Summary
Hier presenteren we een robuuste methode voor in situ perfusie van de muizenlever om de acute en directe regulatie van het levermetabolisme te bestuderen zonder de leverarchitectuur te verstoren, maar in afwezigheid van extra-hepatische factoren.
Abstract
De lever heeft tal van functies, waaronder het metabolisme van voedingsstoffen. In tegenstelling tot andere in vitro en in vivo modellen van leveronderzoek, maakt de geïsoleerde geperfuseerde lever de studie van de leverbiologie en het metabolisme in de hele lever mogelijk met een intacte leverarchitectuur, gescheiden van de invloed van extra-hepatische factoren. Leverperfusies zijn oorspronkelijk ontwikkeld voor ratten, maar de methode is ook aangepast aan muizen. Hier beschrijven we een protocol voor in situ perfusie van de muizenlever. De lever wordt antegrade geperfundeerd door de poortader met zuurstofrijke Krebs-Henseleit bicarbonaatbuffer, en de output wordt verzameld uit de suprahepatische inferieure vena cava met klemming van de infrahepatische inferieure vena cava om het circuit te sluiten. Met behulp van deze methode kunnen de directe levereffecten van een teststof worden geëvalueerd met een gedetailleerde tijdresolutie. De leverfunctie en levensvatbaarheid zijn stabiel gedurende ten minste 3 uur, waardoor interne controles in hetzelfde experiment kunnen worden opgenomen. De experimentele mogelijkheden met behulp van dit model zijn talrijk en kunnen inzicht geven in leverfysiologie en leverziekten.
Introduction
De lever is een essentieel orgaan in de stofwisseling. Het speelt een sleutelrol bij de controle van de energiebalans van het hele lichaam door het glucose-, lipiden- en aminozuurmetabolisme te reguleren. De toename van leverziekten wereldwijd ontpopt zich als een grote wereldwijde gezondheidslast en er is meer kennis nodig over de pathofysiologie en de gevolgen daarvan voor de leverfuncties.
Er zijn verschillende in vitro modellen ontwikkeld voor onderzoek op de lever als aanvulling op in vivo studies. Geïsoleerde en gekweekte primaire hepatocyten van knaagdieren en mensen worden veel gebruikt. Niet-parenchymale cellen kunnen worden gescheiden van hepatocyten met behulp van differentiële en gradiëntcentrifugatie, en de co-cultuur van verschillende celtypen is nuttig voor het bestuderen van intercellulaire overspraak1. Hoewel primaire menselijke hepatocyten worden beschouwd als de gouden standaard voor het testen van de toxiciteit van geneesmiddelen, hebben verschillende onderzoeken aangetoond dat de hepatocyten snel dedifferentiëren in weefselkweek, wat resulteert in verlies van leverfuncties 2,3,4. Hepatocytenkweek in een 3D-sferoïde systeem verbetert de dedifferentiatie, is stabieler en lijkt de lever in vivo in hogere mate na te bootsen dan de traditionele 2D-kweeksystemen. Nauwkeurig gesneden leverplakken zijn een ander goed ingeburgerd in-vitromodel dat de weefselarchitectuur intact houdt en de niet-parenchymale cellen bevat die in de lever aanwezig zijn6. Meer geavanceerde in vitro modellen zijn onder meer lever-op-een-chip7 en leverorganoïden8. Bij al deze benaderingen is er echter een verlies van structurele integriteit en stromingsdynamiek, inclusief vectoriële portale leveraderstroom, wat waarschijnlijk van invloed is op de generaliseerbaarheid.
