Summary
Her presenterer vi en robust metode for in situ perfusjon av museleveren for å studere akutt og direkte regulering av levermetabolisme uten å forstyrre leverarkitekturen, men i fravær av ekstrahepatiske faktorer.
Abstract
Leveren har mange funksjoner, inkludert næringsstoffskifte. I motsetning til andre in vitro og in vivo modeller av leverforskning, tillater den isolerte perfuserte leveren studiet av leverbiologi og metabolisme i hele leveren med en intakt leverarkitektur, skilt fra påvirkning av ekstrahepatiske faktorer. Leverperfusjoner ble opprinnelig utviklet for rotter, men metoden er også tilpasset mus. Her beskriver vi en protokoll for in situ perfusjon av museleveren. Leveren perfuseres antegradely gjennom portalvenen med oksygenert Krebs-Henseleit bikarbonatbuffer, og utgangen samles fra den suprahepatiske vena cava inferior med klemming av den infrahepatiske dårligere vena cava for å lukke kretsen. Ved hjelp av denne metoden kan de direkte levereffektene av en testforbindelse evalueres med en detaljert tidsoppløsning. Leverfunksjon og levedyktighet er stabil i minst 3 timer, noe som gjør det mulig å inkludere interne kontroller i samme eksperiment. De eksperimentelle mulighetene ved hjelp av denne modellen er mange og kan utlede innsikt i leverfysiologi og leversykdommer.
Introduction
Leveren er et viktig organ i stoffskiftet. Det spiller en nøkkelrolle i kontrollen av energibalansen i hele kroppen ved å regulere glukose-, lipid- og aminosyremetabolismen. Økningen i leversykdommer over hele verden fremstår som en stor global helsebyrde, og det er behov for mer kunnskap om patofysiologien og dens konsekvenser for leverfunksjoner.
Ulike in vitro-modeller er utviklet for forskning på leveren for å komplementere in vivo-studier. Isolerte og dyrkede primære hepatocytter fra gnagere og mennesker er mye brukt. Ikke-parenkymale celler kan separeres fra hepatocytter ved hjelp av differensial- og gradientsentrifugering, og samkulturen av forskjellige celletyper er nyttig for å studere intercellulær crosstalk1. Selv om primære humane hepatocytter regnes som den gyldne standarden for testing av legemiddeltoksisitet, har flere studier vist at hepatocytter raskt dedifferensierer i vevskultur, noe som resulterer i tap av leverfunksjoner 2,3,4. Hepatocytkultur i et 3D-sfæroidsystem forbedrer dedifferensieringen, er mer stabil og ser ut til å etterligne leveren in vivo i høyere grad enn de tradisjonelle 2D-kultursystemene5. Presisjonskårne leverskiver er en annen veletablert in vitro-modell som holder vevsarkitekturen intakt og inneholder de ikke-parenkymale cellene som er tilstede i leveren6. Mer avanserte in vitro-modeller inkluderer lever-on-a-chip7 og leverorganoider8. Men med alle disse tilnærmingene er det et tap av strukturell integritet og strømningsdynamikk, inkludert vektoriell portal-hepatisk venestrøm, noe som sannsynligvis påvirker generaliserbarheten.
Den isolerte perfuserte rottelever ble først beskrevet av Claude Bernard i 18559, og brukes fortsatt i ulike vitenskapelige felt for studier av leverbiologi, toksikologi og patofysiologi. Fordeler med den perfuserte leveren sammenlignet med de ovennevnte in vitro-modellene inkluderer vedlikehold av leverarkitekturen, vaskulær strømning, hepatocytpolariteten og sonering, og interaksjonene mellom hepatocytter og ikke-parenkymale celler. Sammenlignet med in vivo-studier, tillater den perfuserte leveren studier av levermetabolisme på en isolert måte, unngår ekstrahepatiske faktorer som bæres av blodet og med full kontroll over eksperimentelle forhold. Flere modifikasjoner har blitt gjort for å forbedre rotteleverperfusjonsmodellen gjennom årene10,11,12,13. Selv om mus har blitt brukt til isolerte perfuserte leverstudier, er mindre litteratur tilgjengelig. Her presenterer vi en metode for in situ perfusjon av museleveren ved kanylering av portalvenen og den suprahepatiske vena cava inferior for å studere de akutte og direkte metabolske responsene på metabolske substrater og hormoner målt i levervenøst avløp fra museleveren i sanntid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført med tillatelse fra det danske dyreforsøksinspektoratet, Miljø- og matministeriet i Danmark (tillatelse 2018-15-0201-01397), og den lokale etiske komiteen i samsvar med EU-direktiv 2010/63 / EU, National Institutes of Health (publikasjon nr. 85-3) og etter retningslinjene i dansk lovgivning for dyreforsøk (1987). Dette er en terminal prosedyre, og dødsårsaken er ekssanguinering og perforering av membranen under dyp anestesi.
