灌流マウス肝臓モデルを用いた肝臓のグルコース産生、尿素生成、脂肪分解の定量化
Summary
ここでは、肝臓の構造を乱すことなく、肝外因子がない場合に、肝代謝の急性および直接的な調節を研究するためのマウス肝臓の in situ 灌流のための堅牢な方法を提示します。
Abstract
肝臓には、栄養代謝など多くの機能があります。肝臓研究の他の in vitro および in vivo モデルとは対照的に、単離された灌流肝臓は、肝外因子の影響から分離された、無傷の肝構造を持つ肝臓全体の肝臓生物学および代謝の研究を可能にします。肝灌流法はもともとラット用に開発されましたが、この方法はマウスにも適応されています。ここでは、マウス肝臓の in situ 灌流のプロトコルについて説明します。肝臓は、酸素化されたKrebs-Henseleit重炭酸緩衝液で門脈から順行性に灌流され、出力は肝下下大静脈から収集され、肝下下大静脈をクランプして回路を閉じます。この方法を使用すると、試験化合物の直接的な肝臓への影響を詳細な時間分解能で評価できます。肝機能と生存率は少なくとも3時間安定しており、同じ実験に内部コントロールを含めることができます。このモデルを用いた実験の可能性は数多くあり、肝生理学や肝疾患に関する洞察を推測できる可能性があります。
Introduction
肝臓は代謝に欠かせない器官です。グルコース、脂質、アミノ酸の代謝を調節することにより、全身のエネルギーバランスの制御に重要な役割を果たします。世界的な肝疾患の増加は、世界的な健康上の大きな負担として浮上しており、病態生理学と肝機能への影響についてより多くの知識が必要です。
in vivo研究を補完するために、肝臓の研究のためにさまざまなin vitroモデルが開発されています。げっ歯類やヒトから単離・培養した初代肝細胞が広く用いられています。非実質細胞は、差動遠心分離およびグラジエント遠心分離を使用して肝細胞から分離することができ、異なる細胞種の共培養は細胞間クロストークの研究に有用です1。初代ヒト肝細胞は薬物毒性試験のゴールデンスタンダードと考えられていますが、いくつかの研究により、肝細胞は組織培養で急速に脱分化し、肝機能が失われることが示されています2,3,4。3Dスフェロイド系での肝細胞培養は、脱分化を改善し、より安定しており、従来の2D培養系よりもin vivoで肝臓を高度に模倣しているようです5。精密に切断された肝臓スライスは、組織構造を無傷に保ち、肝臓に存在する非実質細胞を含む、もう1つの確立されたin vitroモデルである6。より高度なin vitroモデルには、肝臓チップ7および肝臓オルガノイド8が含まれます。しかし、これらすべてのアプローチでは、ベクトル的な門脈-肝静脈の流れを含む構造的完全性と流れのダイナミクスが失われ、一般化可能性に影響を与える可能性があります。
単離された灌流ラット肝臓は、18559年にクロード・ベルナールによって最初に記述され、肝臓生物学、毒物学、および病態生理学の研究のためにさまざまな科学分野で現在でも使用されています。上記のin vitroモデルと比較した灌流肝臓の利点には、肝構造の維持、血管の流れ、肝細胞の極性とゾーネーション、および肝細胞と非実質細胞間の相互作用が含まれます。in vivo研究と比較して、灌流肝臓は、血液によって運ばれる肝外因子を回避し、実験条件を完全に制御しながら、肝臓代謝を単独で研究することを可能にします。何年にもわたってラット肝灌流モデルを改善するためにいくつかの変更が加えられました10,11,12,13。単離された灌流肝研究にはマウスが用いられているが、文献は少ない。ここでは、マウス肝臓からの肝静脈流出液中の代謝基質およびホルモンに対する急性および直接的な代謝応答をリアルタイムで測定するために、門脈と下肝大静脈下大静脈のカニューレ挿入によるマウス肝臓のin situ灌流の方法を紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
単離された灌流マウス肝臓は、肝代謝の動態と分子メカニズムを研究するための強力な研究ツールです。分単位のサンプル収集が可能であるため、試験化合物が肝臓に及ぼす直接的な影響を詳細に評価できます。 in vivo研究と比較して、灌流肝臓は、血液によって運ばれる肝外因子を回避し、実験条件を完全に制御しながら、肝臓代謝を単独で研究することを可能にします。単離され?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究とNicolai J. Wewer Albrechtsenは、ノボ ノルディスク財団のExcellence Emerging Investigator Grant – Endocrinology and Metabolism(申請番号.NNF19OC0055001)、European Foundation for the Study of Diabetes Future Leader Award(NNF21SA0072746)、Independent Research Fund Denmark、Sapere Aude(1052-00003B)を受賞しました。ノボ ノルディスク財団 Center for Protein Researchは、ノボ ノルディスク財団(助成金契約NNF14CC0001)の財政的支援を受けています。図 1B は biorender.com で作成されました。Dr. Rune E. Kuhre(Novo Nordisk A/S)には、灌流マウス肝臓に関する実りある議論をいただき、感謝いたします。
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