Summary
यहाँ, हम यकृत वास्तुकला को परेशान किए बिना यकृत चयापचय के तीव्र और प्रत्यक्ष विनियमन का अध्ययन करने के लिए माउस जिगर के स्वस्थानी छिड़काव के लिए एक मजबूत विधि प्रस्तुत करते हैं, लेकिन अतिरिक्त-यकृत कारकों की अनुपस्थिति में।
Abstract
पोषक तत्वों के चयापचय सहित यकृत के कई कार्य हैं। इन विट्रो में अन्य और यकृत अनुसंधान के विवो मॉडल के विपरीत, पृथक सुगंधित यकृत पूरे यकृत में यकृत जीव विज्ञान और चयापचय के अध्ययन की अनुमति देता है, जो अतिरिक्त-यकृत कारकों के प्रभाव से अलग होता है। जिगर छिड़काव मूल रूप से चूहों के लिए विकसित किए गए थे, लेकिन विधि के रूप में अच्छी तरह से चूहों के लिए अनुकूलित किया गया है. यहाँ हम माउस जिगर के स्वस्थानी छिड़काव में के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. यकृत को ऑक्सीजन युक्त क्रेब्स-हेन्सेलिट बाइकार्बोनेट बफर के साथ पोर्टल शिरा के माध्यम से पूर्ववर्ती रूप से छिद्रित किया जाता है, और आउटपुट सर्किट को बंद करने के लिए इन्फ्राहेपेटिक अवर वेना कावा के क्लैंपिंग के साथ सुपरहेपेटिक अवर वेना कावा से एकत्र किया जाता है। इस पद्धति का उपयोग करके, एक परीक्षण यौगिक के प्रत्यक्ष यकृत प्रभाव का मूल्यांकन विस्तृत समय संकल्प के साथ किया जा सकता है। जिगर समारोह और व्यवहार्यता कम से कम 3 घंटे के लिए स्थिर हैं, एक ही प्रयोग में आंतरिक नियंत्रण को शामिल करने की अनुमति देता है। इस मॉडल का उपयोग प्रयोगात्मक संभावनाएं कई हैं और यकृत शरीर क्रिया विज्ञान और यकृत रोगों में अंतर्दृष्टि का अनुमान लगा सकती हैं।
Introduction
यकृत चयापचय में एक आवश्यक अंग है। यह ग्लूकोज, लिपिड और अमीनो एसिड चयापचय को विनियमित करके पूरे शरीर के ऊर्जा संतुलन के नियंत्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। दुनिया भर में यकृत रोगों में वृद्धि एक प्रमुख वैश्विक स्वास्थ्य बोझ के रूप में उभर रही है, और पैथोफिज़ियोलॉजी और यकृत कार्यों के लिए इसके परिणामों के बारे में अधिक ज्ञान की आवश्यकता है।
विवो अध्ययन में पूरक करने के लिए यकृत पर शोध के लिए विभिन्न इन विट्रो मॉडल विकसित किए गए हैं। कृन्तकों और मनुष्यों से पृथक और सुसंस्कृत प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाओं को अंतर और ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके हेपेटोसाइट्स से अलग किया जा सकता है, और विभिन्न सेल प्रकारों की सह-संस्कृति अंतरकोशिकीय क्रॉसस्टॉक1 का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है। हालांकि प्राथमिक मानव hepatocytes दवा विषाक्तता के परीक्षण के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है, कई अध्ययनों से पता चला है कि hepatocytes तेजी से यकृत कार्यों 2,3,4 के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप ऊतक संस्कृति में dedifferent. एक 3 डी गोलाकार प्रणाली में हेपेटोसाइट संस्कृति dedifferentiation ameliorates, अधिक स्थिर है, और पारंपरिक 2 डीसंस्कृति प्रणालियों 5 की तुलना में एक उच्च डिग्री के लिए विवो में जिगर की नकल करने के लिए प्रकट होता है. प्रेसिजन-कट लिवर स्लाइस इन विट्रो मॉडल में एक और अच्छी तरह से स्थापित हैं जो ऊतक वास्तुकला को बरकरार रखता है और इसमें यकृत6 में मौजूद गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाएं शामिल हैं। इन विट्रो मॉडल में अधिक उन्नत लिवर-ऑन-ए-चिप7 और यकृत ऑर्गेनोइड8 शामिल हैं। हालांकि, इन सभी दृष्टिकोणों के साथ, संरचनात्मक अखंडता और प्रवाह की गतिशीलता का नुकसान होता है, जिसमें वेक्टर पोर्टल-यकृत नस प्रवाह शामिल है, जो संभवतः सामान्यता को प्रभावित करता है।