1. Forsøksdyr
- Få tak i mus med ønsket stamme, alder og kjønn. Denne studien brukte mannlige C57BL/6JRj-mus i alderen 11-16 uker. Hus opptil 5 mannlige eller 8 kvinnelige mus per bur med ad libitum tilgang til chow og vann og opprettholde en 12 h / 12 h lys-mørk syklus med lys på fra 6 AM til 6 PM.
2. Preoperative preparater
- Lag leverperfusjonsbuffer.
- Krebs-Henseleit Buffer. Bland og løs opp 118 mmol/l NaCl, 4,7 mmol/l KCl, 1,2 mmol/l MgSO 4 og 1,2 mmol/l KH 2 PO4 i dH 2 O. Løs opp 1,25 mmol/l CaCl2i et separat beger og tilsett bufferen.
- Løs opp 25 mmol/l NaHCO3 og tilsett bufferen langsomt under omrøring. Oppbevar bufferen ved 4 grader. Bufferen er stabil i minst 1 måned.
MERK: Utfelling kan forekomme hvis CaCl2 og NaHCO3 ikke oppløses hver for seg før de tilsettes.
- Filtrer perfusjonsbufferen gjennom et 2 μm filter og juster pH til 7,5 ved bruk av HCl.
MERK: Dette trinnet bør utføres på eksperimentell dag, da pH øker over tid, selv når den oppbevares i lukkede kolber. - Forbered testforbindelser i en høyere konsentrasjon enn ønsket sluttkonsentrasjon (f.eks. 20x konsentrasjon når de infunderes med en hastighet på 0,175 ml / min via en sidearmspumpe) i filtrert og pH-justert Krebs-Henseleit perfusjonsbuffer. Hvis relevant, fortynne testforbindelser i Krebs-Henseleit perfusjonsbuffer med 1% BSA tilsatt som bærer (for å unngå vedheft til rør og glassvarer, avgjørende for alle peptider), filtrert gjennom et passende størrelsesfilter.
3. Drift og perfusjon
MERK: En illustrasjon av perfusjonsoppsettet som ble brukt i denne studien er gitt i figur 1.
- Gass perfusjonsbufferen (95%O2, 5% CO2) i minst 30 minutter for å levere tilstrekkelig oksygen til leveren og for å opprettholde riktig pH fra starten av operasjonen (bikarbonatbuffersystemet vil nå en pH på 7,4 under kontinuerlig gassing, se tilleggsfigur 1).
- Bedøv en mus ved å administrere ketamin (90 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) ved intraperitoneal injeksjon.
- Plasser musen liggende på et oppvarmet operasjonsbord og bekreft mangelen på reflekser som svar på tåklemmen. Spray med 70% etanol for å forhindre at håret fester seg til saksen. Festing av musen til den varme overflaten bidrar til å øke stabiliteten for følgende prosedyrer.
- Lag et snitt med saks i undersiden av magen og kutt oppover til brystkassen på begge sider for å avsløre bukhulen. Flytt tarmene til høyre ved hjelp av en bomullspinne, og utsett portalvenen.
- Plasser to ligaturer under portalvenen ved hjelp av buede tang og lag en løs knute for hver ligatur.
- Sett et 0,7 mm kateter inn i portalvenen. Når kanylen er perforert, fjernes den fra kateteret og fører kateteret gjennom venen til tuppen av kateteret er nær leveren, som illustrert i figur 2. Blod strømmer inn i kateteret.
