, och identifierar dem som suturstamcellskällan som stöder distraktionsosteogenes10.
Tidigare har omfattande mekaniska egenskaper hos stamceller studerats in vitro via Flexcell, fyrpunktsböjning, mikromagnetladdningssystem och andra. Även om mesenkymala celler från mösskraniella suturer har identifierats in vitro11, och humana suturmesenkymala stamceller också har isolerats nyligen12, är suturkurcellernas biomekaniska respons fortfarande oklar i in vitro-systemet. För att ytterligare undersöka benremodelleringsprocessen har en suturexpansionsmodell baserad på isolerad calvaria-organkultur etablerats, vilket banar väg för att etablera en användbar in vivo suturexpansionsmodell 1,13. Kaniner14 och råttor15 har varit de mest använda djuren i grundforskning för suturexpansion. Möss är dock föredragna djurmodeller för att utforska mänskliga sjukdomar på grund av deras mycket homologa genom med människor, många genmodifieringslinjer och starka reproduktiva hybridiseringsförmåga. Befintliga musmodeller av kranial suturexpansion förlitar sig vanligtvis på ortodontiska fjädertrådar av rostfritt stål för att applicera dragkraft på den sagittala suturen16,17. I dessa modeller görs två hål på varje sida av parietalbenen för att fixera expansionsanordningen, och trådarna är inbäddade under huden, vilket kan påverka cellaktiveringsläget.
När det gäller visualiseringsmetoden har den tvådimensionella observationen av skivor i sagittal riktning varit allmänt antagen i årtionden. Men med tanke på att benremodellering är en komplex tredimensionell dynamisk process har det blivit ett akut behov att få fullständig tredimensionell information. PEGASOS-tekniken för vävnadstransparens visade sig uppfylla detta krav18,19. Det erbjuder unika fördelar för transparensen hos hårda och mjuka vävnader, vilket gör att hela benombyggnadsprocessen kan reproduceras i tredimensionellt utrymme.
För att få en djupare och mer omfattande förståelse för de fysiologiska förändringarna i benombyggnadsperioderna etablerades en standard sagittal suturexpansionsmusmodell med en fjäderinställning mellan de handgjorda hållarna10. Med en standardiserad syraetsning och bindningsprocedur kan expansionsanordningen bindas ordentligt till kranialbenet, vilket genererar en dragkraft vinkelrätt mot den sagittala suturen. Vidare tillämpades PEGASOS-vävnadsrensningsmetoden efter dubbelmärkning av det mineraliserade benet efter expansion för att fullt ut visualisera benmodelleringsförändringarna efter suturexpansion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer som beskrivs här har godkänts av Animal Care Committee of Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (SH9H-2023-A616-SB). 4 veckor gamla C57BL/6 hanmöss användes i denna studie. Alla instrument som användes steriliserades före ingreppet.
1. Förberedelse av suturexpansionsmodellen
- Förberedelse av två retentionshållare.
- Använd 0,014 '' australisk tråd eller tråd av rostfritt stål (se materialförteckning) för att göra en spiralformad slinga med en lätt trådtång. Öglans diameter är 2 mm och 1 mm svans är reserverad på två sidor (Figur 1A).
- Sterilisera trådarna och hållarna för operationen i en autoklav, plasmasterilisator eller lämpligt kallsteriliseringsmedel (t.ex. glutaraldehyd).
- Förberedelse av fjädrarna.
- Förbered anpassade fjädrar i rostfritt stål.
OBS: Tryckfjädern med 0.2 mm tråddiameter, 1.5 mm ytterdiameter, 1 mm intervallutrymme och 7 mm längd används i denna studie (Figur 1B). Varje 1 mm fjäderkompression erhöll en dragkraft på cirka 30 g. - Kapa fjädern till en tillgänglig längd innan du härdar. Bekräfta kraften för den specialiserade fjädern före experimentet.
OBS: Storleken på fjädrarna varieras så länge kraftstorleken är densamma i parallella experiment. Kraften mäts med ett enaxlat testinstrument eller en liten elektronisk dynamometer (se materialtabell) om tillståndet är begränsat. Längdförändringen utvärderas till kraftens storlek (Figur 1C-E). I synnerhet är det nödvändigt att ändra fjäderkraftens belastningsvärde baserat på ålder, musens bentillstånd och forskningsobjekten. - Förbered en rak australisk tråd eller rak ståltråd med en längd på 7 mm och gör två pappersbitar med 2 mm diameter att använda som barriärer (Figur 1F).
- Förbered anpassade fjädrar i rostfritt stål.