पृथक सुगंधित चूहे के जिगर को पहली बार 18559 में क्लाउड बर्नार्ड द्वारा वर्णित किया गयाथा, और अभी भी यकृत जीव विज्ञान, विष विज्ञान और पैथोफिज़ियोलॉजी के अध्ययन के लिए विभिन्न वैज्ञानिक क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है। उपर्युक्त इन विट्रो मॉडल की तुलना में सुगंधित यकृत के लाभों में यकृत वास्तुकला, संवहनी प्रवाह, हेपेटोसाइट ध्रुवीयता और ज़ोनेशन और हेपेटोसाइट्स और गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाओं के बीच बातचीत का रखरखाव शामिल है। विवो अध्ययनों की तुलना में, सुगंधित यकृत रक्त द्वारा किए गए अतिरिक्त-यकृत कारकों से बचने और प्रयोगात्मक स्थितियों पर पूर्ण नियंत्रण के साथ एक अलग तरीके से यकृत चयापचय के अध्ययन की अनुमति देता है। कई संशोधनों साल 10,11,12,13 में चूहा जिगर छिड़काव मॉडल में सुधार करने के लिए किए गए हैं. हालांकि चूहों का उपयोग पृथक सुगंधित यकृत अध्ययन के लिए किया गया है, कम साहित्य उपलब्ध है। यहाँ, हम पोर्टल शिरा और suprahepatic वेना कावा अवर के cannulation द्वारा माउस जिगर के स्वस्थानी छिड़काव के लिए एक विधि प्रस्तुत चयापचय substrates और हार्मोन के लिए तीव्र और प्रत्यक्ष चयापचय प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के रूप में वास्तविक समय में माउस जिगर से यकृत शिरापरक प्रवाह में मापा जाता है.
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Protocol
सभी पशु प्रयोग डेनिश पशु प्रयोग निरीक्षणालय, डेनमार्क के पर्यावरण और खाद्य मंत्रालय (परमिट 2018-15-0201-01397), और यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63/ईयू के अनुसार स्थानीय नैतिकता समिति की अनुमति से आयोजित किए गए थे, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (प्रकाशन संख्या 85-3) और पशु प्रयोग (1987) को नियंत्रित करने वाले डेनिश कानून के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए। यह एक टर्मिनल प्रक्रिया है, और मृत्यु का कारण गहरी संज्ञाहरण के तहत डायाफ्राम का एक्सेंगुइनेशन और वेध है।
1. प्रायोगिक जानवर
- वांछित तनाव, उम्र और लिंग के चूहों को प्राप्त करें। इस अध्ययन में 11-16 सप्ताह की आयु के पुरुष C57BL/6JRj चूहों का उपयोग किया गया। चाउ और पानी के लिए एड लिबिटम एक्सेस के साथ प्रति पिंजरे में 5 नर या 8 मादा चूहों तक घर रखें और सुबह 6 बजे से शाम 6 बजे तक रोशनी के साथ 12 घंटे / 12 घंटे प्रकाश-अंधेरे चक्र को बनाए रखें।
2. प्रीऑपरेटिव तैयारी
- जिगर छिड़काव बफर बनाओ.
- क्रेब्स-हेन्सेलिट बफर। 118 mmol/L NaCl, 4.7 mmol/L KCl, 1.2 mmol/L MgSO 4, और 1.2 mmol/L KH 2 PO4 को dH 2 O में मिलाएं और घोलें। एक अलग बीकर में 1.25 mmol/L CaCl2घोलें और बफर डालें।
- 25 mmol / एल NaHCO3 भंग और सरगर्मी करते हुए बफर करने के लिए धीरे से जोड़ें. बफर को 4 डिग्री पर स्टोर करें। बफर कम से कम 1 महीने के लिए स्थिर है।
नोट: वर्षा तब हो सकती है जब CaCl2 और NaHCO3 जोड़े जाने से पहले व्यक्तिगत रूप से भंग नहीं होते हैं।
- एक 2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से छिड़काव बफर फ़िल्टर और एचसीएल का उपयोग कर 7.5 करने के लिए पीएच समायोजित करें.
