Summary
Her præsenterer vi en robust metode til in situ perfusion af museleveren for at studere den akutte og direkte regulering af levermetabolisme uden at forstyrre leverarkitekturen, men i fravær af ekstra-hepatiske faktorer.
Abstract
Leveren har mange funktioner, herunder næringsstofmetabolisme. I modsætning til andre in vitro - og in vivo-modeller af leverforskning tillader den isolerede perfunderede lever undersøgelse af leverbiologi og metabolisme i hele leveren med en intakt leverarkitektur, adskilt fra påvirkning af ekstra-hepatiske faktorer. Leverperfusioner blev oprindeligt udviklet til rotter, men metoden er også tilpasset mus. Her beskriver vi en protokol for in situ perfusion af museleveren. Leveren perfuseres antegradely gennem portalvenen med oxygeneret Krebs-Henseleit bicarbonatbuffer, og udgangen opsamles fra den suprahepatiske ringere vena cava med fastspænding af den infrahepatiske ringere vena cava for at lukke kredsløbet. Ved hjælp af denne metode kan de direkte hepatiske virkninger af en testforbindelse evalueres med en detaljeret tidsopløsning. Leverfunktion og levedygtighed er stabile i mindst 3 timer, hvilket gør det muligt at inkludere interne kontroller i samme eksperiment. De eksperimentelle muligheder ved hjælp af denne model er talrige og kan udlede indsigt i leverfysiologi og leversygdomme.
Introduction
Leveren er et vigtigt organ i stofskiftet. Det spiller en central rolle i styringen af hele kroppens energibalance ved at regulere glukose, lipid og aminosyremetabolisme. Stigningen i leversygdomme på verdensplan fremstår som en stor global sundhedsbyrde, og der er behov for mere viden om patofysiologien og dens konsekvenser for leverfunktioner.
Forskellige in vitro-modeller er blevet udviklet til forskning i leveren som supplement til in vivo-undersøgelser. Isolerede og dyrkede primære hepatocytter fra gnavere og mennesker anvendes i vid udstrækning. Ikke-parenkymale celler kan adskilles fra hepatocytter ved anvendelse af differentiel og gradientcentrifugering, og cokulturen af forskellige celletyper er nyttig til undersøgelse af intercellulær krydstale1. Selvom primære humane hepatocytter betragtes som den gyldne standard for test af lægemiddeltoksicitet, har flere undersøgelser vist, at hepatocytterne hurtigt dedifferentieres i vævskultur, hvilket resulterer i tab af leverfunktioner 2,3,4. Hepatocytkultur i et 3D-sfærisk system forbedrer dedifferentieringen, er mere stabil og ser ud til at efterligne leveren in vivo i højere grad end de traditionelle 2D-kultursystemer5. Præcisionskårne leverskiver er en anden veletableret in vitro-model, der holder vævsarkitekturen intakt og indeholder de ikke-parenkymale celler, der er til stede i leveren6. Mere avancerede in vitro modeller omfatter lever-on-a-chip7 og leverorganoider8. Men med alle disse tilgange er der et tab af strukturel integritet og strømningsdynamik, herunder vektorial portal-hepatisk venestrøm, hvilket sandsynligvis påvirker generaliserbarheden.
Den isolerede perfunderede rottelever blev først beskrevet af Claude Bernard i 18559 og bruges stadig inden for forskellige videnskabelige områder til studier af leverbiologi, toksikologi og patofysiologi. Fordele ved den perfunderede lever sammenlignet med de ovennævnte in vitro-modeller inkluderer vedligeholdelse af leverarkitekturen, vaskulær strømning, hepatocytpolaritet og zoneinddeling og interaktionerne mellem hepatocytter og ikke-parenkymale celler. Sammenlignet med in vivo-undersøgelser tillader den perfunderede lever undersøgelse af levermetabolisme på en isoleret måde for at undgå ekstrahepatiske faktorer, der bæres af blodet og med fuldstændig kontrol over de eksperimentelle betingelser. Flere ændringer er blevet foretaget for at forbedre rotteleverperfusionsmodellen gennem årene10,11,12,13. Selvom mus er blevet brugt til isolerede perfunderede leverundersøgelser, er der mindre litteratur tilgængelig. Her præsenterer vi en metode til in situ perfusion af museleveren ved kanylering af portalvenen og den suprahepatiske vena cava ringere til at studere de akutte og direkte metaboliske reaktioner på metaboliske substrater og hormoner målt i det hepatiske venøse udløb fra museleveren i realtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg er udført med tilladelse fra Dyreforsøgstilsynet, Miljø- og Fødevareministeriet (tilladelse 2018-15-0201-01397) og den lokale etiske komité i overensstemmelse med EU-direktivet 2010/63/EU, National Institutes of Health (publikation nr. 85-3) og efter retningslinjerne i dansk lovgivning om dyreforsøg (1987). Dette er en terminal procedure, og dødsårsagen er ekssanguination og perforering af membranen under dyb anæstesi.