2. Sagittal suturexpansionskirurgi
- Anestesi: Bedöva mössen med tiletamin (25 mg/kg), zolazepam (25 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg). Applicera samtidigt steril ögonsalva på ögonen för att förhindra att hornhinnorna torkar ut. Bedöm djupet av anestesi hos mössen via en tånypning.
OBS: Följande egenskaper indikerar att musen är sövd på rätt sätt: långsam och stadig andning, svaghet i armar och ben, muskelavslappning, försvinnande av hudakupunkturreflex och ögonlocksreflex, samt svagare hornhinnereflex. - Pälsborttagning och desinfektion: Ta försiktigt bort pälsen på toppen av huvudet med hårborttagningskräm; Undvik att röra vid ögonen. Strax efteråt, använd alternerande omgångar av jodfor och 75 % alkohol för att desinficera operationsområdet. Administrera meloxikam (1 mg/kg) som smärtlindring till mössen genom subkutan injektion.
- Kroppspositionsfixering: Lägg musen liggande på framsidan och använd kirurgtejp för att fixera lemmarna på operationsbordet.
- Öppen hårbottenflik: Använd en kirurgisk sax för att utföra en bågformad flik längs hårbotten nära musens hals, vilket helt exponerar den sagittala suturen och den omgivande skallen. Fäst sedan hårbottenfliken med en 6-0-sutur på operationsbordet.
- Fäst retentionshållarna efter syraetsning.
- Torka skallen och etsa den med 37 % fosforsyra i 20 sekunder och använd vanlig koksaltlösning för att rensa upp syraetsningen (Figur 2A). En kritaktig rest kommer att vara uppenbar efter torkning av skallen med gummipipettlampan.
- Cementera de två hållarna (förberedda i steg 1.1) på båda sidor av parietalbenen 3 mm från sagittalsuturerna med ett ljushärdat lim (Figur 2B).
- Återställ hårbottenfliken.
- Sätt tillbaka hårbottenfliken manuellt (Figur 2C). Märk hållarnas position, skär två små hål i hårbotten vid motsvarande position för de bilaterala retentionshållarna och återställ sedan den flikade hårbotten.
- För samtidigt de små öglorna genom hålen för att exponera hudens yta. Suturera det krökta snittet med en 6-0 sutur (Figur 2D). En till tre dagar är tillåtna för hudens återhämtning. Administrera meloxikam (1 mg/kg) till mössen genom subkutan injektion var 24:e timme i 1 till 3 dagar.
OBS: Efter operationen, kontrollera dagligen aktiviteten i musens hårbotten och om hållarna faller av. Det finns olika typer av hud när det gäller färg och tjocklek; Den friska hudbotten kommer att behålla den ursprungliga färgen, och hudkanterna kommer gradvis att smälta samman efter suturering. Om en infektion i hårbotten upptäcks, eller om den kirurgiska enheten har fallit av, ta bort musen från studien och avliva den.
- Montera fjädern och guidekabeln.
- Kapa fjädern 1 mm längre än avståndet mellan de två hållarna.
- Komprimera den valda tryckfjädern och placera den mellan de små spolarna på båda sidor.
- För den rostfria ståltråden genom de små spolarna och fjädern och släpp fjädern för att få en startkraft på cirka 30 g.
- Kontrollera att hårbotten under musens fjäderområde är utan kompression.
- Efter att ha bekräftat att bindningen är fast utan att vara lös, fäst två papperslappar mellan fjädern och hållarna med ett ljushärdande lim för att sätta upp barriärer i båda ändarna av fjädern (Figur 2E,F).
3. Dubbel märkning av mineraliserade ben
- Beredning av stamlösningen.
- Bered en spädningslösning med destillerat vatten som innehåller 0,9 % NaCl och 2 % NaHCO3.
- Använd spädningslösningen för att bereda 20 mg/ml Alizarinkomplexdihydrat och 10 mg/ml kalcein (se materialförteckning).
- Justera pH till 7.4 med hjälp av en pH-mätare. Spola pH-sonden mellan mätningarna för att säkerställa korrekta avläsningar.
- Lägg färgämnet i en steril behållare och förvara det i kylskåp vid 4 °C. Folie används för att hålla ljuset ute.
- Förbered arbetslösningen. Före injektion späds stamlösningen till 1 mg/ml för kalcium och 2 mg/ml för alizarinkomplexdihydrat med hjälp av en upplösningslösning.
- Injicera intraperitonealt 5 mg/kg kalceingrönt och 20 mg/kg alizarinrött vid två tidpunkter för att märka de mineraliserade benen och analysera förändringarna mellan två tidpunkter. I allmänhet samlas proverna in 12-14 timmar efter injektionen.