नोट: यह कदम प्रयोगात्मक दिन पर किया जाना चाहिए, क्योंकि पीएच समय के साथ बढ़ता है, यहां तक कि जब बंद फ्लास्क में संग्रहीत किया जाता है। - वांछित अंतिम एकाग्रता की तुलना में एक उच्च एकाग्रता में परीक्षण यौगिकों तैयार (उदाहरण के लिए, 20x एकाग्रता जब एक sidearm पंप के माध्यम से 0.175 एमएल / मिनट की दर से infused) फ़िल्टर्ड और पीएच समायोजित Krebs-Henseleit छिड़काव बफर में. यदि प्रासंगिक है, तो 1% बीएसए के साथ क्रेब्स-हेन्सेलिट परफ्यूजन बफर में पतला परीक्षण यौगिकों को एक वाहक के रूप में जोड़ा गया (टयूबिंग और कांच के बने पदार्थ के आसंजन से बचने के लिए, सभी पेप्टाइड्स के लिए आवश्यक), एक उपयुक्त आकार फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया।
3. ऑपरेशन और छिड़काव
नोट: इस अध्ययन में प्रयुक्त छिड़काव सेटअप का एक उदाहरण चित्र 1में प्रदान किया गया है।
- जिगर को पर्याप्त ऑक्सीजन की आपूर्ति करने और ऑपरेशन की शुरुआत से सही पीएच बनाए रखने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए छिड़काव बफर (95% ओ 2, 5% सीओ2) गैस (बाइकार्बोनेट बफर सिस्टम निरंतर गैसिंग के तहत 7.4 के पीएच तक पहुंच जाएगा, पूरक चित्र 1 देखें)।
- इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा केटामाइन (90 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) को प्रशासित करके एक माउस को एनेस्थेटाइज़ करें।
- माउस लापरवाह को एक गर्म ऑपरेशन टेबल पर रखें और पैर की अंगुली चुटकी के जवाब में सजगता की कमी की पुष्टि करें। कैंची से चिपके से बालों को रखने के लिए 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें। गर्म सतह के लिए माउस फिक्सिंग निम्नलिखित प्रक्रियाओं के लिए स्थिरता बढ़ाने में मदद करता है.
- पेट के आधार पर कैंची के साथ एक चीरा बनाओ और पेट की गुहा को बेनकाब करने के लिए दोनों तरफ रिबकेज में ऊपर की ओर कटौती. एक कपास झाड़ू का उपयोग कर सही करने के लिए आंतों ले जाएँ, पोर्टल शिरा उजागर.
- घुमावदार संदंश का उपयोग पोर्टल शिरा के नीचे दो संयुक्ताक्षर प्लेस और प्रत्येक संयुक्ताक्षर के लिए एक ढीला गाँठ तैयार.
- पोर्टल शिरा में एक 0.7 मिमी कैथेटर डालें. जब छिद्रित, कैथेटर से सुई को हटा दें और कैथेटर की नोक जिगर के करीब है, जब तक नस के माध्यम से कैथेटर गाइड, चित्रा 2 में सचित्र के रूप में. कैथेटर में रक्त बहता है।
- संयुक्ताक्षर को कस लें। यदि कैथेटर रक्त से भरा नहीं है, तो इसे छिड़काव बफर के साथ भरें ताकि एक हवाई बुलबुले की शुरूआत से बचा जा सके।
- छिड़काव ट्यूब संलग्न करें और 0.8 एमएल/मिनट की छिड़काव प्रवाह दर पर रोलर पंप शुरू करके 37 डिग्री सेल्सियस पर क्रेब्स-हेन्सेलिट बाइकार्बोनेट बफर के साथ जिगर के छिड़काव शुरू करें। जिगर सेकंड के भीतर पीला हो जाता है।
- कैंची का उपयोग करके रिबकेज और डायाफ्राम को काटें। इस बिंदु पर, जानवर को इच्छामृत्यु दी जाती है। ठीक बिंदु संदंश का उपयोग कर suprahepatic अवर vena कावा के तहत एक संयुक्ताक्षर रखें. नस को अधिक सुलभ बनाने के लिए माउस के पीछे एक पेन, लुढ़का हुआ धुंध, या कोई अन्य डिस्पोजेबल आइटम रखें।
- दिल के दाहिने आलिंद के माध्यम से suprahepatic अवर vena कावा में एक कैथेटर डालें. जब छिद्रित, कैथेटर से सुई को हटा दें और कैथेटर की नोक जिगर के करीब है जब तक नस के माध्यम से कैथेटर गाइड. रक्त और छिड़काव बफर तुरंत बाहर चलाता है.
- संयुक्ताक्षर कस और छिड़काव प्रवाह के संग्रह के लिए एक ट्यूब देते हैं. निविड़ अंधकार टेप (चिकना टेप या इसी तरह) के साथ सभी ट्यूबों को सुरक्षित करें।
- मिश्रण को रोकने के लिए सही गुर्दे की नस के ठीक ऊपर इन्फ्राहेपेटिक वेना कावा में एक पोत क्लैंप रखने के लिए एक पोत क्लैंप एडाप्टर का उपयोग करें(चित्रा 2)।
- छिड़काव प्रवाह दर को 3.5 एमएल/मिनट तक बढ़ाएं और टाइमर शुरू करें। दबाव रिकॉर्डिंग शुरू करें। सफल छिड़काव आमतौर पर ~ 10 मिमी /
- खारा के साथ सिक्त एक बाँझ कपड़ा के साथ जिगर को कवर और प्रयोग के दौरान खारा जोड़ने के लिए यह सूखने से रोकने के लिए.
- 1 मिनट के लिए छिड़काव प्रवाह ले लीजिए और मात्रा को मापने. मात्रा लगभग 3.5 एमएल / मिनट होना चाहिए। इस स्तर पर रक्त के मिश्रण की उम्मीद नहीं की जाती है, और हृदय अब पंप नहीं करता है।
- प्रयोग शुरू करने से पहले 30 मिनट की एक संतुलन अवधि के लिए प्रतीक्षा करें.
