Summary
Aqui, apresentamos um método robusto de perfusão in situ do fígado de camundongos para estudar a regulação aguda e direta do metabolismo hepático sem perturbar a arquitetura hepática, mas na ausência de fatores extra-hepáticos.
Abstract
O fígado tem inúmeras funções, incluindo o metabolismo de nutrientes. Em contraste com outros modelos in vitro e in vivo de pesquisa hepática, o fígado perfundido isolado permite o estudo da biologia e metabolismo hepático em todo o fígado com uma arquitetura hepática intacta, separada da influência de fatores extra-hepáticos. As perfusões hepáticas foram originalmente desenvolvidas para ratos, mas o método também foi adaptado para camundongos. Descrevemos aqui um protocolo de perfusão in situ do fígado de camundongos. O fígado é perfundido anterógrado através da veia porta com tampão de bicarbonato de Krebs-Henseleit oxigenado, e o débito é coletado da veia cava inferior supra-hepática com pinçamento da veia cava inferior infra-hepática para fechar o circuito. Usando este método, os efeitos hepáticos diretos de um composto de teste podem ser avaliados com uma resolução temporal detalhada. A função e a viabilidade hepática são estáveis por pelo menos 3 h, permitindo a inclusão de controles internos no mesmo experimento. As possibilidades experimentais utilizando este modelo são inúmeras e podem inferir conhecimentos sobre a fisiologia hepática e doenças hepáticas.
Introduction
O fígado é um órgão essencial no metabolismo. Ele desempenha um papel fundamental no controle do equilíbrio energético de todo o corpo, regulando o metabolismo de glicose, lipídios e aminoácidos. O aumento das doenças hepáticas em todo o mundo está emergindo como um grande fardo global para a saúde, e mais conhecimento é necessário sobre a fisiopatologia e suas consequências para as funções hepáticas.
Vários modelos in vitro têm sido desenvolvidos para pesquisas no fígado para complementar os estudos in vivo. Hepatócitos primários isolados e cultivados de roedores e humanos são amplamente utilizados. Células não-parenquimatosas podem ser separadas de hepatócitos usando centrifugação diferencial e gradiente, e o co-cultivo de diferentes tipos celulares é útil para o estudo de crosstalkintercelular1. Embora hepatócitos humanos primários sejam considerados o padrão-ouro para testar a toxicidade de drogas, vários estudos têm demonstrado que os hepatócitos se desdiferenciam rapidamente em cultura de tecidos, resultando em perda das funções hepáticas 2,3,4. A cultura de hepatócitos em um sistema esferoide 3D melhora a desdiferenciação, é mais estável e parece mimetizar o fígado in vivo em maior grau do que os sistemas tradicionais de cultura 2D5. Os cortes hepáticos cortados com precisão são outro modelo in vitro bem estabelecido que mantém intacta a arquitetura tecidual e contém as células não parenquimatosas presentes no fígado6. Modelos in vitro mais avançados incluem fígado-em-um-chip7 e organoides hepáticos8. No entanto, com todas essas abordagens, há uma perda da integridade estrutural e da dinâmica do fluxo, incluindo o fluxo vetorial da veia porta-hepática, o que provavelmente impacta a generalizabilidade.
O fígado de rato perfundido isolado foi descrito pela primeira vez por Claude Bernard em 18559, e ainda é usado em vários campos científicos para estudos de biologia hepática, toxicologia e fisiopatologia. As vantagens do fígado perfundido em relação aos modelos in vitro citados incluem a manutenção da arquitetura hepática, o fluxo vascular, a polaridade e zonação dos hepatócitos e as interações entre hepatócitos e células não parenquimatosas. Comparado a estudos in vivo, o fígado perfundido permite o estudo do metabolismo hepático de forma isolada evitando fatores extra-hepáticos transportados pelo sangue e com controle completo sobre as condições experimentais. Várias modificações têm sido feitas para melhorar o modelo de perfusão hepática de ratos ao longo dos anos10,11,12,13. Embora camundongos tenham sido usados para estudos de fígado perfundido isolado, menos literatura está disponível. Apresentamos aqui um método de perfusão in situ do fígado de camundongos por canulação da veia porta e da veia cava supra-hepática inferior para estudar as respostas metabólicas agudas e diretas a substratos metabólicos e hormônios medidos no efluente venoso hepático do fígado de camundongos em tempo real.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os experimentos com animais foram realizados com permissão da Inspetoria Dinamarquesa de Experimentação Animal, Ministério do Meio Ambiente e Alimentação da Dinamarca (licença 2018-15-0201-01397), e do comitê de ética local de acordo com a diretiva da UE 2010/63/UE, os Institutos Nacionais de Saúde (publicação nº 85-3) e seguindo as diretrizes da legislação dinamarquesa que rege a experimentação animal (1987). Trata-se de um procedimento terminal, cuja causa de morte é exsanguinação e perfuração do diafragma sob anestesia profunda.
