Summary
Nous présentons ici une méthode robuste de perfusion in situ du foie de souris pour étudier la régulation aiguë et directe du métabolisme hépatique sans perturber l’architecture hépatique mais en l’absence de facteurs extra-hépatiques.
Abstract
Le foie a de nombreuses fonctions, y compris le métabolisme des nutriments. Contrairement à d’autres modèles in vitro et in vivo de recherche hépatique, le foie perfusé isolé permet d’étudier la biologie et le métabolisme hépatique dans l’ensemble du foie avec une architecture hépatique intacte, séparée de l’influence de facteurs extra-hépatiques. Les perfusions hépatiques ont été développées à l’origine pour les rats, mais la méthode a également été adaptée aux souris. Nous décrivons ici un protocole de perfusion in situ du foie de souris. Le foie est perfusé antérograde à travers la veine porte avec un tampon bicarbonaté oxygéné de Krebs-Henseleit, et la sortie est recueillie à partir de la veine cave inférieure suprahépatique avec serrage de la veine cave inférieure infrahépatique pour fermer le circuit. À l’aide de cette méthode, les effets hépatiques directs d’un composé d’essai peuvent être évalués avec une résolution temporelle détaillée. La fonction hépatique et la viabilité sont stables pendant au moins 3 h, ce qui permet d’inclure des contrôles internes dans la même expérience. Les possibilités expérimentales à l’aide de ce modèle sont nombreuses et peuvent permettre de mieux comprendre la physiologie du foie et les maladies du foie.
Introduction
Le foie est un organe essentiel du métabolisme. Il joue un rôle clé dans le contrôle de l’équilibre énergétique de l’ensemble du corps en régulant le métabolisme du glucose, des lipides et des acides aminés. L’augmentation des maladies du foie dans le monde est en train de devenir un fardeau majeur pour la santé mondiale, et davantage de connaissances sont nécessaires sur la physiopathologie et ses conséquences sur les fonctions hépatiques.
Divers modèles in vitro ont été développés pour la recherche sur le foie afin de compléter les études in vivo. Les hépatocytes primaires isolés et cultivés chez les rongeurs et les humains sont largement utilisés. Les cellules non parenchymateuses peuvent être séparées des hépatocytes par centrifugation différentielle et par gradient, et la co-culture de différents types de cellules est utile pour étudier la diaphonie intercellulaire1. Bien que les hépatocytes humains primaires soient considérés comme l’étalon-or pour tester la toxicité des médicaments, plusieurs études ont montré que les hépatocytes se dédifférencient rapidement dans la culture tissulaire, ce qui entraîne une perte des fonctions hépatiques 2,3,4. La culture d’hépatocytes dans un système sphéroïde 3D améliore la dédifférenciation, est plus stable et semble imiter le foie in vivo à un degré plus élevé que les systèmes de culture 2D traditionnels5. Les tranches de foie découpées avec précision sont un autre modèle in vitro bien établi qui maintient l’architecture tissulaire intacte et contient les cellules non parenchymateuses présentes dans le foie6. Les modèles in vitro plus avancés comprennent le foie sur puce7 et les organoïdes hépatiques8. Cependant, avec toutes ces approches, il y a une perte d’intégrité structurelle et de dynamique de l’écoulement, y compris l’écoulement vectoriel de la veine porte-hépatique, ce qui a probablement un impact sur la généralisabilité.
Le foie de rat isolé a été décrit pour la première fois par Claude Bernard en 18559, et est toujours utilisé dans divers domaines scientifiques pour l’étude de la biologie, de la toxicologie et de la physiopathologie du foie. Les avantages du foie perfusé par rapport aux modèles in vitro mentionnés ci-dessus comprennent le maintien de l’architecture hépatique, du flux vasculaire, de la polarité et de la zonation des hépatocytes, ainsi que des interactions entre les hépatocytes et les cellules non parenchymateuses. Par rapport aux études in vivo, le foie perfusé permet d’étudier le métabolisme hépatique de manière isolée en évitant les facteurs extra-hépatiques transportés par le sang et avec un contrôle complet des conditions expérimentales. Plusieurs modifications ont été apportées pour améliorer le modèle de perfusion hépatique de rat au cours des années10,11,12,13. Bien que des souris aient été utilisées pour des études isolées sur le foie perfusé, moins de littérature est disponible. Nous présentons ici une méthode de perfusion in situ du foie de souris par canulation de la veine porte et de la veine cave suprahépatique inférieure afin d’étudier les réponses métaboliques aiguës et directes aux substrats métaboliques et aux hormones telles que mesurées dans l’effluent veineux hépatique du foie de souris en temps réel.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux ont été menées avec l’autorisation de l’Inspection danoise de l’expérimentation animale, du ministère de l’Environnement et de l’Alimentation du Danemark (permis 2018-15-0201-01397) et du comité d’éthique local conformément à la directive européenne 2010/63/UE, aux National Institutes of Health (publication n° 85-3) et conformément aux directives de la législation danoise régissant l’expérimentation animale (1987). Il s’agit d’une procédure terminale, et la cause du décès est l’exsanguination et la perforation du diaphragme sous anesthésie profonde.