चित्रा 1: छिड़काव सेटअप का एक चित्रण। (ए) ऑपरेटिंग टेबल को तिपाई स्टैंड पर ऊंचा किया जाता है और 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है। छिड़काव बफर gassed है (95% हे 2, 5% सीओ2), एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला रोलर पंप के माध्यम से पंप, और एक निर्मित बुलबुला जाल के साथ गर्मी एक्सचेंजर में गरम किया. इसके अलावा प्रणाली छिड़काव दबाव के समायोजन के लिए एक दबाव नापने का यंत्र और धुरी पंप के होते हैं. छिड़काव दबाव लगातार दर्ज की गई है और एक पीसी, एक दबाव रिकॉर्डिंग कार्यक्रम पर एक ट्रांसड्यूसर के माध्यम से कल्पना की है. (बी) लाल बॉक्स तीन-तरफा स्टॉपकॉक के कनेक्शन को पकड़ता है। पहला तीन-तरफा स्टॉपकॉक एक सिरिंज पंप के माध्यम से एक परीक्षण यौगिक के जलसेक के लिए खुला है, और दूसरा बंद है। तीसरा निरंतर दबाव माप के लिए खुला है। चौथे पानी निकलने की टोंटी इनपुट नमूने एकत्र करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, perfused जिगर भर में गैस विश्लेषण. कनेक्टर्स को अधिक या कम जलसेक लाइनों की आवश्यकता वाले विशिष्ट प्रयोगों के लिए आवश्यकतानुसार संशोधित किया जा सकता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: जिगर छिड़काव से पहले और दौरान माउस पेट गुहा की तस्वीरें. (ए)हरे रंग की डॉट पोर्टल शिरा कैथेटर की नोक के स्थान को इंगित करता है. यह महत्वपूर्ण है कि कैथेटर की नोक बस पोर्टल शिरा के शाखा बिंदु के नीचे बाएं और दाएं यकृत पोर्टल नसों में लेकिन रिसाव से बचने के लिए अग्नाशय-ग्रहणी शाखा के ऊपर स्थित है. पीला बिंदु सही गुर्दे की नस और यकृत के बीच इन्फ्राहेपेटिक अवर वेना कावा पर पोत क्लैंप के सही स्थान को इंगित करता है ताकि सुगंधित यकृत में रक्त के बैकफ्लो से बचा जा सके। (बी, सी) पोर्टल शिरा (बी) और सुपरहेपेटिक अवर वेना कावा (सी) में डाले गए दो कैथेटर के साथ एक सुगंधित माउस लीवर और इन्फ्राहेपेटिक अवर वेना कावा (बी) पर पोत क्लैंप। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
4. प्रयोग
- संतुलन अवधि के अंत में एक अंश कलेक्टर का उपयोग कर पहले आधारभूत नमूने एकत्र करके प्रयोग शुरू करें. वांछित समय अंतराल पर नमूने ले लीजिए और उन्हें तुरंत बर्फ पर जगह है.
- बुलबुला जाल नियमित रूप से जाँच करें और छिड़काव बफर के साथ फिर से भरना जब खाली करने के लिए करीब.
- एक तीन तरह पानी निकलने की टोंटी के माध्यम से बफर का एक नमूना ले लीजिए तुरंत इससे पहले कि यह अंग में प्रवेश करती है और एकत्रित कैथेटर से अवर वेना कावा में डाला (के बाद यह जिगर के माध्यम से perfused किया गया है).
- रक्त गैस विश्लेषक के साथ नमूनों को मापें ताकि यह पुष्टि हो सके कि अंग चयापचय रूप से सक्रिय है (सीओ2 के आंशिक दबाव में वृद्धि और पीएच में कमी से संकेत मिलता है)।
- प्रयोग के अंत में चरण 4.3-4.4 दोहराएं प्रयोग भर में व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए (अनुपूरक चित्रा 2).
नोट: ऑक्सीजन आंशिक दबाव में कमी टयूबिंग, अंग आदि से ऑक्सीजन के नुकसान के कारण श्वसन का एक विश्वसनीय उपाय प्रदान नहीं करती है। - आधारभूत छिड़काव के 15 मिनट के बाद, एक सिरिंज पंप (जैसे, परीक्षण पदार्थ की 20x एकाग्रता जब 0.175 एमएल / मिनट की दर से एक साइडआर्म पंप के माध्यम से संचारित) का उपयोग कर वांछित प्रवाह दर पर एक तीन तरह पानी निकलने की टोंटी के माध्यम से एक परीक्षण पदार्थ infusing द्वारा पहली उत्तेजना शुरू. वैकल्पिक रूप से, बेसलाइन बफर को एक नए (ऑक्सीजन युक्त और गर्म) बफर पर स्विच करें जिसमें अंतिम एकाग्रता में परीक्षण यौगिक हो।
- उत्तेजना बंद करो और दूसरी उत्तेजना शुरू करने से पहले 20-30 मिनट के लिए आधारभूत नमूने इकट्ठा.
