Summary
In dieser Arbeit stellen wir eine robuste Methode für die in situ Perfusion der Mausleber vor, um die akute und direkte Regulation des Leberstoffwechsels zu untersuchen, ohne die Leberarchitektur zu stören, aber in Abwesenheit von extrahepatischen Faktoren.
Abstract
Die Leber hat zahlreiche Funktionen, unter anderem den Nährstoffstoffwechsel. Im Gegensatz zu anderen in vitro und in vivo Modellen der Leberforschung ermöglicht die isolierte perfundierte Leber die Untersuchung der Leberbiologie und des Leberstoffwechsels in der gesamten Leber mit einer intakten Leberarchitektur, getrennt vom Einfluss extrahepatischer Faktoren. Leberperfusionen wurden ursprünglich für Ratten entwickelt, aber die Methode wurde auch an Mäuse angepasst. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die in situ Perfusion der Mausleber. Die Leber wird antegrad durch die Pfortader mit sauerstoffhaltigem Krebs-Henseleit-Bicarbonatpuffer perfundiert, und der Ausgang wird von der suprahepatischen unteren Hohlvene unter Klemmung der infrahepatischen unteren Hohlvene gesammelt, um den Kreislauf zu schließen. Mit dieser Methode können die direkten hepatischen Effekte einer Testverbindung mit einer detaillierten Zeitauflösung bewertet werden. Leberfunktion und Lebensfähigkeit sind für mindestens 3 h stabil, so dass interne Kontrollen in dasselbe Experiment einbezogen werden können. Die experimentellen Möglichkeiten mit diesem Modell sind zahlreich und können Aufschluss über die Leberphysiologie und Lebererkrankungen geben.
Introduction
Die Leber ist ein essentielles Organ im Stoffwechsel. Es spielt eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle des Energiehaushalts des gesamten Körpers, indem es den Glukose-, Lipid- und Aminosäurestoffwechsel reguliert. Die Zunahme von Lebererkrankungen weltweit entwickelt sich zu einer großen globalen Gesundheitsbelastung, und es wird mehr Wissen über die Pathophysiologie und ihre Folgen für die Leberfunktionen benötigt.
Für die Forschung an der Leber wurden verschiedene In-vitro-Modelle entwickelt, die In-vivo-Studien ergänzen. Isolierte und kultivierte primäre Hepatozyten von Nagetieren und Menschen sind weit verbreitet. Nicht-parenchymale Zellen können mit Hilfe von Differential- und Gradientenzentrifugation von Hepatozyten getrennt werden, und die Kokultur verschiedener Zelltypen ist nützlich für die Untersuchung des interzellulären Crosstalks1. Obwohl primäre menschliche Hepatozyten als Goldstandard für die Prüfung der Arzneimitteltoxizität gelten, haben mehrere Studien gezeigt, dass die Hepatozyten in Gewebekulturen schnell dedifferenzieren, was zu einem Verlust der Leberfunktionen führt 2,3,4. Die Hepatozytenkultur in einem 3D-Sphäroidsystem verbessert die Dedifferenzierung, ist stabiler und scheint die Leber in vivo in höherem Maße nachzuahmen als die herkömmlichen 2D-Kultursysteme5. Präzisionsgeschnittene Leberschnitte sind ein weiteres etabliertes In-vitro-Modell, das die Gewebearchitektur intakt hält und die in der Leber vorhandenen nicht-parenchymalen Zellen enthält6. Zu den fortgeschritteneren In-vitro-Modellen gehören Liver-on-a-Chip7 und Leberorganoide8. Bei all diesen Ansätzen kommt es jedoch zu einem Verlust der strukturellen Integrität und der Strömungsdynamik, einschließlich des vektoriellen portal-hepatischen Venenflusses, was sich wahrscheinlich auf die Generalisierbarkeit auswirkt.