De geïsoleerde geperfuseerde rattenlever werd voor het eerst beschreven door Claude Bernard in 18559 en wordt nog steeds gebruikt op verschillende wetenschappelijke gebieden voor studies van leverbiologie, toxicologie en pathofysiologie. Voordelen van de geperfuseerde lever ten opzichte van de bovengenoemde in vitro modellen zijn onder meer het behoud van de leverarchitectuur, de vasculaire flow, de polariteit en zonering van de hepatocyten, en de interacties tussen hepatocyten en niet-parenchymale cellen. In vergelijking met in vivo studies maakt de geperfuseerde lever het mogelijk om het levermetabolisme op een geïsoleerde manier te bestuderen, waarbij extra-hepatische factoren die door het bloed worden gedragen, worden vermeden en met volledige controle over de experimentele omstandigheden. Er zijn in de loop der jaren verschillende wijzigingen aangebracht om het perfusiemodel van de lever van ratten te verbeteren10,11,12,13. Hoewel muizen zijn gebruikt voor geïsoleerde geperfuseerde leverstudies, is er minder literatuur beschikbaar. Hier presenteren we een methode voor in situ perfusie van de muizenlever door canulatie van de poortader en de suprahepatische vena cava inferior om de acute en directe metabole reacties op metabole substraten en hormonen te bestuderen zoals gemeten in het hepatische veneuze effluent van de muizenlever in real-time.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd met toestemming van de Deense inspectie voor dierproeven, het Ministerie van Milieu en Voedsel van Denemarken (vergunning 2018-15-0201-01397) en de lokale ethische commissie in overeenstemming met de EU-richtlijn 2010/63/EU, de National Institutes of Health (publicatie nr. 85-3) en volgens de richtlijnen van de Deense wetgeving inzake dierproeven (1987). Dit is een terminale procedure en de doodsoorzaak is verbloeding en perforatie van het middenrif onder diepe anesthesie.
1. Proefdieren
- Zorg voor muizen van de gewenste stam, leeftijd en geslacht. In deze studie werd gebruik gemaakt van mannelijke C57BL/6JRj-muizen in de leeftijd van 11-16 weken. Huisvest maximaal 5 mannelijke of 8 vrouwelijke muizen per kooi met ad libitum toegang tot voer en water en handhaaf een licht-donkercyclus van 12 uur/12 uur met lichten aan van 6 uur 's ochtends tot 6 uur 's avonds.
2. Preoperatieve voorbereidingen
- Maak een leverperfusiebuffer.
- Krebs-Henseleit Buffer. Meng en los 118 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgSO 4 en 1,2 mmol/LKH2 PO4 op in dH 2 O. Los 1,25 mmol/L CaCl2 op in een apart bekerglas en voeg de buffer toe.
- Los 25 mmol/L NaHCO3 op en voeg al roerend langzaam toe aan de buffer. Bewaar de buffer bij 4 graden. De buffer is minimaal 1 maand stabiel.
OPMERKING: Neerslag kan optreden als CaCl2 en NaHCO3 niet afzonderlijk worden opgelost voordat ze worden toegevoegd.
- Filtreer de perfusiebuffer door een filter van 2 μm en stel de pH in op 7,5 met HCl.
OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd op de experimentele dag, aangezien de pH in de loop van de tijd toeneemt, zelfs wanneer deze in gesloten kolven wordt bewaard. - Bereid testverbindingen in een hogere concentratie dan de gewenste eindconcentratie (bijv. 20x concentratie bij toediening met een snelheid van 0,175 ml/min via een zijarmpomp) in gefilterde en pH-aangepaste Krebs-Henseleit-perfusiebuffer. Verdun, indien relevant, de teststoffen in de perfusiebuffer van Krebs-Henseleit, waaraan 1% BSA als drager is toegevoegd (om hechting aan slangen en glaswerk te voorkomen, essentieel voor alle peptiden), gefilterd door een filter van geschikte grootte.
3. Werking en perfusie
OPMERKING: Een illustratie van de perfusie-opstelling die in dit onderzoek is gebruikt, wordt weergegeven in figuur 1.
- Vergas de perfusiebuffer (95% O 2, 5% CO2) gedurende ten minste 30 minuten om de lever van voldoende zuurstof te voorzien en om de juiste pH te handhaven vanaf het begin van de operatie (het bicarbonaatbuffersysteem bereikt een pH van 7,4 bij continue vergassing, zie aanvullende figuur 1).