OBS: Värm färgämnena före injektion och se till att injektionstiden inte är mindre än 3 minuter. Injektionsintervallet beror på expansionstidpunkten. I denna studie injicerades alizarinrött och kalceingrönt över natten (O/N) före expansion respektive O/N före uppsamling. - Samla in hela kalvvariabla ben som förberetts för vävnadsrensning en dag efter den andra injektionen.
4. EdU-färgning
- Intraperitoneal injektion: Injicera EdU intraperitonealt 2 timmar innan avlivning av mössen (enligt institutionellt godkända protokoll). Dosen är 1 mg/10 g kroppsvikt.
- Märkning av cocktailberedning: Blanda Tris-buffrad koksaltlösning (100 mmol/L final, pH 7,6), CuSO4 (4 mmol/L final), sulfo-cyanin 3-azid (2-5 μmol/L final) och natriumaskorbat (100 mmol/L final, färskt vid varje användning) (se materialförteckning).
- EdU-färgning med helmontering: Efter avfärgningssteget för vävnad i PEGASOS-vävnadsrensningsmetoden (steg 7), lägg prover i märkningscocktailen i 1 dag vid rumstemperatur (RT).
5. Mikrodatortomografi
- Vävnadsfixering och lagring: Fixera kalvbenen i 4 % paraformaldehyd (PFA) vid 4 °C O/N och förvara dem i 0,5 % PFA före skanning.
- Skanning och analys: Skanna proverna med ett mikrodatortomografisystem (μCT) med hög upplösning och en voxelstorlek på 7 μm.
6. Beredning av arbetslösning för PEGASOS vävnadsrensning
- 4% polyformaldehyd (PFA): Lös upp 4 g PFA-pulver i 1× PBS till 100 ml.
- Hjärtperfusionslösning: 0,02 % heparin, det vill säga 20 mg heparinpulver upplöst i 1× PBS till 100 ml; Alternativt kan du använda 0,05 mol/L EDTA, det vill säga 0,05 mol etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (se materialtabell), löst i en avjoniserad vattenlösning till en total volym av 1 L.
- Avkalkningslösning: 0,5 mol/L EDTA, det vill säga 0,5 mol etylendiamintetraättiksyra (EDTA), löst i en avjoniserad vattenlösning till en total volym av 1 L.
- Avfärgningslösning: 25% Quadrol, som är 250 ml Quadrol (N, N, N', N' - Tetrakis (2-Hydroxypropyl) etylendiamin) (se Materialförteckning) löst i avjoniserat vatten till en total volym av 1 L.
OBS: På grund av Quadrols viskositet kan den värmas upp till 60 °C för att öka dess flytbarhet före konfiguration. - Avfettningslösning: 30 %, 50 %, 70 % tert-butanol (tB) (se materialtabell), beredd med vatten i volymfraktion.
OBS: Med tanke på att ren tB är kristallin vid rumstemperatur måste den värmas upp till 60 °C tills den löses upp innan den kan användas. Därefter tillsätts 3 % till 5 % (v/v) trietanolamin (TEA) för att reglera lösningens pH >9,5. - Dehydreringslösning: TB-PEG-lösning, 70 % tB + 27 % PEG-MMA + 3 % kvadrol (v/v), där PEG-MMA är poly(etylenglykol) metyletermetakrylat med en genomsnittlig molekylvikt på 500 (poly (etylenglykol) metakrylat 500, PEG-MMA 500) (se materialförteckning).
- Transparent lösning: BB-PEG-lösning, 75 % BB + 22 % PEG-MMA + 3 % Quadrol (v/v), där BB är bensylbensoat (BB).
7. Genomskinlighet av kalvbensben med PEGASOS-metoden
- Bedöva musen genom intraperitoneal injektion av anestesimedel (steg 2.1) och bedöm djupet av musens anestesi genom nypreaktionen för att säkerställa att det inte sker någon motståndsreaktion före hjärtperfusion.
- Utför hjärtperfusion och fixering.
- Håll musens buk uppåt, fäst lemmarna med tejp och skär försiktigt längs bröstkorgens omkrets för att exponera den helt.
- Omedelbart efter att ha gjort ett litet snitt i höger förmak med en ögonsax för du in en perfusion 22 G-nål vid toppen av vänster kammare.