- Stram ligaturene. Hvis kateteret ikke er fylt med blod, fyll det opp med perfusjonsbuffer for å unngå innføring av en luftboble.
- Fest perfusjonsrøret og start perfusjon av leveren med Krebs-Henseleit bikarbonatbuffer ved 37 °C ved å starte rullepumpen med en perfusjonsstrømningshastighet på 0,8 ml / min. Leveren blir blek i løpet av sekunder.
- Klipp brystkassen og membranen med saks. På dette tidspunktet blir dyret avlivet. Plasser en ligatur under den suprahepatiske vena cava med finpunkttang. Plasser en penn, rullet gasbind eller et annet engangselement under baksiden av musen for å gjøre venen mer tilgjengelig.
- Sett et kateter inn i den suprahepatiske vena cava inferior via høyre atrium i hjertet. Når det er perforert, fjern nålen fra kateteret og før kateteret gjennom venen til spissen av kateteret er nær leveren. Blod og perfusjonsbuffer går ut umiddelbart.
- Stram ligaturen og fest et rør for oppsamling av perfusjonsavløp. Fest alle rør med vanntett tape (elegant tape eller lignende).
- Bruk en karklemmeadapter til å plassere en karklemme over den infrahepatiske vena cava rett over høyre nyrevene for å forhindre blanding (figur 2).
- Øk perfusjonsstrømningshastigheten til 3,5 ml/min og start en tidtaker. Start trykkregistreringen. Vellykket perfusjon resulterer vanligvis i et trykk på ~ 10 mm / Hg.
- Dekk leveren med en steril drapering fuktet med saltvann og tilsett saltvann under forsøket for å forhindre at den tørker ut.
- Samle perfusjonsavløpsvannet i 1 min og mål volumet. Volumet skal være ca. 3,5 ml/min. Blanding av blod forventes ikke på dette stadiet, og hjertet pumper ikke lenger.
- Vent i en likevektsperiode på 30 minutter før du starter eksperimentet.
Figur 1: En illustrasjon av perfusjonsoppsettet . (A)Operasjonsbordet er forhøyet på et stativstativ og oppvarmet til 37 °C. Perfusjonsbufferen gasses (95 %O2, 5 % CO2), pumpes via en peristaltisk rullepumpe og varmes opp i varmeveksleren med innebygd boblefelle. Systemet består videre av en trykkmåler og spindelpumpe for justering av perfusjonstrykket. Perfusjonstrykket registreres og visualiseres kontinuerlig via en svinger på en PC, et trykkregistreringsprogram. (B) Den røde boksen fanger opp forbindelsene til treveis stoppekraner. Den første treveis stoppekranen er åpen for infusjon av en testforbindelse via en sprøytepumpe, og den andre er lukket. Den tredje er åpen for kontinuerlige trykkmålinger. Den fjerde stoppekranen kan brukes til å samle inngangsprøver, for eksempel gassanalyse over den perfunderte leveren. Koblingene kan endres etter behov for spesifikke eksperimenter som krever flere eller færre infusjonsslanger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Bilder av bukhulen på mus før og under leverperfusjon. (A)Den grønne prikken angir plasseringen av spissen av portalvenekateteret. Det er viktig at spissen av kateteret er plassert like under forgreningspunktet til portalvenen i venstre og høyre leverportåre, men over pankreat-duodenal gren for å unngå lekkasje. Den gule prikken indikerer den korrekte plasseringen av karklemmen på den infrahepatiske vena cava mellom høyre nyrevene og leveren for å unngå tilbakestrømning av blod inn i den perfuserte leveren. (B, C) En perfusert muselever med de to katetrene satt inn i portvenen (B) og suprahepatisk vena cava inferior (C) og karklemmen på den infrahepatiske vena cava inferior vena cava (B). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Eksperiment
- Start eksperimentet ved å samle de første basisprøvene ved hjelp av en brøkkollektor ved slutten av likevektsperioden. Samle prøver med ønsket tidsintervall og legg dem på is umiddelbart.
- Kontroller boblefellen regelmessig og fyll på med perfusjonsbuffer når den er nær tom.
- Samle en prøve av bufferen gjennom en treveis stoppekran umiddelbart før den kommer inn i orgelet og fra det samlende kateteret som er satt inn i den dårligere vena cava (etter at den har blitt perfusert gjennom leveren).