Die isolierte perfundierte Rattenleber wurde erstmals 1855 von Claude Bernard beschrieben 9 und wird immer noch in verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen für Studien der Leberbiologie, Toxikologie und Pathophysiologie verwendet. Zu den Vorteilen der perfundierten Leber im Vergleich zu den oben genannten In-vitro-Modellen gehören die Aufrechterhaltung der Leberarchitektur, des Gefäßflusses, der Hepatozytenpolarität und -zonierung sowie die Wechselwirkungen zwischen Hepatozyten und nicht-parenchymalen Zellen. Im Vergleich zu In-vivo-Studien ermöglicht die perfundierte Leber die isolierte Untersuchung des Leberstoffwechsels unter Vermeidung von extrahepatischen Faktoren, die vom Blut getragen werden, und mit vollständiger Kontrolle über die Versuchsbedingungen. Im Laufe der Jahre wurden mehrere Modifikationen vorgenommen, um das Leberperfusionsmodell der Ratte zu verbessern10,11,12,13. Obwohl Mäuse für isolierte perfundierte Leberstudien verwendet wurden, ist weniger Literatur verfügbar. Hier stellen wir eine Methode zur in situ Perfusion der Mausleber durch Kanülierung der Pfortader und der suprahepatischen Vena cava inferior vor, um die akuten und direkten metabolischen Reaktionen auf metabolische Substrate und Hormone zu untersuchen, wie sie im hepatischen venösen Ausfluss aus der Mausleber in Echtzeit gemessen werden.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung der dänischen Tierversuchsinspektion, des dänischen Ministeriums für Umwelt und Ernährung (Genehmigung 2018-15-0201-01397) und der lokalen Ethikkommission in Übereinstimmung mit der EU-Richtlinie 2010/63/EU, den Nationalen Gesundheitsinstituten (Veröffentlichung Nr. 85-3) und gemäß den Richtlinien der dänischen Gesetzgebung für Tierversuche (1987) durchgeführt. Dies ist ein endgültiger Eingriff, und die Todesursache ist eine Ausblutung und Perforation des Zwerchfells unter Tiefenanästhesie.
1. Versuchstiere
- Besorge dir Mäuse der gewünschten Sorte, des gewünschten Alters und Geschlechts. In dieser Studie wurden männliche C57BL/6JRj-Mäuse im Alter von 11-16 Wochen verwendet. Unterbringung von bis zu 5 männlichen oder 8 weiblichen Mäusen pro Käfig mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser und Einhaltung eines 12 h/12 h Hell-Dunkel-Zyklus mit eingeschaltetem Licht von 6 bis 18 Uhr.
2. Präoperative Vorbereitungen
- Stellen Sie Leberperfusionspuffer her.
- Krebs-Henseleit-Puffer. Mischen und lösen Sie 118 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/LMgSO4 und 1,2 mmol/L KH2PO4 indH2O. 1,25 mmol/L CaCl2werden in einem separaten Becherglas gelöst und der Puffer hinzugefügt.
- 25 mmol/L NaHCO3 auflösen und unter Rühren langsam in den Puffer geben. Lagern Sie den Puffer bei 4 Grad. Der Puffer ist mindestens 1 Monat stabil.
HINWEIS: Es kann zu Ausfällungen kommen, wenn CaCl2 und NaHCO3 vor der Zugabe nicht einzeln gelöst werden.
- Filtern Sie den Perfusionspuffer durch einen 2-μm-Filter und stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,5 ein.
HINWEIS: Dieser Schritt sollte am Versuchstag durchgeführt werden, da der pH-Wert mit der Zeit ansteigt, auch wenn er in geschlossenen Kolben gelagert wird. - Bereiten Sie Testverbindungen in einer höheren Konzentration als der gewünschten Endkonzentration (z. B. 20-fache Konzentration bei Infusion mit einer Rate von 0,175 ml/min über eine Seitenarmpumpe) in filtriertem und pH-angepasstem Krebs-Henseleit-Perfusionspuffer vor. Falls relevant, verdünnen Sie die Testverbindungen in Krebs-Henseleit-Perfusionspuffer mit 1 % BSA als Träger (um das Anhaften an Schläuchen und Glaswaren zu vermeiden, die für alle Peptide unerlässlich sind), und filtrieren Sie sie durch einen Filter geeigneter Größe.
3. Operation und Perfusion
HINWEIS: Eine Abbildung des in dieser Studie verwendeten Perfusionsaufbaus ist in Abbildung 1 dargestellt.
- Begasen Sie den Perfusionspuffer (95 % O2, 5 %CO2) mindestens 30 Minuten lang, um die Leber ausreichend mit Sauerstoff zu versorgen und den korrekten pH-Wert von Beginn der Operation an aufrechtzuerhalten (das Bikarbonatpuffersystem erreicht bei kontinuierlicher Begasung einen pH-Wert von 7,4, siehe ergänzende Abbildung 1).
- Betäubung einer Maus durch Verabreichung von Ketamin (90 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion.