OBS: Endast nålspetsen sätts in för att undvika att skada hjärtklaffen genom överdriven insättning. Annars kommer hjärtperfusionsvätska in i lungcirkulationen, vilket påverkar perfusionseffekten av den systemiska cirkulationen. - Tryck in 30-50 ml hjärtperfusionsvätska (steg 6.2) i sprutan. Man kan se att levern gradvis blir blek från klarröd.
- Efter att utflödesvätskan från höger förmak blivit helt klar, infundera 4 % PFA-lösning i lika stor volym. Drift av PFA-perfusion utförs i en ventilerad huva.
- Dissekera och separera vävnaderna och organen och fixera dem över natten med 4 % PFA vid 4 °C.
- Avkalkning av vävnad: För prover bearbetade genom EdU-färgning, placera den fixerade hårda vävnaden i 0,5 mol/L EDTA (pH 7,0) lösning (10 ml) i ett skakbord vid 37 °C i cirka 2 dagar och byt vätska dagligen.
OBS: Hoppa över avkalkningsprocessen i den normaliserade PEGASOS-metoden för kalciumkelateringsmedelsmärkta ben för att helt bevara signaleringen. Avkalkning krävs för att behandla benen för att visualisera den endogena fluorescensen eller immunfärgade helmonterade signaler. - Avfärgning av vävnad: Placera de fasta kalvbenen i 25 % kvadratlösning (20 ml) på ett skakbord vid 37 °C i 1 dag och byt vätska en gång.
OBS: Avfärgningstiden är relaterad till heminnehållet i vävnaden. Observera färgen på behandlingsvätskan, eftersom färgdjupet representerar behovet av att fortsätta vätskeersättningsbehandlingen. - EdU-färgning: Skölj proverna i 1× PBS i 5 minuter (tre gånger) och sänk sedan ner dem i märkningscocktailen i 1 dag. Skölj sedan proverna i 1× PBS i 1 timme (tre gånger).
- Avfettning och uttorkning av vävnad
- Placera vävnaderna i 30 % tB, 50 % tB och 70 % tB lösningar i följd för att utföra gradientminskning på ett skakbord vid 37 °C. Placera i varje koncentration i ca 2 timmar.
- Torka därefter proverna i TB-PEG-lösning i 6 timmar på ett skakbord vid 37 °C.
OBS: Ovanstående bearbetningstid kan ökas eller minskas beroende på vävnadens antal.
- Vävnadstransparens: Placera den helt uttorkade vävnaden i BB-PEG-lösning på ett skakbord vid 37 °C (2-4 timmar) tills den är genomskinlig. För närvarande kan prover lagras i upp till 1-2 år.
OBS: Efter nästan helt rensning, öppna rörlocket för att exponera samples och medium till luft med skakning kommer att ytterligare förbättra transparensen. Denna metod är lämplig för att förbättra transparensen hos enskilda vävnader och organ, såväl som hela huvudet och kroppen hos unga möss. För att hela kroppen hos vuxna möss ska vara genomskinlig bör dock ovanstående steg utföras med hjälp av en perfusionsmetod med full cykel.
8. Bildbehandling
OBS: Konfokalmikroskopi användes för 3D-visualisering av transparenta vävnader i denna studie. Light-sheet-mikroskopi är också lämpligt för detta protokoll. Flera operativsystem har verifierats som tillgängliga tidigare. Här tas ett operativsystem för laserkonfokalmikroskop som exempel (se materialförteckning).
- Enligt användarmanualen, följ de korrekta stegen för att öppna laserkonfokalen och LAS AF-driftgränssnittet. Slå på önskad laser i olika fotograferingskanaler och justera effekten. Ställ in den optiska vägen och motsvarande våglängd, 561 nm för Alizarin rött och 488 nm för Calcein grönt, som alla används för EdU-signalen enligt märkningscocktailen.
- Placera de genomskinliga proverna i den konkava petriskålen i glas som kan bära tjocka prover, inbäddningslådor eller egentillverkade placeringsanordningar som vattentätt lim för att sänka ner de genomskinliga proverna i en genomskinlig vätska.
- Välj en objektivlins med låg effekt för att snabbt hitta sample. Gör en överblick över hela den kaloriska vävnaden med snabbskanningsfunktionen och hitta intresseområdet för avbildning.
- Ställ in uteffekten, välj skanningsläge och justera först fotograferingskoefficienterna (upplösning, skanningshastighet, zoomfaktor, bildkvalitet, genomsnittligt bakgrundsbrus, etc.).