- Verdoof een muis door ketamine (90 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) toe te dienen via intraperitoneale injectie.
- Plaats de muis op rugligging op een verwarmde operatietafel en bevestig het gebrek aan reflexen als reactie op de teenknijp. Spray met 70% ethanol om te voorkomen dat het haar aan de schaar blijft plakken. Door de muis op het warme oppervlak te bevestigen, wordt de stabiliteit voor de volgende procedures vergroot.
- Maak een incisie met een schaar aan de basis van de buik en knip aan beide kanten naar boven tot aan de ribbenkast om de buikholte bloot te leggen. Beweeg de darmen naar rechts met behulp van een wattenstaafje, waardoor de poortader bloot komt te liggen.
- Plaats twee ligaturen onder de poortader met behulp van een gebogen pincet en maak voor elke ligatuur een losse knoop.
- Breng een katheter van 0,7 mm in de poortader in. Verwijder bij perforatie de naald uit de katheter en leid de katheter door de ader totdat de punt van de katheter zich dicht bij de lever bevindt, zoals geïllustreerd in afbeelding 2. Er stroomt bloed in de katheter.
- Draai de ligaturen vast. Als de katheter niet met bloed is gevuld, vul deze dan met perfusiebuffer om te voorkomen dat er een luchtbel ontstaat.
- Bevestig de perfusiebuis en start de perfusie van de lever met Krebs-Henseleit bicarbonaatbuffer bij 37 °C door de rolpomp te starten met een perfusiedebiet van 0,8 ml/min. De lever wordt binnen enkele seconden bleek.
- Knip de ribbenkast en het middenrif af met een schaar. Op dit punt wordt het dier geëuthanaseerd. Plaats een ligatuur onder de suprahepatische inferieure vena cava met behulp van een fijne puntpincet. Plaats een pen, opgerold gaasje of een ander wegwerpartikel onder de achterkant van de muis om de ader toegankelijker te maken.
- Breng een katheter in de suprahepatische vena cava inferior in via het rechter atrium van het hart. Verwijder na perforatie de naald uit de katheter en leid de katheter door de ader totdat de punt van de katheter zich dicht bij de lever bevindt. Bloed- en perfusiebuffer raken onmiddellijk op.
- Draai de ligatuur vast en bevestig een buis voor het opvangen van perfusie-effluent. Zet alle buizen vast met waterdichte tape (gladde tape of iets dergelijks).
- Gebruik een vaatklemadapter om een vaatklem over de infrahepatische vena cava direct boven de rechter nierader te plaatsen om vermenging te voorkomen (Figuur 2).
- Verhoog het perfusiedebiet tot 3,5 ml/min en start een timer. Start de drukregistratie. Succesvolle perfusie resulteert meestal in een druk van ~10 mm/Hg.
- Bedek de lever met een steriel laken bevochtigd met zoutoplossing en voeg tijdens het experiment zoutoplossing toe om te voorkomen dat deze uitdroogt.
- Vang het perfusie-effluent gedurende 1 minuut op en meet het volume. Het volume moet ongeveer 3,5 ml/min zijn. Bijmenging van bloed wordt in dit stadium niet verwacht en het hart pompt niet meer.
- Wacht op een evenwichtsperiode van 30 minuten voordat u met het experiment begint.