- Legen Sie die Maus in Rückenlage auf einen beheizten Operationstisch und bestätigen Sie das Fehlen von Reflexen als Reaktion auf das Einklemmen der Zehen. Sprühen Sie mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass die Haare an der Schere kleben. Das Befestigen der Maus an der warmen Oberfläche hilft, die Stabilität für die folgenden Vorgänge zu erhöhen.
- Machen Sie einen Schnitt mit einer Schere an der Basis des Bauches und schneiden Sie auf beiden Seiten nach oben bis zum Brustkorb, um die Bauchhöhle freizulegen. Bewegen Sie den Darm mit einem Wattestäbchen nach rechts und legen Sie die Pfortader frei.
- Legen Sie mit einer gebogenen Pinzette zwei Ligaturen unter die Pfortader und bereiten Sie für jede Ligatur einen lockeren Knoten vor.
- Führen Sie einen 0,7 mm Katheter in die Pfortader ein. Wenn die Nadel perforiert ist, entfernen Sie die Nadel aus dem Katheter und führen Sie den Katheter durch die Vene, bis sich die Spitze des Katheters in der Nähe der Leber befindet, wie in Abbildung 2 dargestellt. Blut fließt in den Katheter.
- Ziehen Sie die Ligaturen fest. Wenn der Katheter nicht mit Blut gefüllt ist, füllen Sie ihn mit Perfusionspuffer auf, um das Eindringen einer Luftblase zu vermeiden.
- Befestigen Sie den Perfusionsschlauch und leiten Sie die Perfusion der Leber mit Krebs-Henseleit-Bicarbonatpuffer bei 37 °C ein, indem Sie die Rollenpumpe mit einer Perfusionsflussrate von 0,8 ml/min starten. Die Leber wird innerhalb von Sekunden blass.
- Schneiden Sie den Brustkorb und das Zwerchfell mit einer Schere ab. Zu diesem Zeitpunkt wird das Tier eingeschläfert. Platzieren Sie eine Ligatur mit einer feinen Pinzette unter der suprahepatischen unteren Hohlvene. Lege einen Stift, gerollte Gaze oder einen anderen Einwegartikel unter die Rückseite der Maus, um die Vene besser zugänglich zu machen.
- Über den rechten Vorhof des Herzens wird ein Katheter in die suprahepatische untere Hohlvene eingeführt. Wenn die Nadel perforiert ist, entfernen Sie die Nadel aus dem Katheter und führen Sie den Katheter durch die Vene, bis sich die Spitze des Katheters in der Nähe der Leber befindet. Der Blut- und Perfusionspuffer geht sofort zur Neige.
- Ziehen Sie die Ligatur fest und befestigen Sie einen Schlauch zum Auffangen des Perfusionsabflusses. Befestigen Sie alle Röhrchen mit wasserdichtem Klebeband (Sleek Tape o.ä.).
- Verwenden Sie einen Gefäßklemmadapter, um eine Gefäßklemme über die infrahepatische Hohlvene unmittelbar über der rechten Nierenvene zu platzieren, um eine Vermischung zu verhindern (Abbildung 2).
- Erhöhen Sie die Perfusionsflussrate auf 3,5 ml/min und starten Sie einen Timer. Starten Sie die Druckaufzeichnung. Eine erfolgreiche Perfusion führt in der Regel zu einem Druck von ~10 mm/Hg.
- Bedecken Sie die Leber mit einem sterilen, mit Kochsalzlösung angefeuchteten Tuch und fügen Sie während des Experiments Kochsalzlösung hinzu, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Sammeln Sie das Perfusionsabwasser für 1 Minute und messen Sie das Volumen. Das Volumen sollte ca. 3,5 ml/min betragen. Eine Beimischung von Blut ist in diesem Stadium nicht zu erwarten, und das Herz pumpt nicht mehr.