OBS: I allmänhet sträcker sig Smart Gain från 500 till 800 (både signal- och brusförändring); Smart Offset är så nära 0 som möjligt samtidigt som bildkvaliteten säkerställs (för att minska bakgrundsbruset). När PMT-förstärkningen är högre än 800, eller HyD-förstärkningen är större än 100 %, och ljusstyrkan fortfarande är otillräcklig, kan laserintensiteten ökas på lämpligt sätt, men i princip gäller att ju lägre, desto bättre. - Ställ in det axiella avståndet Z-området och Z-steget, som borras ner från den grundaste sidan av den transparenta organisationen; Det vill säga, ställ in de djupaste och grundaste sidorna.
OBS: Bekräfta klassificeringen och arbetsavståndet för varje lins. Ställ försiktigt in Z-området och använd inte arbetsavståndet som överskrider gränsen för det valda objektivet. "z-Galvo" kan väljas när finreglering behövs. - Ställ in fotograferingsparametrarna igen och börja fotografera. När du är klar kan du sammanfoga och bearbeta bilderna genom den multifunktionella modulen. Förvara och stäng slutligen av instrumentet i den ordning som anges.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll har en musmodell för sagittal suturexpansion etablerats (Figur 1-2). För 3D-visualisering av förändringar i benmodellering efter suturexpansion tillämpades PEGASOS-vävnadsrensningsmetoden på hela kalvarbenen efter expansion. Efter perfusion separerades kalvarben (Figur 3A) och den lämpliga PEGASOS-processen fortsatte (Tabell 1 och Tabell 2). Anmärkningsvärt är att kalvarbenen blev nästan genomskinliga efter hela PEGASOS-processen, oavsett om avkalkning utfördes eller inte (Figur 3B,C).
För att snabbt visualisera förändringarna efter expansion användes μCT på de insamlade och fixerade proverna. I jämförelse med kontrollgruppen (Figur 4A) expanderade den kraniala suturen gradvis och signifikant efter att ha applicerat kraft i 1 dag (Figur 4B). På den femte dagen dök fluffiga benutskott upp på benkanten (Figur 4C).
För tredimensionell visualisering av mineraliseringsjuxtapositionshastigheten i hela suturen efter expansion användes den dubbla märkningsmetoden tillsammans med den effektiva PEGASOS-tekniken, även på icke-avkalkade kalvvariala ben (figur 5). Under fysiologiska förhållanden förekom mindre förändringar mellan signaler från märkning före och efter (Figur 5A), medan kraftbelastning signifikant aktiverade osteogenesen. Sicksackmönstret av nymineraliserat ben, märkt med en enda kalciumgulgrön markör, vidgades efter att ha expanderat i 7 dagar (Figur 5B,C). I högupplöst tredimensionell visualisering indikerade mönsterförändringarna av marginella ben benombyggnadsprocessen efter suturexpansion, och graden av nybildat ben varierade på två sidor av suturerna (Figur 5C).
Dessutom, för att visualisera proliferationshastigheten av celler vid suturexpansion, försökte man med helmonterad EdU-inkorporering med hjälp av PEGASOS-vävnadsrensningsmetoden med en förkalkningsprocess. Märkningen var effektiv och välbevarad i rensade vävnader. I kontrollgruppen var flera EdU+-celler diffust fördelade över suturerna (Figur 6A), vilket kan vara viktigt för fysiologisk benremodellering och möjligen förbises vid 2D-snittning. Efter att ha expanderat under 1 dag nådde de prolifererande cellerna sin topp i mitten och kanterna av suturerna (Figur 6B). När suturen vidgades minskade antalet prolifererande celler med tiden och nådde dag 7 (Figur 6C). De markerade cellerna var små runda celler i benmärgen, vilket tyder på blodceller som skilde sig från suturcellerna i EdU+ (Figur 6C).