1. Forsøgsdyr
- Få mus af ønsket stamme, alder og køn. Denne undersøgelse anvendte C57BL/6JRj-hanmus i alderen 11-16 uger. Huser op til 5 han- eller 8 hunmus pr. bur med ad libitum-adgang til chow og vand, og oprethold en 12 t/12 timers lys-mørk cyklus med lys tændt fra kl. 6 til 18.
2. Præoperative præparater
- Lav leverperfusionsbuffer.
- Krebs-Henseleit Buffer. 118 mmol/l NaCl, 4,7 mmol/l KCl, 1,2 mmol/lMgSO4 og 1,2 mmol/l KH 2 PO4 blandes og opløses i dH2O. 1,25 mmol/lCaCl2 opløses i et separat bægerglas og bufferen tilsættes.
- 25 mmol/l NaHCO3 opløses og tilsættes langsomt til bufferen under omrøring. Opbevar bufferen ved 4 grader. Bufferen er stabil i mindst 1 måned.
BEMÆRK: Udfældning kan forekomme, hvisCaCl2 og NaHCO3 ikke opløses enkeltvis, før de tilsættes.
- Perfusionsbufferen filtreres gennem et 2 μm filter, og pH justeres til 7,5 ved hjælp af HCI.
BEMÆRK: Dette trin skal udføres på forsøgsdagen, da pH stiger over tid, selv når det opbevares i lukkede kolber. - Testpræparater fremstilles i en højere koncentration end den ønskede slutkoncentration (f.eks. 20x koncentration ved infusion med en hastighed på 0,175 ml/min via en sidearmspumpe) i filtreret og pH-justeret Krebs-Henseleit perfusionsbuffer. Hvis det er relevant, fortyndes teststoffer i Krebs-Henseleit perfusionsbuffer med 1 % BSA tilsat som bærestof (for at undgå vedhæftning til slanger og glasvarer, der er afgørende for alle peptider), filtreres gennem et filter af passende størrelse.
3. Drift og perfusion
BEMÆRK: En illustration af den perfusionsopsætning, der blev brugt i denne undersøgelse, findes i figur 1.
- Perfusionsbufferen (95 %O2, 5 % CO2) gasses i mindst 30 minutter for at tilføre leveren tilstrækkelig ilt og opretholde den korrekte pH fra operationens start (bikarbonatbuffersystemet vil nå en pH-værdi på 7,4 ved kontinuerlig gasning, se supplerende figur 1).
- Bedøv en mus ved at administrere ketamin (90 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) ved intraperitoneal injektion.
- Placer musen liggende på et opvarmet operationsbord og bekræft manglen på reflekser som reaktion på tåklemmen. Spray med 70% ethanol for at forhindre hår i at klæbe til saksen. Fastgørelse af musen til den varme overflade hjælper med at øge stabiliteten for følgende procedurer.
- Lav et snit med en saks i bunden af maven og skær opad til brystkassen på begge sider for at udsætte bukhulen. Flyt tarmene til højre ved hjælp af en vatpind, der udsætter portalvenen.
- Placer to ligaturer under portalvenen ved hjælp af buede tang og forbered en løs knude for hver ligatur.
- Indsæt et 0,7 mm kateter i portalvenen. Når det er perforeret, fjernes nålen fra kateteret, og kateteret føres gennem venen, indtil spidsen af kateteret er tæt på leveren, som vist i figur 2. Blod strømmer ind i kateteret.