1. Animaux de laboratoire
- Procurez-vous des souris de la variété, de l’âge et du sexe souhaités. Cette étude a utilisé des souris mâles C57BL/6JRj âgées de 11 à 16 semaines. Abritez jusqu’à 5 souris mâles ou 8 souris femelles par cage avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et maintenez un cycle lumière-obscurité de 12 h/12 h avec des lumières allumées de 6 h à 18 h.
2. Préparations préopératoires
- Faire un tampon de perfusion hépatique.
- Tampon de Krebs-Henseleit. Mélanger et dissoudre 118 mmol/L de NaCl, 4,7 mmol/L de KCl, 1,2 mmol/L de MgSO 4 et 1,2 mmol/L de KH 2 PO4 en dH 2 O. Dissoudre 1,25 mmol/L de CaCl2dans un bécher séparé et ajouter le tampon.
- Dissoudre 25 mmol/L de NaHCO3 et ajouter lentement au tampon tout en remuant. Stockez le tampon à 4 degrés. Le tampon est stable pendant au moins 1 mois.
REMARQUE : Des précipitations peuvent se produire si le CaCl2 et le NaHCO3 ne sont pas dissous individuellement avant d’être ajoutés.
- Filtrez le tampon de perfusion à travers un filtre de 2 μm et ajustez le pH à 7,5 à l’aide de HCl.
REMARQUE : Cette étape doit être effectuée le jour de l’expérience, car le pH augmente avec le temps, même lorsqu’il est stocké dans des flacons fermés. - Préparer les composés d’essai à une concentration plus élevée que la concentration finale souhaitée (p. ex., concentration 20x lorsqu’ils sont perfusés à un débit de 0,175 mL/min à l’aide d’une pompe à bras de poing) dans un tampon de perfusion Krebs-Henseleit filtré et dont le pH est ajusté. S’il y a lieu, diluer les composés d’essai dans un tampon de perfusion Krebs-Henseleit additionné de 1 % de BSA comme support (pour éviter l’adhérence aux tubes et à la verrerie, ce qui est essentiel pour tous les peptides), filtrés à travers un filtre de taille appropriée.
3. Fonctionnement et perfusion
REMARQUE : Une illustration de la configuration de perfusion utilisée dans cette étude est fournie à la figure 1.
- Gazer le tampon de perfusion (95 % d’O 2, 5 % de CO2) pendant au moins 30 min pour fournir suffisamment d’oxygène au foie et maintenir le pH correct dès le début de l’opération (le système tampon de bicarbonate atteindra un pH de 7,4 sous gazage continu, voir la figure supplémentaire 1).
- Anesthésier une souris en lui administrant de la kétamine (90 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg) par injection intrapéritonéale.
- Placez la souris en décubitus dorsal sur une table d’opération chauffée et confirmez l’absence de réflexes en réponse au pincement des orteils. Vaporisez de l’éthanol à 70 % pour empêcher les cheveux de coller aux ciseaux. La fixation de la souris sur la surface chaude permet d’augmenter la stabilité pour les procédures suivantes.
- Faites une incision avec des ciseaux à la base de l’abdomen et coupez vers le haut jusqu’à la cage thoracique des deux côtés pour exposer la cavité abdominale. Déplacez les intestins vers la droite à l’aide d’un coton-tige, en exposant la veine porte.
- Placez deux ligatures sous la veine porte à l’aide d’une pince courbe et préparez un nœud lâche pour chaque ligature.
- Insérez un cathéter de 0,7 mm dans la veine porte. Lorsqu’il est perforé, retirez l’aiguille du cathéter et guidez le cathéter dans la veine jusqu’à ce que l’extrémité du cathéter soit proche du foie, comme illustré à la figure 2. Le sang s’écoule dans le cathéter.