1. Animais de experimentação
- Obter camundongos da linhagem desejada, idade e sexo. Este estudo utilizou camundongos machos C57BL/6JRj com idade entre 11 e 16 semanas. Abrigar até 5 camundongos machos ou 8 fêmeas por gaiola com acesso ad libitum à ração e água e manter um ciclo claro-escuro de 12 h/12 h com luzes acesas das 6h às 18h.
2. Preparações pré-operatórias
- Faça tampão de perfusão hepática.
- Tampão de Krebs-Henseleit. Misturar e dissolver 118 mmol/L de NaCl, 4,7 mmol/L de KCl, 1,2 mmol/L de MgSO 4 e 1,2 mmol/L de KH 2 PO4 em dH 2 O. Dissolva 1,25 mmol/L de CaCl2num copo separado e adicione o tampão.
- Dissolver 25 mmol/L NaHCO3 e adicionar lentamente ao tampão enquanto agita. Guarde o buffer a 4 graus. O buffer é estável por pelo menos 1 mês.
NOTA: Pode ocorrer precipitação se CaCl2 e NaHCO3 não forem dissolvidos individualmente antes de serem adicionados.
- Filtrar o tampão de perfusão através de um filtro de 2 μm e ajustar o pH para 7,5 usando HCl.
OBS: Esta etapa deve ser realizada no dia do experimento, pois o pH aumenta com o tempo, mesmo quando armazenado em frascos fechados. - Preparar compostos de teste em uma concentração maior do que a concentração final desejada (por exemplo, concentração de 20x quando infundido a uma taxa de 0,175 mL/min através de uma bomba lateral) em tampão de perfusão Krebs-Henseleit filtrado e ajustado ao pH. Se for caso disso, diluir os compostos de ensaio em tampão de perfusão Krebs-Henseleit com 1% de BSA adicionado como transportador (para evitar a adesão a tubos e vidros, essenciais para todos os péptides), filtrados através de um filtro de tamanho adequado.
3. Operação e perfusão
OBS: A Figura 1 ilustra o arranjo perfusional utilizado neste estudo.
- Gaseie o tampão de perfusão (95% O 2, 5% CO2) por pelo menos 30 min para fornecer oxigênio suficiente ao fígado e manter o pH correto desde o início da operação (o sistema tampão de bicarbonato atingirá um pH de 7,4 sob gaseificação contínua, ver Figura Suplementar 1).
- Anestesiar camundongos administrando cetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) por injeção intraperitoneal.
- Coloque o rato em decúbito dorsal sobre uma mesa de operação aquecida e confirme a ausência de reflexos em resposta ao pinçamento do dedo do pé. Borrife com etanol 70% para evitar que o cabelo grude na tesoura. Fixar o mouse na superfície quente ajuda a aumentar a estabilidade para os procedimentos a seguir.
- Faça uma incisão com tesoura na base do abdômen e corte para cima até a caixa torácica de ambos os lados para expor a cavidade abdominal. Mova os intestinos para a direita usando um cotonete, expondo a veia porta.
- Coloque duas ligaduras sob a veia porta usando pinça curva e prepare um nó solto para cada ligadura.
- Insira um cateter de 0,7 mm na veia porta. Quando perfurada, retire a agulha do cateter e guie-o pela veia até que a ponta do cateter esteja próxima ao fígado, conforme ilustrado na Figura 2. O sangue flui para o cateter.