- Mål prøvene med en blodgassanalysator for å bekrefte at organet er metabolsk aktivt (indikert ved en økning i partialtrykket av CO2 og en reduksjon i pH).
- Gjenta trinn 4.3-4.4 på slutten av eksperimentet for å vurdere levedyktigheten gjennom hele eksperimentet (tilleggsfigur 2).
MERK: Reduksjonen i oksygenpartialtrykk gir ikke et pålitelig mål på respirasjon på grunn av tap av oksygen fra slanger, organ etc. - Etter 15 minutter med baseline perfusjon, start den første stimuleringen ved å infusere et teststoff gjennom en treveis stoppekran ved ønsket strømningshastighet ved hjelp av en sprøytepumpe (f.eks. 20x konsentrasjon av teststoffet når den tilføres med en hastighet på 0,175 ml / min via en sidearmspumpe). Alternativt kan du bytte baselinebufferen til en ny (oksygenert og oppvarmet) buffer som inneholder testforbindelsen i den endelige konsentrasjonen.
- Stopp stimuleringen og samle baseline prøver i 20-30 min før du starter den andre stimuleringen.
- På slutten av forsøket, tilfør en passende positiv kontroll i 5-10 minutter.
- Etter forsøket, excise den perfuserte leveren og vei den for å normalisere utgangen til levervekt. Snap-fryse leveren i flytende nitrogen for potensiell måling av proteininnhold for å normalisere utgangen til proteininnhold.
5. Biokjemiske målinger
- Kvantifisere konsentrasjonen av molekylet av interesse ved hjelp av analyser som passer for målinger i perfusjonsbuffer (interne eller kommersielt tilgjengelige kolorimetriske eller ELISA-analyser). Bufferen er kompatibel med de fleste omics-baserte teknikker som metabolomics og proteomics.
MERK: I denne studien ble urea målt basert på en kolorimetrisk analyse tidligere beskrevet14. Glukose og ikke-esterifiserte fettsyrer ble kvantifisert ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett.
6. Dataanalyse
- Presenter dataene i XY-grafer som viser sekretorisk utgang over tid.
MERK: Det er en av fordelene ved in vitro perfusjonssystemet at det er mulig å uttrykke data som den faktiske utgangen (konsentrasjon × strømningshastighet, f.eks. μmol/min) i stedet for den målte konsentrasjonen i utgangen (mmol/L) som i in vivo-studier. Vurder å normalisere utgangen til levervekten når du sammenligner forskjellige musemodeller eller med det totale proteininnholdet (målt ved BCA) når du sammenligner kontrollmus med musemodeller med fedme eller leversykdommer der en økning i levervekt kan skyldes økt fettinnhold. - Presenter sammendragsdata som individuelle prikker per dyr som representerer gjennomsnittlig eller total output ved baseline og over en stimuleringsperiode (typisk 15-30 min) eller inkrementell output ved hjelp av foregående baseline for hver stimuleringsperiode avhengig av studiedesign.
- Analyser dataene ved hjelp av paret t-test (to grupper) eller enveis ANOVA med gjentatte stimuleringer (mer enn to grupper) med en passende post-hoc-test for multippel testing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En jevn grunnlinje er nødvendig for å avgjøre om en stimulus eller substrat fører til frigjøring av molekylet av interesse. Figur 3A viser et eksempel på et vellykket eksperiment. Produksjon av urea i perfusert lever måles i 2 minutters intervaller og vises som gjennomsnitt ± SEM. Basisperiodene forut for hver av de to stimuleringsperiodene er stabile. Gjennomsnittlig ureaproduksjon i de to stimuleringsperiodene og de respektive foregående baselinjene er vist i figur 3B. Statistisk signifikans mellom periodene ble testet med enveis ANOVA med gjentatte målinger. Basert på disse resultatene kan det konkluderes med at urearesponsen på to påfølgende stimuleringer med blandede aminosyrer er lik, noe som er et viktig kontrolleksperiment ved evaluering av gjentatte stimuleringer med forskjellige doser eller testforbindelser.