Figur 1: Vitala material förbereddes för operation. Retentionshållarna var gjorda av rostfri ståltråd. Deras diameter var 2 mm och 1 mm svansar var reserverade på två sidor (A). Tryckfjädern med 0,2 mm tråddiameter, 1,5 mm ytterdiameter, 1 mm intervallutrymme applicerades (B). Dragkraften detekterades av en dynameter (C,D). Varje 1 mm fjäderkompression erhöll en dragkraft på cirka 30 g (E) i detta experiment. Papperslappar skars ut till drakar med 2 mm diameter för att användas som barriärer (F). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Den kirurgiska processen för suturexpanderande musmodell. Efter att ha vänt på den kalvarianala klaffen gjordes syraetsning (A) samt bindning (B) vid den position där retentionshållarna skulle exponeras. Efter återställning av hårbottenfliken (C) exponerades hållarna vid den markerade positionen (D). En fjäder sattes mellan två hållare för att utöva expansionskraft på den kalvvariala suturen, och två papperslappar fixerades i båda ändarna av fjädern som barriärer (E,F) efter att ha bekräftat att hållarna var ordentligt bundna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: PEGASOS-vävnadsrensningsprocedur tillämpades för två kalvvariala ben med eller utan avkalkning. Efter perfusion separerades kalvarben, med några blodfärgade och mjuka vävnader fästa (A). Kalvbensben som har genomgått avkalkningsprocessen (B) eller med icke-avkalkning (C) var nästan helt genomskinliga efter hela processen med PEGASOS. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Calvariala suturer expanderade gradvis efter utövande av dragkraft. μCT-bilder av sagittal sutur utan kraftbelastning (A) och efter kraftbelastning i 1 dag och 5 dagar (B,C). Skalstapel: 100 μm. Exp = expansion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Osteogenes aktiverad efter suturexpansion i 3D-bilder. (A-C) Tredimensionell visualisering av dubbelmärkta sagittala suturer som rensats med PEGASOS-metoden. Alizarinrött och kalceingrönt injicerades intraperitonealt över natten före expansion och före avlivning efter expansion i 7 dagar (B,C), jämfört med kontrollgruppen utan mekanisk belastning vid samma tidpunkter (A). 5x objektiv användes för att samla in hela suturbilderna effektivt (A, B), och lådbilden i (B) förstorades i (C, C', C'') avbildad med en 10x lins. Skalstapel i A,B: 100 μm, C: 150 μm. Exp = expansion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Suturceller förökade sig kraftigt vid dragkraftsbelastning i 3D-bilder. Inkorporeringsanalyser på hela berget i kombination med PEGASOS-vävnadsrensningsmetoden visade de prolifererande cellerna i hela suturen när de var tysta (A) eller efter kraftbelastning i 1 dag och 7 dagar (B,C). Avbildad med ett 10x objektiv. Strecklinjer konturerar två kanter för sagittala suturer. Skalstapel: 100 μm. Exp = expansion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Processer | Lösningar | Tid & Temperatur |
| 1. Intraperitoneal injektion | 1 mg/10 g EdU | 2 timmar innan avlivning av mössen |
| 2. Perfusion | 0,02 % heparin och 0,05 mol/L EDTA | / |
| 3. Fixering | 4% PFA | O/N, 4 °C |
| 4. Avkalkning | 10% EDTA | 2 dygn, 37 °C |
| 5. Avfärgning | 25% Quadrol | 1 dygn, 37 °C |
| 6. EdU-färgning | märkning cocktail | 1 dag, RT |
| 7. Avfettning | 30% tert-butanol | 2 h, 37 °C |
| 50% tert-butanol | 2 h, 37 °C | |
| 70% tert-butanol | 2 h, 37 °C | |
| 8. Uttorkning | TB-PEG-lösning | 3 h*2, 37 °C |
| 9. Röjning | BB-PEG-lösning | 2 h, 37 °C |
Tabell 1: PEGASOS-vävnadsrensningsprocedur för kalvarben med EdU-färgning.
| Processer | Lösningar | Tid & Temperatur |
| 1. Intraperitoneal injektion | 20 mg/kg Alizarin rött | Övernattning före expansion |
| 2. Intraperitoneal injektion | 5 mg/kg kalcein | Övernattning före upphämtning |
| 3. Perfusion | 0,02 % heparin och 0,05 mol/L EDTA | / |
| 4. Fixering | 4% PFA | O/N, 4 °C |
| 5. Avfärgning | 25% Quadrol | 1 dygn, 37 °C |
Tabell 2: PEGASOS-vävnadsrensningsprocedur för kalvarben med dubbel märkning av mineraliserade ben med kalceingrönt och alizarinrött.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi tillämpade en standardmodell av suturexpansionsmus för att observera de regelbundna morfologiska förändringar som sker varje vecka under hela den månadslånga ombyggnadscykeln10. Denna modell är användbar för att forska om kalvvariell benremodellering och regenerering genom att expandera kalvvariala suturer, samt för att studera olika suturceller in vivo. För att fullt ut presentera resultaten av sådan forskning behövs tredimensionell visualisering av färgade vävnader. Därför kombinerades PEGASOS-tekniken, känd för sin effektivitet när det gäller att rensa hårdvävnad19,20, med dubbel märkning och EdU-färgning för att avslöja utökade mineraliseringshastigheter och prolifererande celler under expansionsprocessen.