- Aperte as ligaduras. Se o cateter não estiver cheio de sangue, preencha-o com tampão de perfusão para evitar a introdução de uma bolha de ar.
- Conectar o tubo de perfusão e iniciar a perfusão do fígado com tampão de bicarbonato Krebs-Henseleit a 37 °C ligando a bomba de roletes a uma taxa de fluxo de perfusão de 0,8 mL/min. O fígado fica pálido em segundos.
- Corte a caixa torácica e o diafragma com uma tesoura. Neste momento, o animal é sacrificado. Coloque uma ligadura sob a veia cava inferior supra-hepática usando pinça de ponta fina. Coloque uma caneta, gaze enrolada ou outro item descartável sob a parte de trás do mouse para tornar a veia mais acessível.
- Insira um cateter na veia cava inferior supra-hepática através do átrio direito do coração. Quando perfurado, remova a agulha do cateter e guie o cateter através da veia até que a ponta do cateter esteja próxima ao fígado. O tampão de sangue e perfusão se esgota imediatamente.
- Apertar a ligadura e fixar um tubo para a coleta do efluente de perfusão. Fixe todos os tubos com fita impermeável (fita adesiva ou similar).
- Utilizar um adaptador de pinça de vaso para colocar uma pinça de vaso através da veia cava infra-hepática imediatamente acima da veia renal direita para evitar a mistura (Figura 2).
- Aumentar o fluxo de perfusão para 3,5 mL/min e iniciar um temporizador. Inicie a gravação de pressão. A perfusão bem-sucedida geralmente resulta em uma pressão de ~10 mm/Hg.
- Cubra o fígado com um pano estéril umedecido com soro fisiológico e adicione soro fisiológico durante o experimento para evitar que ele seque.
- Coletar o efluente de perfusão por 1 min e medir o volume. O volume deve ser de aproximadamente 3,5 mL/min. A mistura de sangue não é esperada nesta fase, e o coração não bombeia mais.
- Aguarde um período de equilíbrio de 30 min antes de iniciar o experimento.
Figura 1: Ilustração do setup da perfusão. (A)A mesa cirúrgica é elevada sobre um suporte de tripé e aquecida a 37 °C. O tampão de perfusão é gaseificado (95% O 2, 5% CO2), bombeado através de uma bomba de rolos peristálticos e aquecido no trocador de calor com uma armadilha de bolhas integrada. O sistema também é composto por um manômetro e uma bomba de fuso para ajuste da pressão de perfusão. A pressão de perfusão é continuamente registrada e visualizada através de um transdutor em um PC, um programa de registro de pressão. (B) A caixa vermelha capta as conexões das torneiras de três vias. A primeira torneira de três vias é aberta para a infusão de um composto de teste através de uma bomba de seringa, e a segunda é fechada. O terceiro está aberto para medições contínuas de pressão. A quarta torneira pode ser usada para coletar amostras de entrada, por exemplo, análise de gás em todo o fígado perfundido. Os conectores podem ser modificados conforme necessário para experimentos específicos que exigem mais ou menos linhas de infusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fotos da cavidade abdominal de camundongos antes e durante a perfusão hepática. (A) O ponto verde indica a localização da ponta do cateter da veia porta. É importante que a ponta do cateter seja posicionada logo abaixo do ponto de ramificação da veia porta para as veias porta hepáticas esquerda e direita, mas acima do ramo pancreatoduodenal para evitar vazamento. O ponto amarelo indica a localização correta da pinça do vaso na veia cava inferior infra-hepática entre a veia renal direita e o fígado para evitar o refluxo de sangue para o fígado perfundido. (B, C) Fígado de camundongo perfundido com os dois cateteres inseridos na veia porta (B) e veia cava inferior supra-hepática (C) e pinça do vaso na veia cava inferior infra-hepática (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Experiência
- Iniciar o experimento coletando as primeiras amostras basais usando um coletor de fração no final do período de equilíbrio. Coletar amostras no intervalo de tempo desejado e colocá-las no gelo imediatamente.
- Verifique o coletor de bolhas regularmente e encha novamente com tampão de perfusão quando estiver perto de vazio.