- प्रयोग के अंत में, 5-10 मिनट के लिए एक उपयुक्त सकारात्मक नियंत्रण डालना.
- प्रयोग के बाद, सुगंधित जिगर आबकारी और जिगर के वजन के लिए उत्पादन को सामान्य करने के लिए यह वजन. प्रोटीन सामग्री के उत्पादन को सामान्य करने के लिए प्रोटीन सामग्री के संभावित माप के लिए तरल नाइट्रोजन में जिगर को स्नैप-फ्रीज करें।
5. जैव रासायनिक माप
- छिड़काव बफर (घर में या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वर्णमिति या एलिसा परख) में माप के लिए उपयुक्त assays का उपयोग कर ब्याज के अणु की एकाग्रता यों का पालन. बफर अधिकांश ओमिक्स-आधारित तकनीकों जैसे मेटाबोलामिक्स और प्रोटिओमिक्स के साथ संगत है।
नोट: इस अध्ययन में, यूरिया पहले वर्णित एक वर्णमिति परख के आधार पर मापा गया था14. ग्लूकोज और गैर-एस्टरिफाइड फैटी एसिड को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई थी।
6. डेटा विश्लेषण
- समय के साथ स्रावी आउटपुट दिखाते हुए XY ग्राफ़ में डेटा प्रस्तुत करें।
नोट: यह इन विट्रो छिड़काव प्रणाली के गुणों में से एक है कि आउटपुट (एमएमओएल / एल) में मापा एकाग्रता के बजाय वास्तविक आउटपुट (प्रवाह दर × एकाग्रता, जैसे, μmol/min) के रूप में डेटा को व्यक्त करना संभव है। जिगर वजन के लिए उत्पादन सामान्य जब विभिन्न माउस मॉडल या कुल प्रोटीन सामग्री (बीसीए द्वारा मापा जाता है) की तुलना जब मोटापे या जिगर की बीमारियों के साथ माउस मॉडल के लिए नियंत्रण चूहों की तुलना जहां जिगर के वजन में वृद्धि हुई वसा सामग्री के कारण हो सकता है पर विचार करें. - पशु प्रति व्यक्तिगत डॉट्स के रूप में प्रस्तुत करें आधारभूत के दौरान और एक उत्तेजना अवधि (आमतौर पर 15-30 मिनट) या अध्ययन डिजाइन पर निर्भर प्रत्येक उत्तेजना अवधि के लिए पूर्ववर्ती आधार रेखा का उपयोग कर वृद्धिशील उत्पादन का प्रतिनिधित्व करते हुए।
- कई परीक्षण के लिए एक उपयुक्त पोस्ट-हॉक परीक्षण के साथ बार-बार उत्तेजनाओं (दो से अधिक समूहों) के साथ युग्मित टी-टेस्ट (दो समूहों) या एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें।
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Representative Results
यह निर्धारित करने के लिए एक स्थिर आधार रेखा की आवश्यकता होती है कि क्या एक उत्तेजना या सब्सट्रेट ब्याज के अणु की रिहाई की ओर जाता है। चित्रा 3 ए एक सफल प्रयोग का एक उदाहरण दिखाता है। सुगंधित यकृत में यूरिया का उत्पादन 2 मिनट के अंतराल में मापा जाता है और एसईएम ± मतलब के रूप में दिखाया जाता है। दो उत्तेजना अवधियों में से प्रत्येक से पहले आधारभूत अवधि स्थिर हैं। दो उत्तेजना अवधि और संबंधित पूर्ववर्ती बेसलाइन के दौरान औसत यूरिया उत्पादन चित्रा 3 बी में दिखाया गया है। अवधियों के बीच सांख्यिकीय महत्व दोहराया माप के साथ एक तरह से एनोवा का उपयोग कर परीक्षण किया गया था. इन परिणामों के आधार पर, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि मिश्रित अमीनो एसिड के साथ लगातार दो उत्तेजनाओं के लिए यूरिया प्रतिक्रिया समान है, जो विभिन्न खुराक या परीक्षण यौगिकों के साथ बार-बार उत्तेजनाओं का मूल्यांकन करने में एक महत्वपूर्ण नियंत्रण प्रयोग है।