- Serrez les ligatures. Si le cathéter n’est pas rempli de sang, remplissez-le avec un tampon de perfusion pour éviter l’introduction d’une bulle d’air.
- Fixez le tube de perfusion et initiez la perfusion du foie avec le tampon bicarbonaté de Krebs-Henseleit à 37 °C en démarrant la pompe à rouleaux à un débit de perfusion de 0,8 mL/min. Le foie pâlit en quelques secondes.
- Coupez la cage thoracique et le diaphragme à l’aide de ciseaux. À ce stade, l’animal est euthanasié. Placez une ligature sous la veine cave inférieure suprahépatique à l’aide d’une pince à pointe fine. Placez un stylo, une gaze roulée ou un autre objet jetable sous le dos de la souris pour rendre la veine plus accessible.
- Insérez un cathéter dans la veine cave inférieure suprahépatique via l’oreillette droite du cœur. Une fois perforé, retirez l’aiguille du cathéter et guidez le cathéter dans la veine jusqu’à ce que l’extrémité du cathéter soit proche du foie. Le tampon de sang et de perfusion s’épuise immédiatement.
- Serrez la ligature et fixez un tube pour la collecte des effluents de perfusion. Fixez tous les tubes avec du ruban adhésif imperméable (ruban adhésif élégant ou similaire).
- Utilisez un adaptateur de pince vasculaire pour placer une pince vasculaire sur la veine cave infrahépatique immédiatement au-dessus de la veine rénale droite afin d’éviter le mélange (Figure 2).
- Augmentez le débit de perfusion à 3,5 mL/min et démarrez une minuterie. Lancez l’enregistrement de la pression. Une perfusion réussie se traduit généralement par une pression de ~10 mm/Hg.
- Couvrez le foie d’un drap stérile imbibé de solution saline et ajoutez du sérum physiologique pendant l’expérience pour éviter qu’il ne se dessèche.
- Recueillir l’effluent de perfusion pendant 1 min et mesurer le volume. Le volume doit être d’environ 3,5 ml/min. Le mélange de sang n’est pas attendu à ce stade et le cœur ne pompe plus.
- Attendez une période d’équilibration de 30 min avant de commencer l’expérience.
Figure 1 : Illustration de la configuration de la perfusion. (A)La table d’opération est surélevée sur un trépied et chauffée à 37 °C. Le tampon de perfusion est gazé (95 % d’O 2, 5 % de CO2), pompé via une pompe péristaltique à rouleaux et chauffé dans l’échangeur de chaleur avec un piège à bulles intégré. Le système se compose en outre d’un manomètre et d’une pompe à broche pour le réglage de la pression de perfusion. La pression de perfusion est enregistrée en continu et visualisée via un transducteur sur un PC, un programme d’enregistrement de la pression. (B) La boîte rouge capture les connexions des robinets d’arrêt à trois voies. Le premier robinet d’arrêt à trois voies est ouvert pour la perfusion d’un composé d’essai via un pousse-seringue, et le second est fermé. Le troisième est ouvert pour les mesures de pression en continu. Le quatrième robinet d’arrêt peut être utilisé pour prélever des échantillons d’entrée, par exemple pour l’analyse des gaz à travers le foie perfusé. Les connecteurs peuvent être modifiés selon les besoins pour des expériences spécifiques nécessitant plus ou moins de lignes de perfusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Photos de la cavité abdominale de la souris avant et pendant la perfusion hépatique. (A)Le point vert indique l’emplacement de l’extrémité du cathéter de la veine porte. Il est important que l’extrémité du cathéter soit positionnée juste en dessous du point de ramification de la veine porte dans les veines portes hépatiques gauche et droite, mais au-dessus de la branche pancréato-duodénale pour éviter les fuites. Le point jaune indique l’emplacement correct de la pince vasculaire sur la veine cave inférieure infrahépatique entre la veine rénale droite et le foie pour éviter le reflux du sang dans le foie perfusé. (B, C) Un foie de souris perfusé avec les deux cathéters insérés dans la veine porte (B) et la veine cave inférieure suprahépatique (C) et la pince vasculaire sur la veine cave inférieure infrahépatique (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
4. Expérimentez
- Commencez l’expérience en prélevant les premiers échantillons de référence à l’aide d’un collecteur de fractions à la fin de la période d’équilibration. Prélevez des échantillons à l’intervalle de temps souhaité et placez-les immédiatement sur de la glace.