- Coletar uma amostra do tampão através de uma torneira de três vias imediatamente antes de entrar no órgão e do cateter coletor inserido na veia cava inferior (depois de ter sido perfundido através do fígado).
- Medir as amostras com um analisador de gases sanguíneos para confirmar que o órgão está metabolicamente ativo (indicado por um aumento na pressão parcial de CO2 e uma diminuição no pH).
- Repetir as etapas 4.3-4.4 no final do experimento para avaliar a viabilidade ao longo do experimento (Figura 2 Suplementar).
NOTA: A diminuição da pressão parcial de oxigênio não fornece uma medida confiável da respiração por causa das perdas de oxigênio da tubulação, do órgão etc. - Após 15 minutos de perfusão basal, inicie a primeira estimulação através da infusão de uma substância de ensaio através de uma torneira de três vias à taxa de fluxo desejada utilizando uma bomba de seringa (por exemplo, concentração de 20x da substância em estudo quando infundida a uma taxa de 0,175 ml/min através de uma bomba lateral). Em alternativa, mude o tampão de base para um novo tampão (oxigenado e aquecido) contendo o composto de ensaio na concentração final.
- Pare a estimulação e colete amostras basais por 20-30 minutos antes de iniciar a segunda estimulação.
- Ao final do experimento, infundir um controle positivo apropriado por 5-10 min.
- Após o experimento, excique o fígado perfundido e pese-o para normalizar a saída para o peso do fígado. Congelar o fígado em nitrogênio líquido para medição potencial do conteúdo de proteína para normalizar a saída para o conteúdo de proteína.
5. Medições bioquímicas
- Quantificar a concentração da molécula de interesse usando ensaios apropriados para medições em tampão de perfusão (ensaios colorimétricos ou ELISA internos ou comercialmente disponíveis). O tampão é compatível com a maioria das técnicas baseadas em ômica, como metabolômica e proteômica.
OBS: Neste estudo, a ureia foi medida com base em ensaio colorimétrico previamente descrito14. Glicose e ácidos graxos não-esterificados foram quantificados usando kits comercialmente disponíveis.
6. Análise dos dados
- Apresente os dados em gráficos XY mostrando a saída secretora ao longo do tempo.
NOTA: É uma das virtudes do sistema de perfusão in vitro que é possível expressar dados como a saída real (concentração × vazão, por exemplo, μmol/min) em vez da concentração medida na saída (mmol/L) como em estudos in vivo . Considere normalizar a saída para o peso do fígado ao comparar diferentes modelos de camundongos ou para o conteúdo de proteína total (medido por BCA) ao comparar camundongos controle com modelos de camundongos com obesidade ou doenças hepáticas onde um aumento no peso do fígado pode ser devido ao aumento do conteúdo de gordura. - Apresentar dados resumidos como pontos individuais por animal representando a saída média ou total durante a linha de base e durante um período de estimulação (tipicamente 15-30 min) ou saída incremental usando a linha de base anterior para cada período de estimulação, dependendo do desenho do estudo.
- Analise os dados usando teste t pareado (dois grupos) ou ANOVA unidirecional com estímulos repetidos (mais de dois grupos) com um teste post-hoc apropriado para testes múltiplos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uma linha de base estável é necessária para determinar se um estímulo ou substrato leva à liberação da molécula de interesse. A Figura 3A mostra um exemplo de experimento bem-sucedido. A produção de ureia no fígado perfundido é medida em intervalos de 2 min e mostrada como média ± EPM. Os períodos basais que precedem cada um dos dois períodos de estimulação são estáveis. A produção média de ureia durante os dois períodos de estimulação e as respectivas linhas de base precedentes são mostradas na Figura 3B. A significância estatística entre os períodos foi testada por meio de ANOVA one-way com medidas repetidas. Com base nesses resultados, pode-se concluir que a resposta da ureia a dois estímulos consecutivos com aminoácidos mistos é semelhante, o que é um importante experimento controle na avaliação de estímulos repetidos com diferentes doses ou compostos teste.