I tillegg til ureagenese er det mulig å studere leverglykogenolyse og lipolyse ved hjelp av protokollen ovenfor. Figur 3C-F viser data fra et separat eksperiment under en infusjon med glukagon. Frigjøringen av glukose (figur 3C) og de ikke-esterifiserte fettsyrene (NEFA) (figur 3E) ble målt i perioder på 4 minutter. En jevn basal frigjøring av glukose (figur 3C) og NEFA (figur 3E) er observert før en robust økning i henholdsvis glukose og NEFA under glukagoninfusjonen. Basert på gjennomsnittsverdiene ved basal tilstand og under glukagoninfusjonen kan det konkluderes med at glukagon raskt stimulerer leverglykogenolyse (figur 3D) og lipolyse (figur 3F).
Figur 4 viser et eksempel på tilsynelatende mislykkede eksperimenter. Den basale frigjøringen av urea er ustabil, og stimuleringsperiodene er for nær hverandre til at ureaproduksjonen kan gå tilbake til basale nivåer før neste stimulering begynner. Uten jevne basale perioder er det ikke mulig å skille en urearespons fra den neste. Fra disse dataene er det umulig å konkludere om forskjellige glukosekonsentrasjoner påvirker aminosyreindusert ureagenese i den perfunderte museleveren. Eksperimentelle protokoller bør i stedet utformes med 20-30 minutter basisperioder mellom to påfølgende stimuleringer for å nå en jevn grunnlinje før hver stimuleringsperiode.
Figur 3: Data av god kvalitet fra perfundert muselever. (A,B) Urea total er vist under basale forhold og som respons på perioder med administrering av blandede aminosyrer (10 mM) og glukose (6 mM). Data er presentert som (A) gjennomsnitt ± SEM og (B) gjennomsnittsverdier under hver stimulering og forutgående basalperiode (hver prikk representerer en mus), n = 6. (C, D) Glukose og (E,F) ikke-esterifiserte frie fettsyrer (NEFA) totale utganger er vist i basale forhold og respons på administrering av glukagon (10 nM). Data er presentert som (C,E) gjennomsnittsverdier ± SEM og (D,F) i basal- og stimuleringsperioden (hvert punkt representerer en mus), n = 6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Data av dårlig kvalitet fra den perfuserte museleveren. Ureas totale produksjon er vist i basale forhold som respons på blandede aminosyrer (10 mM) og synkende konsentrasjoner av glukose (18 mM, 12 mM, 6 mM, 3 mM og 0 mM). Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM, n = 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Tidsavhengig partialtrykk av oksygen og karbondioksid og pH i Krebs-Henseleit bikarbonatbuffer under gassing med 95% O2 + 5% CO2. (A) Partialtrykk av oksygen, (B) karbondioksid og (C) pH i prøver av Krebs-Henseleit perfusjonsbuffer (pH ikke justert før forsøket) samlet etter å ha kjørt gjennom perfusjonssystemet på angitte tidspunkter etter starten av gassingen med 95%O2 + 5% CO2. Perfusjonsbufferprøver ble målt med blodgassanalysator. Klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggsfigur 2: Endringer i partialtrykk av oksygen og karbondioksid og pH over den perfunderte leveren. (A) Partialtrykk av oksygen, (B) karbondioksid og (C) pH i prøver av Krebs-Henseleit perfusjonsbuffer samlet umiddelbart før den når leveren og etter å ha blitt passert den perfuserte leveren på 1 min og 180 minutter i et eksperiment. Perfusjonsprøver ble målt med blodgassanalysator. Data vises som gjennomsnitt ± SD. **P < 0,01, ****P < 0,0001 ved flere parvise t-tester korrigert for multippel testing med Holm-Sidak-metoden. n = 14. Klikk her for å laste ned dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den isolerte perfuserte museleveren er et sterkt forskningsverktøy for studier av dynamikken og molekylære mekanismer for levermetabolisme. Muligheten for minutt-til-minutt prøveinnsamling gir en detaljert evaluering av den direkte effekten av en testforbindelse på leveren. Sammenlignet med in vivo-studier, tillater den perfuserte leveren oss å studere levermetabolisme på en isolert måte, unngå ekstrahepatiske faktorer som bæres av blodet og med full kontroll over eksperimentelle forhold. Fordelene ved leverperfusjon sammenlignet med in vitro-studier med isolerte hepatocytter er vedlikehold av leverarkitektur, polaritet, sonedeling og vaskulær integritet. En annen fordel med leverperfusjon er det store prøvestørrelsesvolumet (3,5 ml / min), noe som gjør det mulig å måle flere utfall i samme prøve. Den perfuserte leveren er imidlertid ikke ideell når man studerer effekter som er avhengige av transkripsjonsregulering, siden slike mekanismer kan ta flere timer å oppstå. I tillegg til metabolsk forskning kan protokollen brukes i andre forskningsfelt for å studere leverens endokrine funksjoner (sekresjon av hormoner og hepatokiner) og levermetabolisme av legemidler og xenobiotika.