- Vérifiez régulièrement le piège à bulles et remplissez-le de tampon de perfusion lorsqu’il est presque vide.
- Prélever un échantillon du tampon à l’aide d’un robinet d’arrêt à trois voies immédiatement avant qu’il n’entre dans l’organe et du cathéter collecteur inséré dans la veine cave inférieure (après qu’il ait été perfusé dans le foie).
- Mesurez les échantillons à l’aide d’un analyseur de gaz du sang pour confirmer que l’organe est métaboliquement actif (indiqué par une augmentation de la pression partielle de CO2 et une diminution du pH).
- Répétez les étapes 4.3 à 4.4 à la fin de l’expérience pour évaluer la viabilité tout au long de l’expérience (figure supplémentaire 2).
REMARQUE : La diminution de la pression partielle d’oxygène ne fournit pas une mesure fiable de la respiration en raison des pertes d’oxygène des tuyaux, de l’organe, etc. - Après 15 minutes de perfusion initiale, commencer la première stimulation en perfusant une substance d’essai à travers un robinet d’arrêt à trois voies au débit désiré à l’aide d’un pousse-seringue (p. ex., concentration de 20 fois la substance d’essai lorsqu’elle est perfusée à un débit de 0,175 mL/min à l’aide d’une pompe à bras de poing). Vous pouvez également remplacer le tampon de référence par un nouveau tampon (oxygéné et chauffé) contenant le composé d’essai dans la concentration finale.
- Arrêtez la stimulation et prélevez des échantillons de base pendant 20 à 30 minutes avant de commencer la deuxième stimulation.
- À la fin de l’expérience, infusez un témoin positif approprié pendant 5 à 10 minutes.
- Après l’expérience, exciser le foie perfusé et le peser pour normaliser le débit au poids du foie. Congeler le foie dans de l’azote liquide pour mesurer la teneur en protéines afin de normaliser la production par rapport à la teneur en protéines.
5. Mesures biochimiques
- Quantifier la concentration de la molécule d’intérêt à l’aide de dosages appropriés pour les mesures dans le tampon de perfusion (tests colorimétriques ou ELISA internes ou disponibles dans le commerce). Le tampon est compatible avec la plupart des techniques basées sur les omiques telles que la métabolomique et la protéomique.
NOTE : Dans cette étude, l’urée a été mesurée sur la base d’un test colorimétrique décrit précédemment14. Le glucose et les acides gras non estérifiés ont été quantifiés à l’aide de trousses disponibles dans le commerce.
6. Analyse des données
- Présentez les données dans des graphiques XY montrant la sortie de sécrétion au fil du temps.
NOTE : L’une des vertus du système de perfusion in vitro est qu’il est possible d’exprimer les données sous forme de débit réel (concentration × débit, par exemple μmol/min) au lieu de la concentration mesurée dans le débit (mmol/L) comme dans les études in vivo . Envisagez de normaliser la sortie en fonction du poids du foie lorsque vous comparez différents modèles murins ou de la teneur totale en protéines (mesurée par BCA) lorsque vous comparez des souris témoins à des modèles de souris souffrant d’obésité ou de maladies du foie, où une augmentation du poids du foie peut être due à une augmentation de la teneur en graisse. - Présenter les données récapitulatives sous forme de points individuels par animal représentant la production moyenne ou totale au cours de la ligne de base et sur une période de stimulation (généralement de 15 à 30 minutes) ou la production incrémentielle en utilisant la ligne de base précédente pour chaque période de stimulation en fonction de la conception de l’étude.
- Analysez les données à l’aide d’un test t apparié (deux groupes) ou d’une ANOVA à un facteur avec des stimulations répétées (plus de deux groupes) avec un test post-hoc approprié pour les tests multiples.
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Representative Results
Une base de référence stable est nécessaire pour déterminer si un stimulus ou un substrat conduit à la libération de la molécule d’intérêt. La figure 3A montre un exemple d’expérience réussie. La production d’urée dans le foie perfusé est mesurée à des intervalles de 2 minutes et indiquée sous forme de moyenne ± MEB. Les périodes de référence précédant chacune des deux périodes de stimulation sont stables. La production moyenne d’urée au cours des deux périodes de stimulation et les valeurs de référence respectives précédentes sont indiquées à la figure 3B. La signification statistique entre les périodes a été testée à l’aide d’une ANOVA à un facteur avec des mesures répétées. Sur la base de ces résultats, on peut conclure que la réponse de l’urée à deux stimulations consécutives avec des acides aminés mixtes est similaire, ce qui constitue une expérience de contrôle importante dans l’évaluation des stimulations répétées avec différentes doses ou composés d’essai.