Além da ureagênese, é possível estudar a glicogenólise e lipólise hepática utilizando o protocolo acima. A Figura 3C-F mostra os dados de um experimento separado durante uma infusão com glucagon. A liberação de glicose (Figura 3C) e de ácidos graxos não esterificados (AGNE) (Figura 3E) foi medida em períodos de 4 min. Uma liberação basal constante de glicose (Figura 3C) e NEFA (Figura 3E) é observada antes de um aumento robusto de glicose e NEFA durante a infusão de glucagon, respectivamente. Com base nos valores médios no estado basal e durante a infusão de glucagon, pode-se concluir que o glucagon estimula rapidamente a glicogenólise hepática (Figura 3D) e a lipólise (Figura 3F).
A Figura 4 mostra um exemplo de experimentos aparentemente malsucedidos. A liberação basal de ureia é instável, e os períodos de estimulação são muito próximos uns dos outros para que a produção de ureia retorne aos níveis basais antes do início da próxima estimulação. Sem períodos basais estáveis, não é possível distinguir uma resposta de ureia da seguinte. A partir desses dados, é impossível concluir se diferentes concentrações de glicose influenciam a ureagênese induzida por aminoácidos no fígado de camundongos perfundidos. Em vez disso, os protocolos experimentais devem ser projetados com 20-30 min de períodos basais entre duas estimulações consecutivas para atingir uma linha de base estável antes de cada período de estimulação.
Figura 3: Dados de boa qualidade do fígado de camundongo perfundido. (A,B) A ureia total é mostrada durante condições basais e em resposta a períodos de administração de aminoácidos mistos (10 mM) e glicose (6 mM). Os dados são apresentados como (A) média ± EPM e (B) valores médios durante cada estimulação e precedendo o período basal (cada ponto representa um camundongo), n = 6. (C, D) Os débitos totais de glicose e (E,F) ácidos graxos livres não esterificados (AGNE) são mostrados em condições basais e resposta à administração de glucagon (10 nM). Os dados são apresentados como (C,E) média ± EPM e (D,F) valores médios durante o período basal e de estimulação (cada ponto representa um rato), n = 6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Dados de baixa qualidade do fígado de camundongo perfundido. O débito total de ureia é mostrado em condições basais em resposta a aminoácidos mistos (10 mM) e concentrações decrescentes de glicose (18 mM, 12 mM, 6 mM, 3 mM e 0 mM). Os dados são apresentados como média ± EPM, n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Pressão parcial dependente do tempo de oxigênio e dióxido de carbono e pH em tampão de bicarbonato Krebs-Henseleit durante a gaseificação com 95% O 2 + 5% CO2. (A) Pressão parcial de oxigênio, (B) dióxido de carbono e (C) pH em amostras de tampão de perfusão Krebs-Henseleit (pH não ajustado antes do experimento) coletadas após passagem pelo sistema de perfusão nos momentos indicados após o início da gaseificação com 95% O 2 + 5% CO2. As amostras tampão de perfusão foram medidas com um analisador de gases sanguíneos. Clique aqui para baixar esta figura.
Figura suplementar 2: Alterações na pressão parcial de oxigênio e dióxido de carbono e pH através do fígado perfundido. (A) Pressão parcial de oxigênio, (B) dióxido de carbono e (C) pH em amostras de tampão de perfusão Krebs-Henseleit coletadas imediatamente antes de atingir o fígado e após serem passadas as perfundidas hepáticas em 1 min e 180 min em um experimento. As amostras de perfusão foram medidas com um analisador de gases sanguíneos. Os dados são apresentados como média ± DP. **P < 0,01, ****P < 0,0001 por testes t múltiplos pareados corrigidos para testes múltiplos usando o método de Holm-Sidak. n =14. Clique aqui para baixar esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O fígado isolado de camundongos perfundidos é uma forte ferramenta de pesquisa para estudos da dinâmica e mecanismos moleculares do metabolismo hepático. A possibilidade de coleta minuto-a-minuto de amostras fornece uma avaliação detalhada do efeito direto de um composto teste no fígado. Comparado a estudos in vivo, o fígado perfundido permite estudar o metabolismo hepático de forma isolada evitando fatores extra-hepáticos transportados pelo sangue e com controle completo sobre as condições experimentais. As vantagens da perfusão hepática em relação aos estudos in vitro utilizando hepatócitos isolados são a manutenção da arquitetura hepática, polaridade, divisão zonal e integridade vascular. Outra vantagem da perfusão hepática é o grande volume amostral (3,5 mL/min), permitindo a mensuração de vários desfechos em uma mesma amostra. O fígado perfundido, no entanto, não é ideal quando se estudam efeitos dependentes da regulação transcricional, uma vez que tais mecanismos podem levar várias horas para ocorrer. Além da pesquisa metabólica, o protocolo pode ser aplicado em outros campos de pesquisa para estudar as funções endócrinas do fígado (secreção de hormônios e hepatocinas) e metabolismo hepático de drogas e xenobióticos.