- Stram ligaturerne. Hvis kateteret ikke er fyldt med blod, skal du fylde det op med perfusionsbuffer for at undgå introduktion af en luftboble.
- Perfusionsrøret sættes på, og leveren sættes i gang med Krebs-Henseleit bicarbonatbuffer ved 37 °C ved at starte rullepumpen med en perfusionsstrømningshastighed på 0,8 ml/min. Leveren bliver bleg inden for få sekunder.
- Skær brystkassen og membranen ved hjælp af en saks. På dette tidspunkt aflives dyret. Placer en ligatur under den suprahepatiske ringere vena cava ved hjælp af fine punktpincet. Placer en pen, rullet gaze eller en anden engangsgenstand under bagsiden af musen for at gøre venen mere tilgængelig.
- Indsæt et kateter i den suprahepatiske ringere vena cava via hjertets højre atrium. Når det er perforeret, skal nålen fjernes fra kateteret og føres kateteret gennem venen, indtil spidsen af kateteret er tæt på leveren. Blod- og perfusionsbuffer løber straks tør.
- Stram ligaturen og fastgør et rør til opsamling af perfusionsspildevand. Fastgør alle rør med vandtæt tape (slank tape eller lignende).
- Brug en beholderklemmeadapter til at placere en beholderklemme over den infrahepatiske vena cava umiddelbart over højre nyrevene for at forhindre blanding (figur 2).
- Forøg perfusionsstrømningshastigheden til 3,5 ml / min, og start en timer. Start trykoptagelsen. Vellykket perfusion resulterer normalt i et tryk på ~ 10 mm / Hg.
- Dæk leveren med en steril drapering fugtet med saltvand og tilsæt saltvand under eksperimentet for at forhindre det i at tørre.
- Opsaml perfusionsspildevandet i 1 min, og mål volumenet. Volumen skal være ca. 3,5 ml/min. Blanding af blod forventes ikke på dette stadium, og hjertet pumper ikke længere.
- Vent i en ligevægtsperiode på 30 minutter, før du starter eksperimentet.
Figur 1: En illustration af perfusionsopsætningen . (A)Operationsbordet hæves på et stativstativ og opvarmes til 37 °C. Perfusionsbufferen gasses (95%O2, 5% CO2), pumpes via en peristaltisk rullepumpe og opvarmes i varmeveksleren med en indbygget boblefælde. Systemet består desuden af en manometer og spindelpumpe til justering af perfusionstrykket. Perfusionstrykket registreres og visualiseres kontinuerligt via en transducer på en pc, et trykoptagelsesprogram. (B) Den røde boks fanger forbindelserne mellem trevejs stophaner. Den første trevejs stophane er åben for infusion af en testforbindelse via en sprøjtepumpe, og den anden er lukket. Den tredje er åben for kontinuerlige trykmålinger. Den fjerde stophane kan anvendes til at indsamle inputprøver, f.eks. gasanalyse over den perfunderede lever. Konnektorerne kan ændres efter behov til specifikke forsøg, der kræver flere eller færre infusionsslanger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Billeder af musens bughule før og under leverperfusion. (A)Den grønne prik angiver placeringen af spidsen af portalvenekateteret. Det er vigtigt, at spidsen af kateteret er placeret lige under portalvenens forgreningspunkt i venstre og højre hepatiske portalvener, men over pancreato-duodenalgrenen for at undgå lækage. Den gule prik angiver den korrekte placering af beholderklemmen på den infrahepatiske ringere vena cava mellem højre nyrevene og leveren for at undgå tilbagestrømning af blod til den perfunderede lever. (B, C) En perfuseret muselever med de to katetre indsat i portalvenen (B) og suprahepatisk ringere vena cava (C) og beholderklemmen på den infrahepatiske ringere vena cava (B). Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Eksperiment
- Start eksperimentet ved at indsamle de første baselineprøver ved hjælp af en fraktionssamler i slutningen af ligevægtsperioden. Saml prøver med det ønskede tidsinterval og læg dem straks på is.
- Kontroller boblefælden regelmæssigt, og genopfyld med perfusionsbuffer, når den er tæt på tom.