Figuur 1: Een illustratie van de perfusie-opstelling. (A)De operatietafel wordt op een statief geplaatst en verwarmd tot 37 °C. De perfusiebuffer wordt vergast (95% O 2, 5 % CO2 ), verpompt via een peristaltische rolpomp en verwarmd in de warmtewisselaar met een ingebouwde bellenvanger. Het systeem bestaat verder uit een manometer en spindelpomp voor het instellen van de perfusiedruk. De perfusiedruk wordt continu geregistreerd en gevisualiseerd via een transducer op een pc, een drukregistratieprogramma. (B) Het rode vak vangt de aansluitingen van driewegafsluitkranen op. De eerste driewegkraan is open voor de infusie van een teststof via een spuitpomp, en de tweede is gesloten. De derde staat open voor continue drukmetingen. De vierde kraan kan worden gebruikt om inputmonsters te verzamelen, bijvoorbeeld voor gasanalyse over de geperfuseerde lever. De connectoren kunnen naar behoefte worden aangepast voor specifieke experimenten waarvoor meer of minder infuusleidingen nodig zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Foto's van de buikholte van de muis voor en tijdens de leverperfusie. (A)De groene stip geeft de locatie aan van de punt van de poortaderkatheter. Het is belangrijk dat de punt van de katheter zich net onder het vertakkingspunt van de poortader in de linker en rechter portale aders van de lever bevindt, maar boven de pancreato-twaalfvingerige darmtak om lekkage te voorkomen. De gele stip geeft de juiste locatie aan van de vaatklem op de infrahepatische inferieure vena cava tussen de rechter nierader en de lever om terugstroming van bloed in de geperfuseerde lever te voorkomen. (B, C) Een geperfuseerde muizenlever met de twee katheters ingebracht in de poortader (B) en suprahepatische inferieure vena cava (C) en de vaatklem op de infrahepatische inferieure vena cava (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Experimenteer
- Start het experiment door aan het einde van de evenwichtsperiode de eerste basismonsters te verzamelen met behulp van een fractiecollector. Verzamel monsters met het gewenste tijdsinterval en plaats ze onmiddellijk op ijs.
- Controleer de bellenvanger regelmatig en vul deze opnieuw met perfusiebuffer als deze bijna leeg is.
- Verzamel een monster van de buffer via een driewegkraan onmiddellijk voordat deze het orgaan binnenkomt en van de opvangkatheter die in de inferieure vena cava is ingebracht (nadat deze door de lever is geperfuseerd).
- Meet de monsters met een bloedgasanalysator om te bevestigen dat het orgaan metabolisch actief is (aangegeven door een toename van de partiële druk van CO2 en een verlaging van de pH).
- Herhaal stap 4.3-4.4 aan het einde van het experiment om de levensvatbaarheid gedurende het hele experiment te beoordelen (aanvullende figuur 2).
OPMERKING: De afname van de partiële zuurstofdruk biedt geen betrouwbare maatstaf voor de ademhaling vanwege het verlies van zuurstof uit slangen, het orgaan enz. - Start na 15 minuten basislijnperfusie de eerste stimulatie door een teststof via een driewegkraan toe te dienen met het gewenste debiet met behulp van een spuitpomp (bijv. 20x de concentratie van de teststof bij toediening met een snelheid van 0,175 ml/min via een zijarmpomp). U kunt ook de basisbuffer vervangen door een nieuwe (zuurstofrijke en verwarmde) buffer die de teststof in de eindconcentratie bevat.
- Stop de stimulatie en verzamel basislijnmonsters gedurende 20-30 minuten voordat u met de tweede stimulatie begint.
- Aan het einde van het experiment gedurende 5-10 minuten een geschikte positieve controle toedienen.
- Snijd na het experiment de geperfuseerde lever weg en weeg deze om de output te normaliseren tot levergewicht. Vries de lever snel in vloeibare stikstof in voor mogelijke meting van het eiwitgehalte om de output naar eiwitgehalte te normaliseren.
5. Biochemische metingen
- Kwantificeer de concentratie van het betreffende molecuul met behulp van tests die geschikt zijn voor metingen in perfusiebuffer (interne of in de handel verkrijgbare colorimetrische of ELISA-tests). De buffer is compatibel met de meeste op omics gebaseerde technieken zoals metabolomics en proteomics.
OPMERKING: In deze studie werd ureum gemeten op basis van een colorimetrische test die eerder is beschreven14. Glucose en niet-veresterde vetzuren werden gekwantificeerd met behulp van in de handel verkrijgbare kits.
6. Data-analyse
- Presenteer de gegevens in XY-grafieken die de secretoire output in de loop van de tijd laten zien.