O passo mais crítico para esse método é a colocação do cateter na veia porta. É importante que a ponta do cateter seja posicionada imediatamente antes do ponto de ramificação da veia porta para as veias porta hepáticas direita e esquerda (Figura 2). Se a ponta do cateter for empurrada muito longe, apenas parte do fígado será devidamente perfundida. Se for colocado muito abaixo na veia porta, pode ocorrer vazamento através do ramo pancreato-duodenal. A colocação do segundo cateter para coleta é menos urgente, uma vez que o fígado nessa etapa já está perfundido com o tampão oxigenado. Quando a operação for realizada com sucesso, o fígado estará respirando e respondendo por pelo menos 3 h com pressão e débito de perfusão constantes (Figura 2 Suplementar). Nessa fase, evitar bolhas de ar no sistema de perfusão é o fator mais importante para o sucesso do experimento. Bolhas de ar são difíceis de evitar completamente, uma vez que o tampão é continuamente gaseificado com oxigênio, mas as bolhas devem ser aprisionadas na armadilha de bolhas do sistema de perfusão. Portanto, é importante ficar de olho na armadilha de bolhas e recarregá-la com tampão de perfusão quando estiver perto de vazia.
O tampão de Krebs-Henseleit (KHB) é a solução mais utilizada para perfusões hepáticas13. A formulação clássica contém 2,5 mmol/L de CaCl 2, mas com base em um estudo anterior mostrando que o cálcio contribui para o dano mitocondrial, usamos um tampão com apenas 1,25 mmol/L de CaCl212. A adição de eritrócitos, albumina ou glicose ao tampão não é necessária11. O tampão proposto também permite o perfilamento molecular usando técnicas bioquímicas avançadas, como metabolômica baseada em espectrometria de massa. Diferentes concentrações de um composto de teste podem ser testadas para determinar a dose ideal e avaliar efeitos fisiológicos versus farmacológicos. Nos experimentos realizados neste estudo, 10 mM de AA estão na faixa fisiológica elevada correspondente aos níveis pós-prandiais, enquanto 10 nM de glucagon corresponde a uma dose farmacológica. Como demonstrado na Figura 4, é essencial incluir o período basal de 20-30 min entre duas estimulações consecutivas para poder comparar a dinâmica e os mecanismos moleculares das respectivas respostas.
É importante evitar sangue nas amostras de perfusato, pois pode interferir nas análises subsequentes, por exemplo, determinação colorimétrica das concentrações de ureia e glicose. Se o sangue aparecer nas amostras coletadas após ~15 min no período de equilíbrio, quando uma válvula de 3 vias for aberta para infusões ou quando a armadilha de bolhas for preenchida, a pinça do vaso na veia cava infra-hepática provavelmente não será colocada corretamente.
Em nossa experiência, uma operação bem-sucedida resulta em uma pressão portal estável de ~10 mmHg e uma taxa de fluxo de saída de 3,5 mL/min dentro de alguns minutos após a inserção do cateter coletor. Se a pressão for consideravelmente maior ou aumentar continuamente, ou se o fluxo de saída coletado não for de 3,5 mL/min ou cair continuamente, vários eventos devem ser considerados: 1) Todos os lobos do fígado estão igualmente perfundidos e mostrando uma cor pálida uniforme? Caso contrário, pode ter ocorrido uma oclusão (muitas vezes uma bolha de ar; "massageie" cuidadosamente o lóbulo do fígado com um palito de algodão; isso às vezes ajuda a liberar a bolha de ar pela qual a pressão cairá imediatamente), ou o cateter da veia porta foi empurrado muito para cima, fornecendo assim apenas um dos dois ramos da veia porta hepática (cautelosamente tente puxar o cateter para trás alguns milímetros). 2) A veia cava inferior supra-hepática é torcida? Isso pode ocorrer ao fixar a parte masculina do tubo coletor à parte feminina do cateter inserido na veia; Remova cautelosamente o tubo coletor e observe se a pressão cai. 3) O cateter coletor é empurrado muito para baixo da veia cava inferior supra-hepática para que a ponta do cateter tenha encravado no fígado? Retraia cautelosamente alguns milímetros, se necessário.