- Warten Sie eine Äquilibrierungsperiode von 30 Minuten, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
Abbildung 1: Eine Illustration des Perfusionsaufbaus. (A)Der OP-Tisch wird auf einem Stativ erhöht und auf 37 °C erhitzt. Der Perfusionspuffer wird begast (95 % O2, 5 %CO2), über eine Peristaltikrollenpumpe gepumpt und im Wärmetauscher mit einer eingebauten Blasenfalle erhitzt. Das System besteht außerdem aus einem Manometer und einer Spindelpumpe zur Einstellung des Perfusionsdrucks. Der Perfusionsdruck wird kontinuierlich aufgezeichnet und über einen Wandler auf einem PC, ein Druckaufzeichnungsprogramm, visualisiert. (B) Das rote Kästchen erfasst die Anschlüsse von Dreiwegehähnen. Der erste Dreiwegehahn ist für die Infusion einer Testverbindung über eine Spritzenpumpe geöffnet, der zweite ist geschlossen. Der dritte ist offen für kontinuierliche Druckmessungen. Der vierte Absperrhahn kann verwendet werden, um Eingangsproben zu sammeln, z. B. für die Gasanalyse in der durchbluteten Leber. Die Konnektoren können je nach Bedarf für spezifische Experimente modifiziert werden, die mehr oder weniger Infusionsleitungen erfordern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Fotos der Bauchhöhle der Maus vor und während der Leberperfusion. (A)Der grüne Punkt zeigt die Lage der Spitze des Pfortaderkatheters an. Es ist wichtig, dass die Spitze des Katheters knapp unter dem Verzweigungspunkt der Pfortader in die linke und rechte Leberpfortader, aber oberhalb des Pankreas-Duodenalastes positioniert wird, um eine Leckage zu vermeiden. Der gelbe Punkt zeigt die korrekte Lage der Gefäßklemme an der infrahepatischen unteren Hohlvene zwischen der rechten Nierenvene und der Leber an, um den Rückfluss von Blut in die durchblutete Leber zu vermeiden. (B, C) Eine perfundierte Mäuseleber mit den beiden Kathetern, die in die Pfortader (B) und die suprahepatische untere Hohlvene (C) eingeführt werden, und die Gefäßklemme an der infrahepatischen unteren Hohlvene (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
4. Experimentieren
- Beginnen Sie das Experiment, indem Sie am Ende der Äquilibrierungsperiode die ersten Basislinienproben mit einem Fraktionssammler sammeln. Sammeln Sie Proben im gewünschten Zeitintervall und legen Sie sie sofort auf Eis.
- Kontrollieren Sie die Blasenfalle regelmäßig und füllen Sie sie mit Perfusionspuffer auf, wenn sie fast leer ist.
- Eine Probe des Puffers wird durch einen Drei-Wege-Absperrhahn entnommen, unmittelbar bevor er in das Organ eintritt und aus dem Sammelkatheter, der in die untere Hohlvene eingeführt wird (nachdem er durch die Leber perfundiert wurde).
- Messen Sie die Proben mit einem Blutgasanalysator, um zu bestätigen, dass das Organ metabolisch aktiv ist (angezeigt durch einen Anstieg desCO2-Partialdrucks und eine Abnahme des pH-Werts).
- Wiederholen Sie die Schritte 4.3 bis 4.4 am Ende des Experiments, um die Durchführbarkeit während des gesamten Versuchs zu beurteilen (ergänzende Abbildung 2).
HINWEIS: Die Abnahme des Sauerstoffpartialdrucks liefert kein zuverlässiges Maß für die Atmung, da Sauerstoff aus den Schläuchen, dem Organ usw. verloren geht. - Nach 15 Minuten Ausgangsperfusion ist die erste Stimulation zu starten, indem eine Prüfsubstanz durch einen Dreiwegehahn mit der gewünschten Durchflussrate unter Verwendung einer Spritzenpumpe infundiert wird (z. B. 20-fache Konzentration der Prüfsubstanz bei einer Infusionsrate von 0,175 ml/min über eine Seitenarmpumpe). Alternativ kann der Basispuffer auf einen neuen (sauerstoffhaltigen und erhitzten) Puffer umgestellt werden, der die Testverbindung in der endgültigen Konzentration enthält.
- Beenden Sie die Stimulation und sammeln Sie Basisproben für 20-30 Minuten, bevor Sie mit der zweiten Stimulation beginnen.
- Am Ende des Experiments wird eine geeignete Positivkontrolle für 5-10 Minuten infundiert.
- Nach dem Experiment wird die durchblutete Leber herausgeschnitten und gewogen, um die Leistung auf das Lebergewicht zu normalisieren. Frieren Sie die Leber in flüssigem Stickstoff ein, um den Proteingehalt zu messen, um den Output auf den Proteingehalt zu normalisieren.
5. Biochemische Messungen
- Quantifizieren Sie die Konzentration des interessierenden Moleküls mit Assays, die für Messungen in Perfusionspuffer geeignet sind (interne oder kommerziell erhältliche kolorimetrische oder ELISA-Assays). Der Puffer ist mit den meisten Omics-basierten Techniken wie Metabolomik und Proteomik kompatibel.