Det mest kritiske trinnet for denne metoden er plasseringen av kateteret i portalvenen. Det er viktig at spissen av kateteret plasseres rett før grenpunktet til portvenen inn i venstre og høyre leverportvener (figur 2). Hvis spissen av kateteret skyves for langt, vil bare en del av leveren være riktig perfusert. Hvis den plasseres for langt ned i portvenen, kan det oppstå lekkasje gjennom pancreato-duodenalgrenen. Plassering av det andre kateteret for innsamling er mindre presserende, siden leveren på dette trinnet allerede er perfusert med den oksygenerte bufferen. Når operasjonen er vellykket utført, vil leveren være respirerende og responsiv i minst 3 timer med konstant trykk og perfusjonsutgang (tilleggsfigur 2). På dette stadiet er unngåelse av luftbobler i perfusjonssystemet den viktigste faktoren for et vellykket eksperiment. Luftbobler er vanskelig å unngå helt siden bufferen kontinuerlig gasses med oksygen, men boblene skal fanges i perfusjonssystemets boblefelle. Det er derfor viktig å holde øye med boblefellen og etterfylle den med perfusjonsbuffer når den er nær tom.
Krebs-Henseleit buffer (KHB) er den mest brukte løsningen for leverperfusjoner13. Den klassiske formuleringen inneholder 2,5 mmol/l CaCl 2, men basert på en tidligere studie som viser at kalsium bidrar til mitokondrieskade, bruker vi en buffer med kun 1,25 mmol/L CaCl212. Tilsetning av erytrocytter, albumin eller glukose til bufferen er ikke nødvendig11. Den foreslåtte bufferen tillater også molekylær profilering ved hjelp av avanserte biokjemiske teknikker som massespektrometribasert metabolomikk. Ulike konsentrasjoner av en testforbindelse kan testes for å bestemme optimal dose og for å evaluere fysiologiske vs. farmakologiske effekter. I forsøkene som ble utført i denne studien, er 10 mM AA i det høye fysiologiske området som tilsvarer postprandial nivå, mens 10 nM glukagon tilsvarer en farmakologisk dose. Som vist i figur 4 er det viktig å inkludere 20-30 min basisperiode mellom to påfølgende stimuleringer for å kunne sammenligne dynamikken og molekylære mekanismer for de respektive responsene.
Det er viktig å unngå blod i perfusatprøvene, da det kan forstyrre de påfølgende analysene, f.eks. kolorimetrisk bestemmelse av urea og glukosekonsentrasjoner. Hvis blod vises i de oppsamlede prøvene etter ~ 15 min i likevektsperioden, når en 3-veis ventil åpnes for infusjoner, eller når boblefellen er fylt, er karklemmen på den infrahepatiske vena cava sannsynligvis ikke plassert riktig.