ureagenesis के अलावा, यह उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग यकृत glycogenolysis और lipolysis का अध्ययन करने के लिए संभव है. चित्रा 3 सी-एफ ग्लूकागन के साथ जलसेक के दौरान एक अलग प्रयोग से डेटा दिखाते हैं। ग्लूकोज (चित्रा 3 सी) और गैर एस्टरिफाइड फैटी एसिड (एनईएफए)(चित्रा 3ई)की रिहाई 4 मिनट की अवधि में मापा गया था. ग्लूकोज (चित्रा 3 सी) और एनईएफए (चित्रा 3ई) की एक स्थिर बेसल रिलीज क्रमशः ग्लूकागन जलसेक के दौरान ग्लूकोज और एनईएफए में मजबूत वृद्धि से पहले मनाया जाता है। बेसल अवस्था में और ग्लूकागन जलसेक के दौरान औसत मूल्यों के आधार पर, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि ग्लूकागन तेजी से यकृत ग्लाइकोजेनोलिसिस(चित्रा 3डी)और लिपोलिसिस(चित्रा 3एफ)को उत्तेजित करता है।
चित्रा 4 जाहिरा तौर पर असफल प्रयोगों का एक उदाहरण दिखाता है। यूरिया की बेसल रिलीज अस्थिर है, और अगली उत्तेजना शुरू होने से पहले बेसल स्तर पर लौटने के लिए यूरिया उत्पादन के लिए उत्तेजना अवधि एक दूसरे के बहुत करीब है। स्थिर बेसल अवधि के बिना, एक यूरिया प्रतिक्रिया को अगले से अलग करना संभव नहीं है। इन आंकड़ों से, यह निष्कर्ष निकालना असंभव है कि विभिन्न ग्लूकोज सांद्रता सुगंधित माउस यकृत में अमीनो एसिड-प्रेरित यूरेजेनेसिस को प्रभावित करती है या नहीं। प्रायोगिक प्रोटोकॉल इसके बजाय प्रत्येक उत्तेजना अवधि से पहले एक स्थिर आधार रेखा तक पहुँचने के लिए दो लगातार उत्तेजनाओं के बीच आधारभूत अवधि के 20-30 मिनट के साथ डिजाइन किया जाना चाहिए.
चित्रा 3: perfused माउस जिगर से अच्छी गुणवत्ता वाले डेटा. (ए, बी) यूरिया कुल बेसल स्थितियों के दौरान और मिश्रित अमीनो एसिड (10 मिमी) और ग्लूकोज (6 मिमी) के प्रशासन की अवधि के जवाब में दिखाया गया है। डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं (ए) एसईएम ± मतलब और (बी) प्रत्येक उत्तेजना और पूर्ववर्ती बेसल अवधि के दौरान मतलब मूल्यों (प्रत्येक डॉट एक माउस का प्रतिनिधित्व करता है), एन = 6. (सी, डी) ग्लूकोज और (ई, एफ) गैर-एस्टरिफाइड मुक्त फैटी एसिड (एनईएफए) कुल आउटपुट बेसल स्थितियों और ग्लूकागन (10 एनएम) के प्रशासन की प्रतिक्रिया में दिखाए जाते हैं। डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं (सी, ई) SEM ± मतलब और (डी, एफ) बेसल और उत्तेजना अवधि के दौरान मतलब मूल्यों (प्रत्येक डॉट एक माउस का प्रतिनिधित्व करता है), एन = 6. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: perfused माउस जिगर से खराब गुणवत्ता डेटा. यूरिया कुल उत्पादन मिश्रित अमीनो एसिड (10 मिमी) और ग्लूकोज की घटती सांद्रता (18 मिमी, 12 मिमी, 6 मिमी, 3 मिमी, और 0 मिमी) के जवाब में बेसल स्थितियों में दिखाया गया है। डेटा को SEM, n = 3 ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
अनुपूरक चित्रा 1: 95% ओ 2 + 5% सीओ 2 के साथ गैसिंग के दौरान क्रेब्स-हेंसेलिट बाइकार्बोनेट बफर में ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड और पीएच का समय-निर्भर आंशिक दबाव। (ए) ऑक्सीजन का आंशिक दबाव, (बी) कार्बन डाइऑक्साइड, और (सी) पीएच क्रेब्स-हेन्सेलिट परफ्यूजन बफर (पीएच प्रयोग से पहले समायोजित नहीं) के नमूनों में 95% ओ 2 + 5% सीओ2 के साथ गैसिंग की शुरुआत के बाद संकेतित समय बिंदुओं पर छिड़काव प्रणाली के माध्यम से चलाने के बाद एकत्र किया गया। छिड़काव बफर नमूने एक रक्त गैस विश्लेषक के साथ मापा गया. कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