HINWEIS: In dieser Studie wurde Harnstoff auf der Grundlage eines zuvor beschriebenen kolorimetrischen Assays gemessen14. Glukose und nicht veresterte Fettsäuren wurden mit kommerziell erhältlichen Kits quantifiziert.
6. Datenanalyse
- Stellen Sie die Daten in XY-Diagrammen dar, die die sekretorische Ausgabe im Zeitverlauf zeigen.
ANMERKUNG: Es ist einer der Vorzüge des In-vitro-Perfusionssystems, dass es möglich ist, Daten als tatsächlicher Output (Konzentration × Flussrate, z. B. μmol/min) anstelle der gemessenen Konzentration im Output (mmol/L) wie in In-vivo-Studien auszudrücken. Erwägen Sie, die Ausgabe auf das Lebergewicht zu normalisieren, wenn Sie verschiedene Mausmodelle vergleichen, oder auf den Gesamtproteingehalt (gemessen durch BCA), wenn Sie Kontrollmäuse mit Mausmodellen mit Fettleibigkeit oder Lebererkrankungen vergleichen, bei denen eine Zunahme des Lebergewichts auf einen erhöhten Fettgehalt zurückzuführen sein kann. - Präsentieren Sie zusammenfassende Daten als einzelne Punkte pro Tier, die den Mittelwert oder die Gesamtleistung während der Baseline und über einen Stimulationszeitraum (in der Regel 15-30 Minuten) oder den inkrementellen Output unter Verwendung der vorhergehenden Baseline für jeden Stimulationszeitraum je nach Studiendesign darstellen.
- Analysieren Sie die Daten mit einem gepaarten t-Test (zwei Gruppen) oder einer Einweg-ANOVA mit wiederholten Stimulationen (mehr als zwei Gruppen) mit einem geeigneten Post-hoc-Test für mehrere Tests.
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Representative Results
Eine stabile Basislinie ist erforderlich, um festzustellen, ob ein Stimulus oder ein Substrat zur Freisetzung des interessierenden Moleküls führt. Abbildung 3A zeigt ein Beispiel für ein erfolgreiches Experiment. Die Produktion von Harnstoff in der durchbluteten Leber wird in 2-Minuten-Intervallen gemessen und als Mittelwert ± REM angezeigt. Die Ausgangsperioden, die jeder der beiden Stimulationsperioden vorausgehen, sind stabil. Die mittlere Harnstoffproduktion während der beiden Stimulationsperioden und die jeweils vorhergehenden Ausgangswerte sind in Abbildung 3B dargestellt. Die statistische Signifikanz zwischen den Perioden wurde mittels Einweg-ANOVA mit wiederholten Messungen getestet. Basierend auf diesen Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass die Harnstoffreaktion auf zwei aufeinanderfolgende Stimulationen mit gemischten Aminosäuren ähnlich ist, was ein wichtiges Kontrollexperiment bei der Bewertung wiederholter Stimulationen mit unterschiedlichen Dosen oder Testverbindungen darstellt.
Neben der Harnstoffgenese ist es möglich, die hepatische Glykogenolyse und Lipolyse mit dem oben genannten Protokoll zu untersuchen. Abbildung 3C-F zeigt Daten aus einem separaten Experiment während einer Infusion mit Glukagon. Die Freisetzung von Glukose (Abbildung 3C) und der nicht veresterten Fettsäuren (NEFA) (Abbildung 3E) wurde in 4-Minuten-Perioden gemessen. Eine stetige basale Freisetzung von Glukose (Abbildung 3C) und NEFA (Abbildung 3E) wird vor einem robusten Anstieg von Glukose bzw. NEFA während der Glukagon-Infusion beobachtet. Basierend auf den Mittelwerten im basalen Zustand und während der Glukagon-Infusion kann geschlussfolgert werden, dass Glukagon schnell die hepatische Glykogenolyse (Abbildung 3D) und Lipolyse (Abbildung 3F) stimuliert.
Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für scheinbar erfolglose Experimente. Die basale Freisetzung von Harnstoff ist unstetig und die Stimulationsperioden liegen zu nahe beieinander, als dass die Harnstoffproduktion vor Beginn der nächsten Stimulation wieder auf das Basalniveau zurückkehren könnte. Ohne gleichmäßige Basalperioden ist es nicht möglich, eine Harnstoffreaktion von der nächsten zu unterscheiden. Aus diesen Daten lässt sich nicht ableiten, ob unterschiedliche Glukosekonzentrationen die Aminosäure-induzierte Ureagenese in der perfundierten Mäuseleber beeinflussen. Experimentelle Protokolle sollten stattdessen mit 20-30 Minuten Baseline-Perioden zwischen zwei aufeinanderfolgenden Stimulationen entworfen werden, um vor jeder Stimulationsperiode eine stabile Baseline zu erreichen.
Abbildung 3: Daten von guter Qualität aus der perfundierten Mäuseleber. (A,B) Der Gesamtharnstoff wird unter basalen Bedingungen und als Reaktion auf die Verabreichung von gemischten Aminosäuren (10 mM) und Glukose (6 mM) angezeigt. Die Daten werden als (A) Mittelwert ± REM und (B) Mittelwerte während jeder Stimulation und vorhergehenden Basalperiode (jeder Punkt steht für eine Maus) dargestellt, n = 6. (C, D) Die Gesamtleistung von Glukose und (E,F) nicht veresterten freien Fettsäuren (NEFA) wird unter basalen Bedingungen und als Reaktion auf die Verabreichung von Glukagon (10 nM) angezeigt. Die Daten werden als (C,E)-Mittelwert ± REM- und (D,F)-Mittelwerte während der Basal- und Stimulationsperiode (jeder Punkt steht für eine Maus) dargestellt, n = 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Schlechte Qualität der Daten aus der perfundierten Mäuseleber. Die Gesamtleistung von Harnstoff wird unter basalen Bedingungen als Reaktion auf gemischte Aminosäuren (10 mM) und abnehmende Glukosekonzentrationen (18 mM, 12 mM, 6 mM, 3 mM und 0 mM) angezeigt. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt, n = 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Zeitabhängiger Partialdruck von Sauerstoff und Kohlendioxid und pH-Wert im Krebs-Henseleit-Bicarbonatpuffer während der Begasung mit 95% O2 + 5%CO2. (A) Partialdruck von Sauerstoff, (B) Kohlendioxid und (C) pH-Wert in Proben von Krebs-Henseleit-Perfusionspuffer (pH-Wert vor dem Versuch nicht eingestellt), die nach dem Durchlaufen des Perfusionssystems zu angegebenen Zeitpunkten nach Beginn der Begasung mit 95 % O2 + 5 %CO2 entnommen wurden. Perfusionspufferproben wurden mit einem Blutgasanalysator gemessen. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Änderungen des Partialdrucks von Sauerstoff und Kohlendioxid und des pH-Werts in der perfundierten Leber. (A) Partialdruck von Sauerstoff, (B) Kohlendioxid und (C) pH-Wert in Proben von Krebs-Henseleit-Perfusionspuffer, die unmittelbar vor dem Erreichen der Leber und nach der Durchführung der perfundierten Leber nach 1 min und 180 min in ein Experiment entnommen wurden. Die Perfusionsproben wurden mit einem Blutgasanalysator gemessen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt. **P < 0,01, ****P < 0,0001 durch mehrere gepaarte t-Tests, die für Mehrfachtests mit der Holm-Sidak-Methode korrigiert wurden. n =14. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
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Discussion
Die isolierte perfundierte Mäuseleber ist ein starkes Forschungswerkzeug für die Untersuchung der Dynamik und der molekularen Mechanismen des Leberstoffwechsels. Die Möglichkeit der minütlichen Probenentnahme ermöglicht eine detaillierte Bewertung der direkten Wirkung einer Testsubstanz auf die Leber. Im Vergleich zu In-vivo-Studien ermöglicht uns die perfundierte Leber, den Leberstoffwechsel isoliert zu untersuchen, extrahepatische Faktoren aus dem Blut zu vermeiden und die Versuchsbedingungen vollständig zu kontrollieren. Die Vorteile der Leberperfusion im Vergleich zu In-vitro-Studien mit isolierten Hepatozyten sind die Aufrechterhaltung der Leberarchitektur, der Polarität, der zonalen Teilung und der vaskulären Integrität. Ein weiterer Vorteil der Leberperfusion ist das große Probenvolumen (3,5 ml/min), das die Messung mehrerer Ergebnisse in derselben Probe ermöglicht. Die perfundierte Leber ist jedoch nicht ideal für die Untersuchung von Effekten, die von der transkriptionellen Regulation abhängen, da solche Mechanismen mehrere Stunden dauern können. Neben der Stoffwechselforschung kann das Protokoll auch in anderen Forschungsbereichen angewendet werden, um die endokrinen Funktionen der Leber (Sekretion von Hormonen und Hepatokinen) und den Leberstoffwechsel von Medikamenten und Xenobiotika zu untersuchen.