En plus de l’uréagénèse, il est possible d’étudier la glycogénolyse hépatique et la lipolyse en utilisant le protocole ci-dessus. La figure 3C-F montre les données d’une expérience distincte lors d’une perfusion de glucagon. La libération de glucose (figure 3C) et d’acides gras non estérifiés (NEFA) (figure 3E) a été mesurée par périodes de 4 minutes. Une libération basale régulière de glucose (Figure 3C) et de NEFA (Figure 3E) est observée avant une forte augmentation du glucose et de l’AENF pendant la perfusion de glucagon, respectivement. Sur la base des valeurs moyennes à l’état basal et pendant la perfusion de glucagon, on peut conclure que le glucagon stimule rapidement la glycogénolyse hépatique (Figure 3D) et la lipolyse (Figure 3F).
La figure 4 montre un exemple d’expériences apparemment infructueuses. La libération basale d’urée est instable et les périodes de stimulation sont trop proches les unes des autres pour que la production d’urée revienne aux niveaux basaux avant le début de la stimulation suivante. En l’absence de périodes basales stables, il n’est pas possible de distinguer une réponse à l’urée d’une autre. À partir de ces données, il est impossible de conclure si différentes concentrations de glucose influencent l’uréagénèse induite par les acides aminés dans le foie de souris perfusé. Les protocoles expérimentaux devraient plutôt être conçus avec 20 à 30 minutes de périodes de référence entre deux stimulations consécutives pour atteindre une ligne de base stable avant chaque période de stimulation.
Figure 3 : Données de bonne qualité provenant du foie de souris perfusé. (A,B) L’urée totale est indiquée dans des conditions basales et en réponse à des périodes d’administration d’acides aminés mixtes (10 mM) et de glucose (6 mM). Les données sont présentées sous la forme (A) de la moyenne ± SEM et (B) des valeurs moyennes au cours de chaque stimulation et de la période basale précédente (chaque point représente une souris), n = 6. (C, D) Les débits totaux de glucose et d’acides gras libres non estérifiés (EFE) (E,F) sont indiqués dans les conditions basales et la réponse à l’administration de glucagon (10 nM). Les données sont présentées sous la forme d’une moyenne (C,E) ± SEM et d’une moyenne (D,F) pendant la période basale et la période de stimulation (chaque point représente une souris), n = 6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Données de mauvaise qualité provenant du foie de souris perfusé. La production totale d’urée est indiquée dans des conditions basales en réponse à des acides aminés mixtes (10 mM) et à des concentrations décroissantes de glucose (18 mM, 12 mM, 6 mM, 3 mM et 0 mM). Les données sont présentées sous la forme d’une moyenne ± MEB, n = 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Pression partielle d’oxygène et de dioxyde de carbone et pH en fonction du temps dans un tampon bicarbonaté de Krebs-Henseleit pendant le gazage avec 95 % d’O 2 + 5 % de CO2. (A) Pression partielle d’oxygène, (B) dioxyde de carbone et (C) pH dans des échantillons de tampon de perfusion de Krebs-Henseleit (pH non ajusté avant l’expérience) prélevés après avoir traversé le système de perfusion à des points de temps indiqués après le début du gazage avec 95 % d’O 2 + 5 % de CO2. Des échantillons de tampon de perfusion ont été mesurés à l’aide d’un analyseur de gaz du sang. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
Figure 2 supplémentaire : Changements de la pression partielle d’oxygène et de dioxyde de carbone et du pH dans le foie perfusé. (A) Pression partielle d’oxygène, (B) dioxyde de carbone et (C) pH dans des échantillons de tampon de perfusion de Krebs-Henseleit prélevés immédiatement avant d’atteindre le foie et après avoir été perfusés au foie à 1 min et 180 min dans une expérience. Les échantillons de perfusion ont été mesurés à l’aide d’un analyseur des gaz du sang. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. **P < 0,01, ****P < 0,0001 par plusieurs tests t appariés corrigés pour des tests multiples à l’aide de la méthode de Holm-Sidak. n = 14. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.