När det gäller suturexpansionskirurgi är ett av de viktigaste stegen bindningen av fästringen. För att säkerställa en fast bindning med benytan standardiserade vi syraetsningen och bindningsprocessen i botten av hållarringen. De små öglorna på hållarringen ska vara vinkelräta mot benytan och motsvara små hål i hårbotten. Efter att ha suturerat hårbotten bör de små öglorna exponeras för hudytan genom små hål i ett naturligt och balanserat tillstånd för att undvika att retentionsringen kollapsar under installationen av den kraftapplicerande fjädern och guidetråden, vilket kan leda till att operationen misslyckas. Dessutom är det viktigt att välja en lämplig kraftapplicerande fjäder för en lyckad operation, eftersom det gör det lättare att installera fjädern samtidigt som den förhindrar att låsringen faller av och uppnår den avsedda kraftappliceringen.
Jämfört med tidigare modeller erbjuder denna modell flera fördelar. För det första förhindrar det bildandet av cirkulära bendefekter i parietalbenet och bevarar cellaktiveringsläget. Dessutom kan kraften avlägsnas när som helst genom att demontera fjädern, vilket gör den lämplig för att upprätta en återfallsmodell efter spänningssträckning. Bekvämligheten med att demontera fjädern säkerställer också minimal sekundär skada på försöksdjuren. Dessutom kan den mekaniska storleken på dragspänningen enkelt justeras genom att ändra fjäderkraften. Det är viktigt att denna modell upprätthåller den naturliga fysiologiska miljön runt kranialsuturen, vilket säkerställer noggrannheten i experimentella resultat.
Det finns dock vissa begränsningar för den här expansionsmodellen. För det första finns det en risk för att retentionsringen faller av om kraften är för stor. Nybörjare bör genomföra preliminära övningar i vårinstallationen för att minska denna risk. För det andra finns det en risk för infektion när man öppnar hårbotten och exponerar skallen, så desinfektion av instrument är viktigt, och att förkorta operationstiden är fördelaktigt för läkningen. Överbedövning kan också leda till att möss dör.
När det gäller den passiva PEGASOS-metoden är den tillämplig för att uppnå transparens i enskilda vävnader och organ, såväl som hela huvudet och kroppen hos unga möss. Även om det är effektivt för hela kalvvariala ben, krävs en längre bearbetningstid för större prover, särskilt för hela benvävnader eller bulk långa benvävnader med leder. Det är viktigt att notera att avkalkning av vävnad inte bör utföras när du använder det dubbla märkningsprotokollet, eftersom det stör färgningsprocessen. PEGASOS vävnadsrensningsmetod är också flexibel och möjliggör kombination med olika märkningsmetoder, inte begränsat till EdU-inkorporering eller kalciumdubbelmärkning, utan även endogen fluorescens i transgena musmodeller eller färgning av färgämnen eller antikroppar, allt med välbevarad fluorescens.
Med stabila effekter och hög repeterbarhet är denna suturexpansionsmodell lämplig för olika stammar av transgena möss i olika åldrar. Möjligheten att justera storleken på dragspänningen och dra tillbaka kraften när som helst möjliggör bekväm forskning om återfall efter stressstimulering. Genom att kombinera dubbelmärkningsmetoden för mineraliserade ben med PEGASOS-vävnadsrensningstekniken kan vi observera den tredimensionella spatiotemporala fördelningen av stamceller från kraniala suturer under benombyggnad, vilket möjliggör ytterligare utforskning av förhållandet mellan SUSC och mekanisk stress, såväl som dess specifika mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar för laboratorieplattformen och hjälpen från Ear Institute, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Detta arbete stöddes av Shanghai Pujiang Program (22PJ1409200); Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (nr 11932012); Postdoktoral vetenskaplig forskningsstiftelse vid Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; Finansiering av grundforskningsprogram för Ninth People's Hospital som är anslutet till Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (JYZZ154).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Acid etching | Xihubiom | E10-02/1807011 | |
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A3882 | |
| AUSTRALIAN WIRE | A.J.WILCOCK | 0.014'' | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | B6630 | |
| Calcein green | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Copper(II) sulfate, anhydrous | Sangon Biotech | A603008 | |
| Dynamometer | Sanliang | SF-10N | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EdU | Invitrogen | E104152 | |
| Laser Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| PBS | Sangon Biotech | E607008 | |
| PEG-MMA 500 | Sigma-Aldrich | 447943 | |
| PFA | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pH Meters | Mettler Toledo | S220 | |
| Quadrol | Sigma-Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Sodium bicarbonate | Sangon Biotech | A500873 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | A610476 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Spring | TAOBAO | 0.2*1.5*1*7 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide | Lumiprobe | A1330 | |
| tert-Butanol | Sigma-Aldrich | 360538 | Protect from light. Do not freeze. |
| Transbond MIP Moisture Insensitive Primer |
3M Unitek | 712-025 | |
| Transbond XT Light Cure Adhesive Paste |
3M Unitek | 712-035 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | V900257 | |
| Tris-buffered saline | Sangon Biotech | A500027 |
References
- Opperman, L. A. Cranial sutures as intramembranous bone growth sites. Developmental Dynamics. 219 (4), 472-485 (2000).