- Saml en prøve af bufferen gennem en trevejs stophane umiddelbart før den kommer ind i organet og fra opsamlingskateteret indsat i den ringere vena cava (efter at den er blevet perfuseret gennem leveren).
- Mål prøverne med en blodgasanalysator for at bekræfte, at organet er metabolisk aktivt (indikeret ved en stigning i partialtrykket af CO2 og et fald i pH).
- Gentag trin 4.3-4.4 ved forsøgets afslutning for at vurdere levedygtigheden under hele eksperimentet (supplerende figur 2).
BEMÆRK: Faldet i iltpartialtryk giver ikke et pålideligt mål for åndedræt på grund af tab af ilt fra slanger, organet osv. - Efter 15 minutters perfusion ved baseline startes den første stimulation ved at infundere et teststof gennem en trevejs stophane ved hjælp af en sprøjtepumpe (f.eks. 20x koncentrationen af teststoffet, når det infunderes med en hastighed på 0,175 ml/min via en sidearmspumpe). Alternativt skiftes baselinebufferen til en ny buffer (iltet og opvarmet), der indeholder teststoffet i den endelige koncentration.
- Stop stimuleringen og saml baseline prøver i 20-30 minutter, før du starter den anden stimulering.
- Ved afslutningen af eksperimentet tilsættes en passende positiv kontrol i 5-10 min.
- Efter eksperimentet punktafgifter den perfunderede lever og vejer den for at normalisere output til levervægt. Snap-frys leveren i flydende nitrogen til potentiel måling af proteinindhold for at normalisere output til proteinindhold.
5. Biokemiske målinger
- Kvantificer koncentrationen af det pågældende molekyle ved hjælp af assays, der er egnede til målinger i perfusionsbuffer (interne eller kommercielt tilgængelige kolorimetriske eller ELISA-assays). Bufferen er kompatibel med de fleste omics-baserede teknikker såsom metabolomics og proteomics.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev urinstof målt baseret på et kolorimetrisk assay tidligere beskrevet14. Glucose og ikke-esterificerede fedtsyrer blev kvantificeret ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits.
6. Analyse af data
- Præsenter dataene i XY-grafer, der viser sekretorisk output over tid.
BEMÆRK: Det er en af fordelene ved in vitro perfusionssystemet, at det er muligt at udtrykke data som det faktiske output (koncentration × strømningshastighed, f.eks. μmol/min) i stedet for den målte koncentration i output (mmol/L) som i in vivo-undersøgelser . Overvej at normalisere outputtet til levervægten, når du sammenligner forskellige musemodeller eller til det samlede proteinindhold (målt ved BCA), når du sammenligner kontrolmus med musemodeller med fedme eller leversygdomme, hvor en stigning i levervægt kan skyldes øget fedtindhold. - Præsenter sammenfattende data som individuelle prikker pr. dyr, der repræsenterer den gennemsnitlige eller samlede produktion i baseline og over en stimuleringsperiode (typisk 15-30 min) eller inkrementel output ved hjælp af den foregående baseline for hver stimuleringsperiode afhængigt af undersøgelsesdesignet.
- Analyser dataene ved hjælp af parret t-test (to grupper) eller envejs ANOVA med gentagne stimuleringer (mere end to grupper) med en passende post-hoc test til flere test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En stabil baseline er nødvendig for at bestemme, om en stimulus eller substrat fører til frigivelse af molekylet af interesse. Figur 3A viser et eksempel på et vellykket eksperiment. Produktionen af urinstof i den perfunderede lever måles i intervaller på 2 minutter og vises som gennemsnit ± SEM. Baselineperioderne forud for hver af de to stimuleringsperioder er stabile. Den gennemsnitlige urinstofproduktion i de to stimuleringsperioder og de respektive foregående basislinjer er vist i figur 3B. Statistisk signifikans mellem perioderne blev testet ved hjælp af envejs ANOVA med gentagne målinger. Baseret på disse resultater kan det konkluderes, at urinstofresponset på to på hinanden følgende stimuleringer med blandede aminosyrer er ens, hvilket er et vigtigt kontroleksperiment ved evaluering af gentagne stimuleringer med forskellige doser eller testforbindelser.