अनुपूरक चित्रा 2: सुगंधित यकृत में ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड और पीएच के आंशिक दबाव में परिवर्तन। (ए) ऑक्सीजन का आंशिक दबाव, (बी) कार्बन डाइऑक्साइड, और (सी) पीएच क्रेब्स-हेन्सेलिट परफ्यूजन बफर के नमूनों में यकृत तक पहुंचने से तुरंत पहले एकत्र किया गया और एक प्रयोग में 1 मिनट और 180 मिनट में सुगंधित यकृत पारित होने के बाद। छिड़काव के नमूनों को रक्त-गैस विश्लेषक के साथ मापा गया था। डेटा एसडी ± मतलब के रूप में दिखाया गया है. ** पी < 0.01, **** पी < 0.0001 होल्म-सिडक विधि का उपयोग कर कई परीक्षण के लिए सही कई युग्मित टी परीक्षणों द्वारा. एन = 14। कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
पृथक perfused माउस जिगर यकृत चयापचय की गतिशीलता और आणविक तंत्र के अध्ययन के लिए एक मजबूत अनुसंधान उपकरण है. मिनट-टू-मिनट नमूना संग्रह की संभावना यकृत पर एक परीक्षण यौगिक के प्रत्यक्ष प्रभाव का विस्तृत मूल्यांकन प्रदान करती है। विवो अध्ययनों की तुलना में, सुगंधित यकृत हमें रक्त द्वारा किए गए अतिरिक्त-यकृत कारकों से बचने और प्रयोगात्मक स्थितियों पर पूर्ण नियंत्रण के साथ एक अलग तरीके से यकृत चयापचय का अध्ययन करने की अनुमति देता है। पृथक हेपेटोसाइट्स का उपयोग करके इन विट्रो अध्ययनों की तुलना में यकृत छिड़काव के फायदे यकृत वास्तुकला, ध्रुवीयता, क्षेत्रीय विभाजन और संवहनी अखंडता का रखरखाव हैं। जिगर छिड़काव का एक अन्य लाभ बड़े नमूना आकार की मात्रा (3.5 एमएल / मिनट) है, एक ही नमूने में कई परिणामों के माप की अनुमति. हालांकि, ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन पर निर्भर प्रभावों का अध्ययन करते समय छिद्रित यकृत आदर्श नहीं है क्योंकि इस तरह के तंत्र को होने में कई घंटे लग सकते हैं। चयापचय अनुसंधान के अलावा, प्रोटोकॉल अन्य अनुसंधान क्षेत्रों में लागू किया जा सकता है जिगर के अंतःस्रावी कार्यों (हार्मोन और hepatokines का स्राव) और दवाओं और xenobiotics के जिगर चयापचय का अध्ययन करने के लिए.
इस विधि के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम पोर्टल शिरा में कैथेटर की नियुक्ति है. यह महत्वपूर्ण है कि कैथेटर की नोक तुरंत बाएं और दाएं यकृत पोर्टल नसों (चित्रा 2) में पोर्टल शिरा की शाखा बिंदु से पहले तैनात है. यदि कैथेटर की नोक को बहुत दूर धकेल दिया जाता है, तो यकृत का केवल एक हिस्सा ठीक से सुगंधित हो जाएगा। यदि इसे पोर्टल शिरा में बहुत नीचे रखा जाता है, तो अग्नाशय-ग्रहणी शाखा के माध्यम से रिसाव हो सकता है। संग्रह के लिए दूसरे कैथेटर की नियुक्ति कम जरूरी है क्योंकि इस चरण में यकृत पहले से ही ऑक्सीजन युक्त बफर के साथ सुगंधित है। जब ऑपरेशन सफलतापूर्वक किया गया है, तो यकृत एक निरंतर दबाव और छिड़काव उत्पादन (पूरक चित्रा 2) के साथ कम से कम 3 घंटे के लिए श्वसन और उत्तरदायी होगा। इस स्तर पर, छिड़काव प्रणाली में हवा के बुलबुले से बचाव एक सफल प्रयोग के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक है. हवा के बुलबुले पूरी तरह से बचने के लिए मुश्किल है क्योंकि बफर लगातार ऑक्सीजन के साथ gassed है, लेकिन बुलबुले छिड़काव प्रणाली के बुलबुला जाल में फंस जाना चाहिए. इसलिए यह बुलबुला जाल पर नजर रखने के लिए और छिड़काव बफर के साथ फिर से भरना जब यह खाली करने के करीब है महत्वपूर्ण है.