- Thenier-Villa, J. L., Sanromán-Álvarez, P., Miranda-Lloret, P., Plaza Ramírez, M. E. Incomplete reossification after craniosynostosis surgery-incidence and analysis of risk factors: a clinical-radiological assessment study. Journal Of Neurosurgery-pediatrics. 22 (2), 120-127 (2018).
- Markiewicz, M. R., Recker, M. J., Reynolds, R. M. Management of sagittal and lambdoid craniosynostosis: open cranial vault expansion and remodeling. Oral And Maxillofacial Surgery Clinics Of North America. 34 (3), 395-419 (2022).
- Mao, J. J., Wang, X., Kopher, R. A. Biomechanics of craniofacial sutures: orthopedic implications. Angle Orthodontist. 73 (2), 128-135 (2003).
- Shayani, A., Sandoval Vidal, P., Garay Carrasco, I., Merino Gerlach, M. Midpalatal suture maturation method for the assessment of maturation before maxillary expansion: a systematic review. Diagnostics (Basel). 12 (11), 2774 (2022).
- Suzuki, H., et al. Miniscrew-assisted rapid palatal expander (MARPE): the quest for pure orthopedic movement. Dental Press Journal Of Orthodontics. 21 (4), 17-23 (2016).
- Yu, M., et al. Cranial suture regeneration mitigates skull and neurocognitive defects in craniosynostosis. Cell. 184 (1), 243-256 (2021).
- Roth, D. M., Souter, K., Graf, D. Craniofacial sutures: Signaling centres integrating mechanosensation, cell signaling, and cell differentiation. European Journal of Cell Biology. 101 (3), 151258 (2022).
- Zhao, H., et al. The suture provides a niche for mesenchymal stem cells of craniofacial bones. Nature Cell Biology. 17 (4), 386-396 (2015).
- Jing, D., et al. Response of Gli1(+) suture stem cells to mechanical force upon suture expansion. Journal of Bone And Mineral Research. 37 (7), 1307-1320 (2022).
- Xu, Y., Malladi, P., Chiou, M., Longaker, M. T. Isolation and characterization of posterofrontal/sagittal suture mesenchymal cells in vitro. Plastic and Reconstructive Surgery. 119 (3), 819-829 (2007).
- Kong, L., et al. Isolation and characterization of human suture mesenchymal stem cells in vitro. International Journal of Stem Cells. 13 (3), 377-385 (2020).
- Ikegame, M., et al. Tensile stress induces bone morphogenetic protein 4 in preosteoblastic and fibroblastic cells, which later differentiate into osteoblasts leading to osteogenesis in the mouse calvariae in organ culture. Journal of Bone And Mineral Research. 16 (1), 24-32 (2001).
- Liu, S. S., Opperman, L. A., Buschang, P. H. Effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 on midsagittal sutural bone formation during expansion. American Journal of Orthodontics And Dentofacialorthopedics. 136 (6), 768-769 (2009).
- Liang, W., Ding, P., Li, G., Lu, E., Zhao, Z. Hydroxyapatite nanoparticles facilitate osteoblast differentiation and bone formation within sagittal suture during expansion in rats. Drug Design Development and Therapy. 15, 905-917 (2021).
- Morinobu, M., et al. Osteopontin expression in osteoblasts and osteocytes during bone formation under mechanical stress in the calvarial suture in vivo. Journal of Bone And Mineral Research. 18 (9), 1706-1715 (2003).
- Hwang, S., Chung, C. J., Choi, Y. J., Kim, T., Kim, K. H. The effect of cetirizine, a histamine 1 receptor antagonist, on bone remodeling after calvarial suture expansion. Korean Journal of Orthodontics. 50 (1), 42-51 (2020).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Jing, D., et al. Tissue clearing and its application to bone and dental tissues. Journal of Dental Research. 98 (6), 621-631 (2019).
- Luo, W., et al. Investigation of postnatal craniofacial bone development with tissue clearing-based three-dimensional imaging. Stem Cells Development. 28 (19), 1310-1321 (2019).