Ud over ureagenese er det muligt at studere hepatisk glycogenolyse og lipolyse ved hjælp af ovenstående protokol. Figur 3C-F viser data fra et separat forsøg under en infusion med glukagon. Frigivelsen af glukose (figur 3C) og de ikke-esterificerede fedtsyrer (NEFA) (figur 3E) blev målt i perioder på 4 minutter. Der observeres en stabil basal frigivelse af glucose (figur 3C) og NEFA (figur 3E) forud for en robust stigning i glucose og NEFA under glukagoninfusionen. Baseret på middelværdierne ved basaltilstanden og under glukagoninfusionen kan det konkluderes, at glucagon hurtigt stimulerer hepatisk glykogenolyse (figur 3D) og lipolyse (figur 3F).
Figur 4 viser et eksempel på tilsyneladende mislykkede forsøg. Den basale frigivelse af urinstof er ustabil, og stimuleringsperioderne er for tæt på hinanden til, at urinstofproduktionen kan vende tilbage til basale niveauer, før den næste stimulering begynder. Uden stabile basale perioder er det ikke muligt at skelne et urinstofrespons fra det næste. Ud fra disse data er det umuligt at konkludere, om forskellige glukosekoncentrationer påvirker aminosyreinduceret ureagese i den perfunderede muselever. Eksperimentelle protokoller bør i stedet designes med 20-30 minutters baselineperioder mellem to på hinanden følgende stimuleringer for at nå en stabil baseline før hver stimuleringsperiode.
Figur 3: Data af god kvalitet fra den perfunderede muselever. (A,B) Urea total vises under basale forhold og som reaktion på perioder med administration af blandede aminosyrer (10 mM) og glucose (6 mM). Data præsenteres som (A) middelværdier ± SEM og (B) middelværdier under hver stimulering og foregående basalperiode (hver prik repræsenterer en mus), n = 6. (C, D) Glucose og (E,F) ikke-esterificerede frie fedtsyrer (NEFA) samlede output vises under basale forhold og respons på administration af glucagon (10 nM). Data præsenteres som (C,E) middelværdier ± SEM og (D,F) middelværdier i basal- og stimuleringsperioden (hver prik repræsenterer en mus), n = 6. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Data af dårlig kvalitet fra den perfunderede muselever. Urea total output vises under basale forhold som reaktion på blandede aminosyrer (10 mM) og faldende koncentrationer af glucose (18 mM, 12 mM, 6 mM, 3 mM og 0 mM). Data præsenteres som gennemsnit ± SEM, n = 3. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Tidsafhængigt partialtryk af ilt og kuldioxid og pH i Krebs-Henseleit bicarbonatbuffer under gasning med 95% O2 + 5% CO2. A) partialtryk af oxygen, B) kuldioxid og C) pH i prøver af Krebs-Henseleit perfusionsbuffer (pH ikke justeret før forsøget) indsamlet efter gennemløb gennem perfusionssystemet på angivne tidspunkter efter påbegyndelse af gasningen med 95%O2 + 5% CO2. Perfusionsbufferprøver blev målt med en blodgasanalysator. Klik her for at downloade denne figur.
Supplerende figur 2: Ændringer i partialtrykket af ilt og kuldioxid og pH over den perfunderede lever. (A) Partialtryk af ilt, (B) kuldioxid og (C) pH i prøver af Krebs-Henseleit perfusionsbuffer indsamlet umiddelbart før de når leveren og efter at den perfunderede lever er passeret 1 min og 180 min i et forsøg. Perfusionsprøver blev målt med en blodgasanalysator. Data vises som gennemsnit ± SD. **P < 0,01, ****P < 0,0001 ved multiple parrede t-tests korrigeret for flere test ved hjælp af Holm-Sidak-metoden. n = 14. Klik her for at downloade denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den isolerede perfunderede muselever er et stærkt forskningsværktøj til studier af dynamikken og molekylære mekanismer i levermetabolismen. Muligheden for minut-til-minut prøveindsamling giver en detaljeret evaluering af den direkte virkning af en testforbindelse på leveren. Sammenlignet med in vivo-undersøgelser giver den perfunderede lever os mulighed for at studere levermetabolisme på en isoleret måde og undgå ekstra-hepatiske faktorer, der bæres af blodet og med fuldstændig kontrol over de eksperimentelle forhold. Fordelene ved leverperfusion sammenlignet med in vitro-studier med isolerede hepatocytter er vedligeholdelsen af leverarkitekturen, polaritet, zonedeling og vaskulær integritet. En anden fordel ved leverperfusion er det store prøvestørrelsesvolumen (3,5 ml / min), hvilket muliggør måling af flere resultater i den samme prøve. Den perfunderede lever er imidlertid ikke ideel, når man studerer virkninger, der er afhængige af transkriptionel regulering, da sådanne mekanismer kan tage flere timer at forekomme. Ud over metabolisk forskning kan protokollen anvendes på andre forskningsområder til at studere leverens endokrine funktioner (sekretion af hormoner og hepatokiner) og levermetabolisme af lægemidler og xenobiotika.