Der kritischste Schritt bei dieser Methode ist die Platzierung des Katheters in der Pfortader. Wichtig ist, dass die Spitze des Katheters unmittelbar vor dem Abzweig der Pfortader in die linke und rechte Leberpfortader positioniert wird (Abbildung 2). Wenn die Spitze des Katheters zu weit geschoben wird, wird nur ein Teil der Leber richtig durchblutet. Wenn es zu weit unten in der Pfortader platziert wird, kann es zu einer Leckage durch den Pankreas-Duodenalast kommen. Das Legen des zweiten Katheters für die Entnahme ist weniger dringend, da die Leber zu diesem Zeitpunkt bereits mit dem sauerstoffhaltigen Puffer durchblutet ist. Wenn die Operation erfolgreich durchgeführt wurde, atmet und reagiert die Leber für mindestens 3 Stunden mit konstantem Druck und Perfusionsabgabe (ergänzende Abbildung 2). In dieser Phase ist die Vermeidung von Luftblasen im Perfusionssystem der wichtigste Faktor für ein erfolgreiches Experiment. Luftblasen lassen sich nur schwer vollständig vermeiden, da der Puffer kontinuierlich mit Sauerstoff begast wird, aber die Blasen sollten in der Blasenfalle des Perfusionssystems eingeschlossen werden. Daher ist es wichtig, die Blasenfalle im Auge zu behalten und sie mit Perfusionspuffer nachzufüllen, wenn sie fast leer ist.
Krebs-Henseleit-Puffer (KHB) ist die am häufigsten verwendete Lösung für Leberperfusionen13. Die klassische Formulierung enthält 2,5 mmol/L CaCl 2, aber basierend auf einer früheren Studie, die zeigt, dass Kalzium zu mitochondrialen Schäden beiträgt, verwenden wir einen Puffer mit nur 1,25 mmol/L CaCl212. Die Zugabe von Erythrozyten, Albumin oder Glukose zum Puffer ist nicht erforderlich11. Der vorgeschlagene Puffer ermöglicht auch die Erstellung molekularer Profile mit fortschrittlichen biochemischen Techniken wie der auf Massenspektrometrie basierenden Metabolomik. Verschiedene Konzentrationen einer Testverbindung können getestet werden, um die optimale Dosis zu bestimmen und physiologische vs. pharmakologische Wirkungen zu bewerten. In den in dieser Studie durchgeführten Experimenten liegen 10 mM AA im hohen physiologischen Bereich, der den postprandialen Spiegeln entspricht, während 10 nM Glukagon einer pharmakologischen Dosis entsprechen. Wie in Abbildung 4 gezeigt, ist es wichtig, einen Ausgangszeitraum von 20-30 Minuten zwischen zwei aufeinanderfolgenden Stimulationen einzubeziehen, um die Dynamik und die molekularen Mechanismen der jeweiligen Reaktionen vergleichen zu können.
Es ist wichtig, Blut in den Perfusatproben zu vermeiden, da dies die nachfolgenden Analysen, z. B. die kolorimetrische Bestimmung der Harnstoff- und Glukosekonzentration, beeinträchtigen kann. Wenn Blut in den entnommenen Proben nach ~15 Minuten in der Äquilibrierungsperiode erscheint, wenn ein 3-Wege-Ventil für Infusionen geöffnet wird oder wenn die Blasenfalle gefüllt wird, ist die Gefäßklemme an der infrahepatischen Hohlvene wahrscheinlich nicht richtig platziert.