Em resumo, o fígado de camundongo perfundido é um modelo experimental in vitro fisiologicamente relevante que pode ser usado para estudar os efeitos dinâmicos de um determinado composto sobre o fígado. A qualidade da operação é crítica para a qualidade dos dados obtidos e, em nossa experiência, são necessários ~2 meses de treinamento para que dados de qualidade satisfatória possam ser esperados. Uma vez aprendida a técnica, as possibilidades com esse método são inúmeras, incluindo o uso de animais doadores transgênicos ou nocaute em relação aos genes de interesse, bem como modelos murinos de doenças hepáticas. Os experimentos podem, no entanto, ser limitados por potenciais efeitos colaterais tóxicos (que provavelmente serão muito mais graves in vivo) ou baixa solubilidade dos compostos de teste. Tais compostos podem ser administrados por via oral aos animais doadores em um período de tempo adequado antes da perfusão.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse relevantes para este artigo.
Acknowledgments
Os estudos e Nicolai J. Wewer Albrechtsen foram apoiados pela Fundação Novo Nordisk Excellence Emerging Investigator Grant - Endocrinologia e Metabologia (Aplicação nº. NNF19OC0055001), European Foundation for the Study of Diabetes Future Leader Award (NNF21SA0072746) e Independent Research Fund Denmark, Sapere Aude (1052-00003B). O Centro de Pesquisa de Proteínas da Fundação Novo Nordisk é apoiado financeiramente pela Fundação Novo Nordisk (Grant agreement NNF14CC0001). A Figura 1B foi criada com biorender.com. Agradecemos ao Dr. Rune E. Kuhre (Novo Nordisk A/S) pelas discussões frutíferas sobre o fígado de camundongo perfundido.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-way stopcock | BD | 394601 | |
| Altromin breeding diet | Altromin Spezialfutter | 1319 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma | C8106 | |
| Catheters (0.7 mm) | BD | 381812 | |
| Filter paper (pore size 2.0 µm) | Millipore | AP2029325 | |
| Glucose kit | QuantiChromTM | DIGL-100 | Low concentration protocol |
| Ketamine | MSD Animal Health | 511485 | 90 mg/kg |
| Ligature (black sterile silk) | Agnthos | 14739 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | 230391 | |
| Non-esterified fatty acids kit | Fujifilm Wako Chemicals | NEFA-HR(2) | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate(KH2PO4) | Merck | 1.04877 | |
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Sleek tape | Mediq danmark | 4001910 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | |
| Thermostatic Circulator | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | Bath Volume 3 L, 230 V/50 Hz |
| Tubing | Tygon | E3603 | Inner diameter 1.59 mm, outer diameter 3.18 mm |
| Universal perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | Basic unit uniper UP-100, type 834 |
| Vamin | Fresenius Kabi | B05ABA01 | Mixed amino acids |
| Vessel clamp adaptor | Deutsche Biomedical | DBC1002 | |
| Vessel clamps | Deutsche Biomedical | DBC1005 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Xylazine | Rompun Vet | 530701 | 10 mg/kg |
References
- Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response. Scientific Reports. 6, 25329 (2016).
- Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
- Seirup, M., et al. Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro. Genomics. 114 (3), 110330 (2022).
- Gupta, R., et al. Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq. Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137 (2021).
- Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX. Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
- Bartošek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. Isolated Liver Perfusion and its Applications. , Raven Press. New York. (1973).
- Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations. Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).
- Mischinger, H. J., et al. An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates. Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).
- Vairetti, M., et al. Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2. Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).
- Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).
- Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -G. Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium. Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).