Det mest kritiske trin for denne metode er placeringen af kateteret i portalvenen. Det er vigtigt, at spidsen af kateteret er placeret umiddelbart før portalvenens grenpunkt i venstre og højre leverportalvener (figur 2). Hvis spidsen af kateteret skubbes for langt, vil kun en del af leveren blive korrekt perfuseret. Hvis den placeres for langt nede i portalvenen, kan der forekomme lækage gennem pancreato-duodenalgrenen. Placering af det andet kateter til opsamling er mindre presserende, da leveren på dette trin allerede er perfuseret med den iltede buffer. Når operationen er udført med succes, vil leveren respirere og reagere i mindst 3 timer med et konstant tryk og perfusionsoutput (supplerende figur 2). På dette stadium er undgåelse af luftbobler i perfusionssystemet den vigtigste faktor for et vellykket eksperiment. Luftbobler er vanskelige at undgå helt, da bufferen kontinuerligt gasses med ilt, men boblerne skal fanges i boblefælden i perfusionssystemet. Det er derfor vigtigt at holde øje med boblefælden og fylde den op med perfusionsbuffer, når den er tæt på tom.
Krebs-Henseleit buffer (KHB) er den mest anvendte løsning til leverperfusioner13. Den klassiske formulering indeholder 2,5 mmol/L CaCl2, men baseret på en tidligere undersøgelse, der viser, at calcium bidrager til mitokondrieskader, bruger vi en buffer med kun 1,25 mmol/L CaCl212. Tilsætningen af erythrocytter, albumin eller glucose til bufferen er ikke nødvendig11. Den foreslåede buffer tillader også molekylær profilering ved hjælp af avancerede biokemiske teknikker såsom massespektrometribaserede metabolomics. Forskellige koncentrationer af et teststof kan testes for at bestemme den optimale dosis og for at evaluere fysiologiske vs. farmakologiske virkninger. I forsøgene udført i denne undersøgelse er 10 mM AA i det høje fysiologiske område svarende til postprandial niveauer, mens 10 nM glucagon svarer til en farmakologisk dosis. Som vist i figur 4 er det vigtigt at inkludere 20-30 minutters baselineperiode mellem to på hinanden følgende stimuleringer for at kunne sammenligne dynamikken og molekylære mekanismer i de respektive responser.
Det er vigtigt at undgå blod i perfusatprøverne, da det kan forstyrre de efterfølgende analyser, f.eks. kolorimetrisk bestemmelse af urinstof- og glucosekoncentrationer. Hvis der vises blod i de indsamlede prøver efter ~ 15 minutter i ligevægtsperioden, når en 3-vejs ventil åbnes for infusioner, eller når boblefælden er fyldt, er beholderklemmen på den infrahepatiske vena cava sandsynligvis ikke placeret korrekt.