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Discussion
Le foie de souris perfusé isolé est un outil de recherche puissant pour l’étude de la dynamique et des mécanismes moléculaires du métabolisme hépatique. La possibilité de prélever des échantillons minute par minute permet d’évaluer en détail l’effet direct d’un composé d’essai sur le foie. Par rapport aux études in vivo, le foie perfusé permet d’étudier le métabolisme hépatique de manière isolée en évitant les facteurs extra-hépatiques transportés par le sang et avec une maîtrise totale des conditions expérimentales. Les avantages de la perfusion hépatique par rapport aux études in vitro utilisant des hépatocytes isolés sont le maintien de l’architecture hépatique, de la polarité, de la division zonale et de l’intégrité vasculaire. Un autre avantage de la perfusion hépatique est le grand volume d’échantillon (3,5 mL/min), permettant de mesurer plusieurs résultats dans le même échantillon. Le foie perfusé n’est cependant pas idéal pour étudier les effets dépendant de la régulation transcriptionnelle, car de tels mécanismes peuvent prendre plusieurs heures à se produire. En plus de la recherche métabolique, le protocole peut être appliqué dans d’autres domaines de recherche pour étudier les fonctions endocriniennes du foie (sécrétion d’hormones et d’hépatokines) et le métabolisme hépatique des médicaments et des xénobiotiques.
L’étape la plus critique pour cette méthode est la mise en place du cathéter dans la veine porte. Il est important que l’extrémité du cathéter soit positionnée immédiatement avant le point de dérivation de la veine porte dans les veines portes hépatiques gauche et droite (Figure 2). Si l’extrémité du cathéter est poussée trop loin, seule une partie du foie sera correctement perfusée. S’il est placé trop bas dans la veine porte, une fuite à travers la branche pancréato-duodénale peut se produire. La mise en place du deuxième cathéter pour le prélèvement est moins urgente puisque le foie à ce stade est déjà perfusé avec le tampon oxygéné. Lorsque l’opération a été effectuée avec succès, le foie respire et réagit pendant au moins 3 h avec une pression et un débit de perfusion constants (Figure supplémentaire 2). À ce stade, l’évitement des bulles d’air dans le système de perfusion est le facteur le plus important pour une expérience réussie. Les bulles d’air sont difficiles à éviter complètement car le tampon est continuellement gazé avec de l’oxygène, mais les bulles doivent être piégées dans le piège à bulles du système de perfusion. Il est donc important de garder un œil sur le piège à bulles et de le remplir de tampon de perfusion lorsqu’il est presque vide.
Le tampon de Krebs-Henseleit (KHB) est la solution la plus utilisée pour les perfusions hépatiques13. La formulation classique contient 2,5 mmol/L de CaCl 2, mais sur la base d’une étude antérieure montrant que le calcium contribue aux dommages mitochondriaux, nous utilisons un tampon avec seulement 1,25 mmol/L de CaCl212. L’ajout d’érythrocytes, d’albumine ou de glucose au tampon n’est pas nécessaire11. Le tampon proposé permet également le profilage moléculaire à l’aide de techniques biochimiques avancées telles que la métabolomique basée sur la spectrométrie de masse. Différentes concentrations d’un composé d’essai peuvent être testées pour déterminer la dose optimale et pour évaluer les effets physiologiques par rapport aux effets pharmacologiques. Dans les expériences menées dans cette étude, 10 mM AA se situe dans la fourchette physiologique haute correspondant aux niveaux postprandials, tandis que 10 nM de glucagon correspond à une dose pharmacologique. Comme le montre la figure 4, il est essentiel d’inclure une période de référence de 20 à 30 minutes entre deux stimulations consécutives pour pouvoir comparer la dynamique et les mécanismes moléculaires des réponses respectives.
Il est important d’éviter la présence de sang dans les échantillons de perfusat, car cela pourrait interférer avec les analyses ultérieures, par exemple la détermination colorimétrique des concentrations d’urée et de glucose. Si du sang apparaît dans les échantillons prélevés après ~15 min dans la période d’équilibration, lorsqu’une valve à 3 voies est ouverte pour les perfusions ou lorsque le piège à bulles est rempli, la pince du vaisseau sur la veine cave infrahépatique n’est probablement pas placée correctement.