Vår erfaring er at en vellykket operasjon resulterer i et stabilt portaltrykk på ~10 mmHg og en utgangsstrømningshastighet på 3,5 ml/min i løpet av få minutter etter innsetting av samlekateteret. Hvis trykket er betydelig høyere eller kontinuerlig økende, eller hvis den oppsamlede utgangsstrømningshastigheten ikke er 3,5 ml / min eller kontinuerlig synker, bør flere hendelser vurderes: 1) Er alle leverlapper like perfunderte og viser en jevn blek farge? Hvis ikke, kan det ha oppstått en okklusjon (ofte en luftboble, forsiktig "massere" leverlappen med en bomullspinne, dette bidrar noen ganger til å frigjøre luftboblen hvorved trykket vil falle umiddelbart), eller portalvenekateteret har blitt presset for langt opp, og dermed forsyner bare en av de to grenene av leverportvenen (prøv forsiktig å trekke kateteret tilbake noen få millimeter). 2) Er den suprahepatiske vena cava vridd? Dette kan oppstå når du fester den mannlige delen av oppsamlingsrøret til den kvinnelige delen av kateteret som er satt inn i venen; Fjern forsiktig oppsamlingsrøret og observer om trykket faller. 3) Er det samlende kateteret presset for langt ned i den suprahepatiske vena cava inferior slik at spissen av kateteret har kilt seg inn i leveren? Trekk forsiktig inn noen millimeter om nødvendig.
Oppsummert er den perfuserte museleveren en fysiologisk relevant in vitro eksperimentell modell som kan brukes til å studere de dynamiske effektene av en gitt forbindelse på leveren. Kvaliteten på operasjonen er avgjørende for kvaliteten på innhentede data, og etter vår erfaring tar det ~ 2 måneders trening før data av tilfredsstillende kvalitet kan forventes. Når teknikken er lært, er mulighetene med denne metoden mange, inkludert bruk av transgene eller knockoutdonordyr angående gener av interesse, samt musemodeller av leversykdommer. Eksperimenter kan imidlertid være begrenset av potensielle toksiske bivirkninger (som sannsynligvis vil være mye mer alvorlige in vivo) eller dårlig oppløselighet av testforbindelser. Slike forbindelser kan gis oralt til donordyrene på et passende tidspunkt før perfusjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter som er relevante for denne artikkelen.
Acknowledgments
Studiene og Nicolai J. Wewer Albrechtsen ble støttet av Novo Nordisk Foundation Excellence Emerging Investigator Grant - Endocrinology and Metabolism (søknad nr. NNF19OC0055001), European Foundation for the Study of Diabetes Future Leader Award (NNF21SA0072746) og Danmarks uavhengige forskningsfond, Sapere Aude (1052-00003B). Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research støttes økonomisk av Novo Nordisk Foundation (Grant agreement NNF14CC0001). Figur 1B er laget med biorender.com. Vi takker Dr. Rune E. Kuhre (Novo Nordisk A/S) for fruktbare diskusjoner om den perfuserte museleveren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-way stopcock | BD | 394601 | |
| Altromin breeding diet | Altromin Spezialfutter | 1319 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma | C8106 | |
| Catheters (0.7 mm) | BD | 381812 | |
| Filter paper (pore size 2.0 µm) | Millipore | AP2029325 | |
| Glucose kit | QuantiChromTM | DIGL-100 | Low concentration protocol |
| Ketamine | MSD Animal Health | 511485 | 90 mg/kg |
| Ligature (black sterile silk) | Agnthos | 14739 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | 230391 | |
| Non-esterified fatty acids kit | Fujifilm Wako Chemicals | NEFA-HR(2) | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate(KH2PO4) | Merck | 1.04877 | |
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Sleek tape | Mediq danmark | 4001910 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | |
| Thermostatic Circulator | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | Bath Volume 3 L, 230 V/50 Hz |
| Tubing | Tygon | E3603 | Inner diameter 1.59 mm, outer diameter 3.18 mm |
| Universal perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | Basic unit uniper UP-100, type 834 |
| Vamin | Fresenius Kabi | B05ABA01 | Mixed amino acids |
| Vessel clamp adaptor | Deutsche Biomedical | DBC1002 | |
| Vessel clamps | Deutsche Biomedical | DBC1005 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Xylazine | Rompun Vet | 530701 | 10 mg/kg |
References
- Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response. Scientific Reports. 6, 25329 (2016).
- Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
- Seirup, M., et al. Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro. Genomics. 114 (3), 110330 (2022).
- Gupta, R., et al. Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq. Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137 (2021).
- Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX. Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
- Bartošek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. Isolated Liver Perfusion and its Applications. , Raven Press. New York. (1973).
- Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations. Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).
- Mischinger, H. J., et al. An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates. Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).
- Vairetti, M., et al. Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2. Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).
- Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).
- Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -G. Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium. Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).