OPMERKING: Het is een van de voordelen van het in-vitroperfusiesysteem dat het mogelijk is om gegevens uit te drukken als de werkelijke output (concentratie × stroomsnelheid, bijv. μmol/min) in plaats van de gemeten concentratie in de output (mmol/L) zoals in in vivo studies. Overweeg om de output te normaliseren naar het levergewicht bij het vergelijken van verschillende muismodellen of naar het totale eiwitgehalte (gemeten door BCA) bij het vergelijken van controlemuizen met muismodellen met obesitas of leverziekten waarbij een toename van het levergewicht te wijten kan zijn aan een verhoogd vetgehalte. - Presenteer samenvattende gegevens als individuele stippen per dier die de gemiddelde of totale output vertegenwoordigen tijdens de uitgangswaarde en gedurende een stimulatieperiode (meestal 15-30 min) of incrementele output met behulp van de voorgaande basislijn voor elke stimulatieperiode, afhankelijk van de onderzoeksopzet.
- Analyseer de gegevens met behulp van een gepaarde t-test (twee groepen) of eenrichtings-ANOVA met herhaalde stimulaties (meer dan twee groepen) met een geschikte post-hoctest voor meervoudige tests.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een stabiele basislijn is nodig om te bepalen of een stimulus of substraat leidt tot het vrijkomen van het betreffende molecuul. Figuur 3A toont een voorbeeld van een succesvol experiment. De productie van ureum in de geperfuseerde lever wordt gemeten met tussenpozen van 2 minuten en weergegeven als gemiddelde ± SEM. De basisperioden voorafgaand aan elk van de twee stimulatieperioden zijn stabiel. De gemiddelde ureumproductie tijdens de twee stimulatieperioden en de respectievelijke voorafgaande uitgangswaarden zijn weergegeven in figuur 3B. Statistische significantie tussen de perioden werd getest met behulp van eenrichtings-ANOVA met herhaalde metingen. Op basis van deze resultaten kan worden geconcludeerd dat de ureumrespons op twee opeenvolgende stimulaties met gemengde aminozuren vergelijkbaar is, wat een belangrijk controle-experiment is bij het evalueren van herhaalde stimulaties met verschillende doses of testverbindingen.
Naast ureagenese is het mogelijk om leverglycogenolyse en lipolyse te bestuderen met behulp van het bovenstaande protocol. Figuur 3C-F toont gegevens van een afzonderlijk experiment tijdens een infusie met glucagon. De afgifte van glucose (Figuur 3C) en de niet-veresterde vetzuren (NEFA) (Figuur 3E) werd gemeten in perioden van 4 minuten. Een gestage basale afgifte van glucose (Figuur 3C) en NEFA (Figuur 3E) wordt waargenomen voorafgaand aan een robuuste toename van glucose en NEFA tijdens respectievelijk de glucagon-infusie. Op basis van de gemiddelde waarden in de basale toestand en tijdens de glucagon-infusie kan worden geconcludeerd dat glucagon snel de leverglycogenolyse (Figuur 3D) en lipolyse (Figuur 3F) stimuleert.
Figuur 4 toont een voorbeeld van ogenschijnlijk mislukte experimenten. De basale afgifte van ureum is onstabiel en de stimulatieperioden liggen te dicht bij elkaar om de ureumproductie terug te laten keren naar basale niveaus voordat de volgende stimulatie begint. Zonder stabiele basale perioden is het niet mogelijk om de ene ureumrespons van de andere te onderscheiden. Uit deze gegevens is het onmogelijk om te concluderen of verschillende glucoseconcentraties de aminozuurgeïnduceerde ureagenese in de geperfuseerde muizenlever beïnvloeden. In plaats daarvan moeten experimentele protocollen worden ontworpen met 20-30 minuten basislijnperioden tussen twee opeenvolgende stimulaties om vóór elke stimulatieperiode een stabiele basislijn te bereiken.