D’après notre expérience, une opération réussie se traduit par une pression portale stable de ~10 mmHg et un débit de sortie de 3,5 mL/min quelques minutes après l’insertion du cathéter collecteur. Si la pression est considérablement plus élevée ou augmente continuellement, ou si le débit de sortie collecté n’est pas de 3,5 mL/min ou diminue continuellement, plusieurs événements doivent être envisagés : 1) Tous les lobes hépatiques sont-ils également perfusés et présentent-ils une couleur pâle uniforme ? Si ce n’est pas le cas, il se peut qu’une occlusion se soit produite (souvent une bulle d’air ; « masser » soigneusement le lobe hépatique avec un bâtonnet de coton ; cela aide parfois à libérer la bulle d’air par laquelle la pression diminuera immédiatement), ou le cathéter de la veine porte a été poussé trop haut vers le haut, n’alimentant ainsi qu’une seule des deux branches de la veine porte hépatique (essayez prudemment de tirer le cathéter de quelques millimètres). 2) La veine cave inférieure suprahépatique est-elle tordue ? Cela peut se produire lors de la fixation de la partie mâle du tube collecteur à la partie femelle du cathéter inséré dans la veine ; Retirez avec précaution le tube collecteur et observez si la pression chute. 3) Le cathéter collecteur est-il poussé trop loin dans la veine cave inférieure suprahépatique de sorte que l’extrémité du cathéter s’est coincée dans le foie ? Rétractez prudemment de quelques millimètres si nécessaire.
En résumé, le foie de souris perfusé est un modèle expérimental in vitro physiologiquement pertinent qui peut être utilisé pour étudier les effets dynamiques d’un composé donné sur le foie. La qualité de l’opération est critique pour la qualité des données obtenues, et d’après notre expérience, il faut ~2 mois d’entraînement avant que l’on puisse s’attendre à des données de qualité satisfaisante. Une fois la technique apprise, les possibilités de cette méthode sont nombreuses, y compris l’utilisation d’animaux donneurs transgéniques ou knock-out concernant les gènes d’intérêt ainsi que des modèles murins de maladies du foie. Les expériences peuvent toutefois être limitées par des effets secondaires toxiques potentiels (qui sont susceptibles d’être beaucoup plus graves in vivo) ou par une faible solubilité des composés d’essai. Ces composés peuvent être administrés par voie orale aux animaux donneurs à un moment approprié avant la perfusion.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts en rapport avec cet article.
Acknowledgments
Les études et Nicolai J. Wewer Albrechtsen ont été financées par la Novo Nordisk Foundation Excellence Emerging Investigator Grant - Endocrinology and Metabolism (demande no. NNF19OC0055001), le prix Future Leader de la Fondation européenne pour l’étude du diabète (NNF21SA0072746) et le Fonds de recherche indépendant du Danemark, Sapere Aude (1052-00003B). Le Centre de recherche sur les protéines de la Fondation Novo Nordisk est soutenu financièrement par la Fondation Novo Nordisk (accord de subvention NNF14CC0001). La figure 1B a été créée avec biorender.com. Nous remercions le Dr Rune E. Kuhre (Novo Nordisk A/S) pour ses discussions fructueuses sur le foie de souris perfusé.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-way stopcock | BD | 394601 | |
| Altromin breeding diet | Altromin Spezialfutter | 1319 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma | C8106 | |
| Catheters (0.7 mm) | BD | 381812 | |
| Filter paper (pore size 2.0 µm) | Millipore | AP2029325 | |
| Glucose kit | QuantiChromTM | DIGL-100 | Low concentration protocol |
| Ketamine | MSD Animal Health | 511485 | 90 mg/kg |
| Ligature (black sterile silk) | Agnthos | 14739 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | 230391 | |
| Non-esterified fatty acids kit | Fujifilm Wako Chemicals | NEFA-HR(2) | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate(KH2PO4) | Merck | 1.04877 | |
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Sleek tape | Mediq danmark | 4001910 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | |
| Thermostatic Circulator | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | Bath Volume 3 L, 230 V/50 Hz |
| Tubing | Tygon | E3603 | Inner diameter 1.59 mm, outer diameter 3.18 mm |
| Universal perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | Basic unit uniper UP-100, type 834 |
| Vamin | Fresenius Kabi | B05ABA01 | Mixed amino acids |
| Vessel clamp adaptor | Deutsche Biomedical | DBC1002 | |
| Vessel clamps | Deutsche Biomedical | DBC1005 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Xylazine | Rompun Vet | 530701 | 10 mg/kg |
References
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