Unserer Erfahrung nach führt eine erfolgreiche Operation innerhalb weniger Minuten nach dem Einführen des Auffangkatheters zu einem stabilen Portaldruck von ~10 mmHg und einer Ausgangsflussrate von 3,5 mL/min. Wenn der Druck erheblich höher ist oder kontinuierlich ansteigt, oder wenn die gesammelte Ausgangsflussrate nicht 3,5 ml/min beträgt oder kontinuierlich abfällt, sollten mehrere Ereignisse berücksichtigt werden: 1) Sind alle Leberlappen gleichmäßig durchblutet und zeigen sie eine gleichmäßige blasse Farbe? Ist dies nicht der Fall, liegt möglicherweise ein Verschluss vor (oft eine Luftblase; Leberlappen vorsichtig mit einem Wattestäbchen "massieren"; dies hilft manchmal, die Luftblase zu lösen, wodurch der Druck sofort abfällt), oder der Pfortaderkatheter ist zu weit nach oben geschoben worden, so dass nur einer der beiden Äste der Leberpfortader versorgt wird (vorsichtig versuchen, den Katheter einige Millimeter zurückzuziehen). 2) Ist die suprahepatische untere Hohlvene verdreht? Dies kann auftreten, wenn der männliche Teil des Sammelröhrchens an dem weiblichen Teil des Katheters befestigt wird, der in die Vene eingeführt wird. Entfernen Sie vorsichtig das Auffangrohr und beobachten Sie, ob der Druck abfällt. 3) Ist der Sammelkatheter zu weit in die suprahepatische untere Hohlvene geschoben, so dass sich die Spitze des Katheters in der Leber verkeilt hat? Bei Bedarf vorsichtig ein paar Millimeter einfahren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die perfundierte Mäuseleber ein physiologisch relevantes In-vitro-Versuchsmodell ist, mit dem die dynamischen Wirkungen einer bestimmten Verbindung auf die Leber untersucht werden können. Die Qualität des Betriebs ist entscheidend für die Qualität der gewonnenen Daten, und unserer Erfahrung nach dauert es ~2 Monate Training, bevor Daten von zufriedenstellender Qualität erwartet werden können. Ist die Technik einmal erlernt, sind die Möglichkeiten mit dieser Methode zahlreich, einschließlich der Verwendung von transgenen oder Knockout-Spendertieren hinsichtlich der interessierenden Gene sowie von Mausmodellen für Lebererkrankungen. Die Versuche können jedoch durch mögliche toxische Nebenwirkungen (die in vivo wahrscheinlich viel schwerwiegender sind) oder eine schlechte Löslichkeit der Prüfsubstanzen eingeschränkt werden. Solche Verbindungen können den Spendertieren zu einem geeigneten Zeitpunkt vor der Perfusion oral verabreicht werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass für diesen Artikel keine Interessenkonflikte relevant sind.
Acknowledgments
Die Studien und Nicolai J. Wewer Albrechtsen wurden durch den Novo Nordisk Foundation Excellence Emerging Investigator Grant - Endocrinology and Metabolism (Antrags-Nr. NNF19OC0055001), European Foundation for the Study of Diabetes Future Leader Award (NNF21SA0072746) und Independent Research Fund Denmark, Sapere Aude (1052-00003B). Das Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research wird von der Novo Nordisk Foundation finanziell unterstützt (Grant Agreement NNF14CC0001). Abbildung 1B wurde mit biorender.com erstellt. Wir danken Dr. Rune E. Kuhre (Novo Nordisk A/S) für die fruchtbaren Diskussionen über die perfundierte Mäuseleber.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-way stopcock | BD | 394601 | |
| Altromin breeding diet | Altromin Spezialfutter | 1319 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma | C8106 | |
| Catheters (0.7 mm) | BD | 381812 | |
| Filter paper (pore size 2.0 µm) | Millipore | AP2029325 | |
| Glucose kit | QuantiChromTM | DIGL-100 | Low concentration protocol |
| Ketamine | MSD Animal Health | 511485 | 90 mg/kg |
| Ligature (black sterile silk) | Agnthos | 14739 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | 230391 | |
| Non-esterified fatty acids kit | Fujifilm Wako Chemicals | NEFA-HR(2) | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate(KH2PO4) | Merck | 1.04877 | |
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Sleek tape | Mediq danmark | 4001910 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | |
| Thermostatic Circulator | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | Bath Volume 3 L, 230 V/50 Hz |
| Tubing | Tygon | E3603 | Inner diameter 1.59 mm, outer diameter 3.18 mm |
| Universal perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | Basic unit uniper UP-100, type 834 |
| Vamin | Fresenius Kabi | B05ABA01 | Mixed amino acids |
| Vessel clamp adaptor | Deutsche Biomedical | DBC1002 | |
| Vessel clamps | Deutsche Biomedical | DBC1005 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Xylazine | Rompun Vet | 530701 | 10 mg/kg |
References
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