Figuur 3: Gegevens van goede kwaliteit van de geperfuseerde muizenlever. (A,B) Het totaal ureum wordt weergegeven tijdens basale omstandigheden en als reactie op perioden van toediening van gemengde aminozuren (10 mM) en glucose (6 mM). De gegevens worden weergegeven als (A) gemiddelde ± SEM en (B) gemiddelde waarden tijdens elke stimulatie en voorafgaande basale periode (elke stip vertegenwoordigt een muis), n = 6. (C, D) De totale output van glucose en (E,F) niet-veresterde vrije vetzuren (NEFA) wordt weergegeven in basale omstandigheden en respons op de toediening van glucagon (10 nM). De gegevens worden gepresenteerd als (C,E) gemiddelde ± SEM en (D,F) gemiddelde waarden tijdens de basale en stimulatieperiode (elke stip vertegenwoordigt een muis), n = 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Gegevens van slechte kwaliteit van de geperfuseerde muizenlever. De totale ureumproductie wordt weergegeven in basale omstandigheden als reactie op gemengde aminozuren (10 mM) en afnemende glucoseconcentraties (18 mM, 12 mM, 6 mM, 3 mM en 0 mM). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM, n = 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Tijdsafhankelijke partiële druk van zuurstof en kooldioxide en pH in Krebs-Henseleit bicarbonaatbuffer tijdens begassing met 95% O 2 + 5 % CO2. (A) Partiële zuurstofdruk, (B) kooldioxide en (C) pH in monsters van Krebs-Henseleit-perfusiebuffer (pH niet aangepast voorafgaand aan het experiment) verzameld nadat ze op aangegeven tijdstippen na het begin van de vergassing door het perfusiesysteem zijn gelopen met 95% O 2 + 5 % CO2. Perfusiebuffermonsters werden gemeten met een bloedgasanalysator. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Veranderingen in partiële druk van zuurstof en kooldioxide en pH over de geperfuseerde lever. (A) Partiële zuurstofdruk, (B) kooldioxide en (C) pH in monsters van Krebs-Henseleit-perfusiebuffer die zijn verzameld onmiddellijk voordat ze de lever bereiken en nadat de geperfuseerde lever na 1 minuut en 180 minuten in een experiment is gepasseerd. Perfusiemonsters werden gemeten met een bloedgasanalysator. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. **P < 0,01, ****P < 0,0001 door meerdere gepaarde t-tests gecorrigeerd voor meervoudige tests met behulp van de Holm-Sidak-methode. n = 14. Klik hier om deze afbeelding te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De geïsoleerde geperfuseerde muizenlever is een sterk onderzoeksinstrument voor studies van de dynamiek en moleculaire mechanismen van het levermetabolisme. De mogelijkheid om monsters van minuut tot minuut te nemen, biedt een gedetailleerde evaluatie van het directe effect van een teststof op de lever. In vergelijking met in vivo studies stelt de geperfuseerde lever ons in staat om het levermetabolisme op een geïsoleerde manier te bestuderen, waarbij extra-hepatische factoren die door het bloed worden gedragen worden vermeden en met volledige controle over de experimentele omstandigheden. De voordelen van leverperfusie in vergelijking met in vitro studies met geïsoleerde hepatocyten zijn het behoud van de leverarchitectuur, polariteit, zonale verdeling en vasculaire integriteit. Een ander voordeel van leverperfusie is de grote steekproefomvang (3,5 ml/min), waardoor meerdere uitkomsten in hetzelfde monster kunnen worden gemeten. De geperfuseerde lever is echter niet ideaal bij het bestuderen van effecten die afhankelijk zijn van transcriptionele regulatie, aangezien het enkele uren kan duren voordat dergelijke mechanismen optreden. Naast metabool onderzoek kan het protocol ook in andere onderzoeksgebieden worden toegepast om de endocriene functies van de lever (afscheiding van hormonen en hepatokines) en het levermetabolisme van geneesmiddelen en xenobiotica te bestuderen.