Det er vores erfaring, at en vellykket operation resulterer i et stabilt portaltryk på ~10 mmHg og en udgangsstrømningshastighed på 3,5 ml/min inden for få minutter efter indsættelse af opsamlingskateteret. Hvis trykket er betydeligt højere eller kontinuerligt stigende, eller hvis den opsamlede udgangsstrømningshastighed ikke er 3,5 ml / min eller kontinuerligt falder, skal flere begivenheder overvejes: 1) Er alle leverlobes lige perfuserede og viser en ensartet lys farve? Hvis ikke, kan der være opstået en okklusion (ofte en luftboble; forsigtigt "massere" leverloben med en vatpind; dette hjælper undertiden med at frigøre luftboblen, hvorved trykket falder med det samme), eller portalvenekateteret er blevet skubbet for langt op og leverer således kun en af de to grene af leverportalvenen (prøv forsigtigt at trække kateteret et par millimeter tilbage). 2) Er den suprahepatiske ringere vena cava snoet? Dette kan forekomme, når den mandlige del af opsamlingsrøret fastgøres til den kvindelige del af kateteret, der er indsat i venen; Fjern forsigtigt opsamlingsrøret og observer, om trykket falder. 3) Er opsamlingskateteret skubbet for langt ned i den suprahepatiske ringere vena cava, så spidsen af kateteret er kilet ind i leveren? Træk forsigtigt et par millimeter tilbage, hvis det er nødvendigt.
Sammenfattende er den perfunderede muselever en fysiologisk relevant in vitro eksperimentel model, der kan bruges til at studere de dynamiske virkninger af en given forbindelse på leveren. Kvaliteten af operationen er afgørende for kvaliteten af de opnåede data, og efter vores erfaring tager det ~ 2 måneders træning, før data af tilfredsstillende kvalitet kan forventes. Når teknikken er lært, er mulighederne med denne metode mange, herunder brugen af transgene eller knockout donordyr vedrørende gener af interesse samt musemodeller af leversygdomme. Forsøg kan dog være begrænset af potentielle toksiske bivirkninger (som sandsynligvis vil være meget mere alvorlige in vivo) eller dårlig opløselighed af testforbindelser. Sådanne forbindelser kan indgives oralt til donordyrene på et passende tidspunkt inden perfusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter, der er relevante for denne artikel.
Acknowledgments
Studierne og Nicolai J. Wewer Albrechtsen er støttet af Novo Nordisk Foundation Excellence Emerging Investigator Grant - Endocrinology and Metabolism (ansøgningsnr. NNF19OC0055001), European Foundation for the Study of Diabetes Future Leader Award (NNF21SA0072746) og Danmarks Frie Forskningsfond, Sapere Aude (1052-00003B). Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research er støttet økonomisk af Novo Nordisk Fonden (bevillingsaftale NNF14CC0001). Figur 1B blev oprettet med biorender.com. Vi takker Dr. Rune E. Kuhre (Novo Nordisk A/S) for frugtbare diskussioner om den perfunderede muselever.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-way stopcock | BD | 394601 | |
| Altromin breeding diet | Altromin Spezialfutter | 1319 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma | C8106 | |
| Catheters (0.7 mm) | BD | 381812 | |
| Filter paper (pore size 2.0 µm) | Millipore | AP2029325 | |
| Glucose kit | QuantiChromTM | DIGL-100 | Low concentration protocol |
| Ketamine | MSD Animal Health | 511485 | 90 mg/kg |
| Ligature (black sterile silk) | Agnthos | 14739 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | 230391 | |
| Non-esterified fatty acids kit | Fujifilm Wako Chemicals | NEFA-HR(2) | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate(KH2PO4) | Merck | 1.04877 | |
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Sleek tape | Mediq danmark | 4001910 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | |
| Thermostatic Circulator | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | Bath Volume 3 L, 230 V/50 Hz |
| Tubing | Tygon | E3603 | Inner diameter 1.59 mm, outer diameter 3.18 mm |
| Universal perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | Basic unit uniper UP-100, type 834 |
| Vamin | Fresenius Kabi | B05ABA01 | Mixed amino acids |
| Vessel clamp adaptor | Deutsche Biomedical | DBC1002 | |
| Vessel clamps | Deutsche Biomedical | DBC1005 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Xylazine | Rompun Vet | 530701 | 10 mg/kg |
References
- Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response. Scientific Reports. 6, 25329 (2016).
- Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
- Seirup, M., et al. Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro. Genomics. 114 (3), 110330 (2022).
- Gupta, R., et al. Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq. Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137 (2021).
- Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX. Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
- Bartošek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. Isolated Liver Perfusion and its Applications. , Raven Press. New York. (1973).
- Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations. Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).
- Mischinger, H. J., et al. An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates. Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).
- Vairetti, M., et al. Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2. Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).
- Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).
- Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -G. Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium. Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).