De meest kritische stap voor deze methode is het plaatsen van de katheter in de poortader. Het is belangrijk dat de punt van de katheter zich direct voor het vertakkingspunt van de poortader in de linker en rechter portale aders van de lever bevindt (Figuur 2). Als de punt van de katheter te ver wordt geduwd, wordt slechts een deel van de lever goed doorbloed. Als het te ver naar beneden in de poortader wordt geplaatst, kan lekkage door de pancreato-twaalfvingerige darmtak optreden. Het plaatsen van de tweede katheter voor afname is minder dringend omdat de lever bij deze stap al is doorbloed met de zuurstofbuffer. Wanneer de operatie met succes is uitgevoerd, zal de lever gedurende ten minste 3 uur ademen en reageren met een constante druk en perfusie-output (aanvullende figuur 2). In dit stadium is het vermijden van luchtbellen in het perfusiesysteem de belangrijkste factor voor een succesvol experiment. Luchtbellen zijn moeilijk volledig te vermijden omdat de buffer continu wordt vergast met zuurstof, maar de bellen moeten worden opgesloten in de bellenvanger van het perfusiesysteem. Het is daarom belangrijk om de bellenvanger in de gaten te houden en bij te vullen met perfusiebuffer wanneer deze bijna leeg is.
Krebs-Henseleit-buffer (KHB) is de meest gebruikte oplossing voor leverperfusies13. De klassieke formulering bevat 2,5 mmol/L CaCl 2, maar op basis van een eerdere studie die aantoont dat calcium bijdraagt aan mitochondriale schade, gebruiken we een buffer met slechts 1,25 mmol/L CaCl212. De toevoeging van erytrocyten, albumine of glucose aan de buffer is niet nodig11. De voorgestelde buffer maakt ook moleculaire profilering mogelijk met behulp van geavanceerde biochemische technieken zoals metabolomics op basis van massaspectrometrie. Verschillende concentraties van een teststof kunnen worden getest om de optimale dosis te bepalen en om fysiologische versus farmacologische effecten te evalueren. In de experimenten die in deze studie zijn uitgevoerd, bevindt 10 mM AA zich in het hoge fysiologische bereik dat overeenkomt met postprandiale niveaus, terwijl 10 nM glucagon overeenkomt met een farmacologische dosis. Zoals aangetoond in figuur 4, is het essentieel om een basislijnperiode van 20-30 minuten tussen twee opeenvolgende stimulaties op te nemen om de dynamiek en moleculaire mechanismen van de respectieve responsen te kunnen vergelijken.
Het is belangrijk om bloed in de perfusaatmonsters te vermijden, omdat dit de daaropvolgende analyses kan verstoren, bijvoorbeeld de colorimetrische bepaling van ureum- en glucoseconcentraties. Als er na ~15 minuten in de evenwichtsperiode bloed in de verzamelde monsters verschijnt, wanneer een 3-wegklep wordt geopend voor infusies of wanneer de bellenvanger wordt gevuld, is de vaatklem op de infrahepatische vena cava waarschijnlijk niet correct geplaatst.
Onze ervaring is dat een succesvolle operatie resulteert in een stabiele portaaldruk van ~10 mmHg en een uitgangsdebiet van 3,5 ml/min binnen enkele minuten na het inbrengen van de opvangkatheter. Als de druk aanzienlijk hoger is of voortdurend toeneemt, of als het verzamelde uitgangsdebiet niet 3,5 ml/min is of continu daalt, moeten verschillende gebeurtenissen worden overwogen: 1) Zijn alle leverkwabben gelijkmatig doorbloed en vertonen ze een uniforme bleke kleur? Als dit niet het geval is, kan er een occlusie zijn opgetreden (vaak een luchtbel; de leverkwab voorzichtig "masseren" met een wattenstaafje; dit helpt soms om de luchtbel los te maken waardoor de druk onmiddellijk zal dalen), of de poortaderkatheter is te ver omhoog geduwd, waardoor slechts één van de twee takken van de poortader van de lever wordt gevoed (probeer de katheter voorzichtig enkele millimeters terug te trekken). 2) Is de suprahepatische inferieure vena cava verdraaid? Dit kan gebeuren bij het bevestigen van het mannelijke deel van de opvangbuis aan het vrouwelijke deel van de katheter die in de ader is ingebracht; Verwijder voorzichtig de opvangbuis en kijk of de druk daalt. 3) Wordt de opvangkatheter te ver in de suprahepatische inferieure vena cava geduwd, zodat de punt van de katheter in de lever is ingeklemd? Trek indien nodig voorzichtig een paar millimeter in.
Samenvattend is de geperfuseerde muizenlever een fysiologisch relevant in vitro experimenteel model dat kan worden gebruikt om de dynamische effecten van een bepaalde verbinding op de lever te bestuderen. De kwaliteit van de operatie is van cruciaal belang voor de kwaliteit van de verkregen gegevens, en onze ervaring is dat het ~2 maanden training duurt voordat gegevens van bevredigende kwaliteit kunnen worden verwacht. Als de techniek eenmaal is geleerd, zijn de mogelijkheden met deze methode talrijk, waaronder het gebruik van transgene of knock-out donordieren met betrekking tot de genen van belang, evenals muismodellen van leverziekten. Experimenten kunnen echter worden beperkt door mogelijke toxische bijwerkingen (die in vivo waarschijnlijk veel ernstiger zijn) of een slechte oplosbaarheid van teststoffen. Dergelijke verbindingen kunnen oraal aan de donordieren worden toegediend op een passend tijdstip vóór de perfusie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten die relevant zijn voor dit artikel.
Acknowledgments
De studies en Nicolai J. Wewer Albrechtsen werden ondersteund door Novo Nordisk Foundation Excellence Emerging Investigator Grant - Endocrinology and Metabolism (Application No. NNF19OC0055001), European Foundation for the Study of Diabetes Future Leader Award (NNF21SA0072746) en Independent Research Fund Denmark, Sapere Aude (1052-00003B). Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research wordt financieel ondersteund door de Novo Nordisk Foundation (Grant agreement NNF14CC0001). Figuur 1B is gemaakt met biorender.com. We danken Dr. Rune E. Kuhre (Novo Nordisk A/S) voor vruchtbare discussies over de geperfuseerde muizenlever.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-way stopcock | BD | 394601 | |
| Altromin breeding diet | Altromin Spezialfutter | 1319 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma | C8106 | |
| Catheters (0.7 mm) | BD | 381812 | |
| Filter paper (pore size 2.0 µm) | Millipore | AP2029325 | |
| Glucose kit | QuantiChromTM | DIGL-100 | Low concentration protocol |
| Ketamine | MSD Animal Health | 511485 | 90 mg/kg |
| Ligature (black sterile silk) | Agnthos | 14739 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | 230391 | |
| Non-esterified fatty acids kit | Fujifilm Wako Chemicals | NEFA-HR(2) | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate(KH2PO4) | Merck | 1.04877 | |
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Sleek tape | Mediq danmark | 4001910 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | |
| Thermostatic Circulator | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | Bath Volume 3 L, 230 V/50 Hz |
| Tubing | Tygon | E3603 | Inner diameter 1.59 mm, outer diameter 3.18 mm |
| Universal perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | Basic unit uniper UP-100, type 834 |
| Vamin | Fresenius Kabi | B05ABA01 | Mixed amino acids |
| Vessel clamp adaptor | Deutsche Biomedical | DBC1002 | |
| Vessel clamps | Deutsche Biomedical | DBC1005 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Xylazine | Rompun Vet | 530701 | 10 mg/kg |
References
- Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response. Scientific Reports. 6, 25329 (2016).
- Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
- Seirup, M., et al. Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro. Genomics. 114 (3), 110330 (2022).
- Gupta, R., et al. Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq. Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137 (2021).
- Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX. Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
- Bartošek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. Isolated Liver Perfusion and its Applications. , Raven Press. New York. (1973).
- Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations. Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).
- Mischinger, H. J., et al. An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates. Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).
- Vairetti, M., et al. Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2. Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).
- Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).
- Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -G. Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium. Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).