Krebs-Henseleit बफर (केएचबी) जिगर छिड़काव13 के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया समाधान है. शास्त्रीय सूत्रीकरण में 2.5 mmol / L CaCl 2 होता है, लेकिन पिछले अध्ययन के आधार पर दिखाया गया है कि कैल्शियम माइटोकॉन्ड्रियल क्षति में योगदान देता है, हम केवल 1.25 mmol / L CaCl212 के साथ एक बफर का उपयोग करते हैं। एरिथ्रोसाइट्स, एल्ब्यूमिन, या बफर के लिए ग्लूकोज के अलावा11 की जरूरत नहीं है. प्रस्तावित बफर उन्नत जैव रासायनिक तकनीकों जैसे मास-स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित मेटाबोलॉमिक्स का उपयोग करके आणविक प्रोफाइलिंग की भी अनुमति देता है। इष्टतम खुराक निर्धारित करने और शारीरिक बनाम औषधीय प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए एक परीक्षण यौगिक की विभिन्न सांद्रता का परीक्षण किया जा सकता है। इस अध्ययन में किए गए प्रयोगों में, 10 एमएम एए पोस्टप्रैंडियल स्तरों के अनुरूप उच्च शारीरिक सीमा में है, जबकि 10 एनएम ग्लूकागन एक औषधीय खुराक से मेल खाती है। जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, संबंधित प्रतिक्रियाओं की गतिशीलता और आणविक तंत्र की तुलना करने में सक्षम होने के लिए दो लगातार उत्तेजनाओं के बीच 20-30 मिनट आधारभूत अवधि को शामिल करना आवश्यक है।
इत्र के नमूनों में रक्त से बचना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह बाद के विश्लेषणों में हस्तक्षेप कर सकता है, उदाहरण के लिए, यूरिया और ग्लूकोज सांद्रता का वर्णमिति निर्धारण। यदि संतुलन अवधि में ~ 15 मिनट के बाद एकत्र नमूनों में रक्त दिखाई देता है, जब एक 3-तरफा वाल्व जलसेक के लिए खोला जाता है, या जब बुलबुला जाल भर जाता है, तो इन्फ्राहेपेटिक वेना कावा पर पोत क्लैंप की संभावना सही ढंग से नहीं रखी जाती है।
हमारे अनुभव में, एक सफल आपरेशन ~ 10 mmHg के एक स्थिर पोर्टल दबाव और एकत्रित कैथेटर डालने के बाद कुछ ही मिनटों के भीतर 3.5 एमएल / मिनट की एक उत्पादन प्रवाह दर में परिणाम. यदि दबाव काफी अधिक है या लगातार बढ़ रहा है, या यदि एकत्रित उत्पादन प्रवाह दर 3.5 एमएल / मिनट या लगातार गिर नहीं है, तो कई घटनाओं पर विचार किया जाना चाहिए: 1) क्या सभी यकृत लोब समान रूप से सुगंधित हैं और एक समान पीला रंग दिखा रहे हैं? यदि नहीं, तो एक रोड़ा हो सकता है (अक्सर एक हवाई बुलबुला; ध्यान से एक कपास की छड़ी के साथ जिगर लोब "मालिश"; यह कभी-कभी हवा के बुलबुले को छोड़ने में मदद करता है जिससे दबाव तुरंत गिर जाएगा), या पोर्टल शिरा कैथेटर को बहुत दूर धकेल दिया गया है, इस प्रकार यकृत पोर्टल शिरा की दो शाखाओं में से केवल एक की आपूर्ति होती है (सावधानी से कैथेटर को कुछ मिलीमीटर वापस खींचने की कोशिश करें)। 2) क्या सुपरहेपेटिक अवर वेना कावा मुड़ गया है? यह तब हो सकता है जब एकत्रित ट्यूब के पुरुष भाग को नस में डाले गए कैथेटर के महिला भाग से जोड़ा जाता है; सावधानी से एकत्रित ट्यूब को हटा दें और निरीक्षण करें कि क्या दबाव गिरता है। 3) क्या एकत्रित कैथेटर को सुपरहेपेटिक अवर वेना कावा से बहुत दूर धकेल दिया गया है, इसलिए कैथेटर की नोक यकृत में घुस गई है? यदि आवश्यक हो तो सावधानी से कुछ मिलीमीटर वापस ले लें।
सारांश में, perfused माउस जिगर इन विट्रो प्रयोगात्मक मॉडल है कि जिगर पर किसी दिए गए यौगिक के गतिशील प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता में एक शारीरिक रूप से प्रासंगिक है. प्राप्त डेटा की गुणवत्ता के लिए ऑपरेशन की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है, और हमारे अनुभव में, संतोषजनक गुणवत्ता के डेटा की उम्मीद करने से पहले ~ 2 महीने का प्रशिक्षण लगता है। एक बार तकनीक सीख लेने के बाद, इस पद्धति के साथ संभावनाएं कई हैं, जिसमें ब्याज के जीन के साथ-साथ यकृत रोगों के माउस मॉडल के बारे में ट्रांसजेनिक या नॉकआउट दाता जानवरों का उपयोग शामिल है। प्रयोग, हालांकि, संभावित विषाक्त दुष्प्रभावों (जो विवो में बहुत अधिक गंभीर होने की संभावना है) या परीक्षण यौगिकों की खराब घुलनशीलता द्वारा सीमित हो सकते हैं। इस तरह के यौगिकों छिड़काव से पहले एक उचित समय अवधि में दाता जानवरों के लिए मौखिक रूप से दिया जा सकता है.
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Disclosures
लेखक इस लेख के लिए प्रासंगिक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।
Acknowledgments
अध्ययन और निकोलाई जे वेवर अल्ब्रेक्ट को नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन एक्सीलेंस इमर्जिंग इन्वेस्टिगेटर ग्रांट - एंडोक्रिनोलॉजी एंड मेटाबोलिज्म (आवेदन संख्या) द्वारा समर्थित किया गया था। NNF19OC0055001), यूरोपियन फाउंडेशन फॉर द स्टडी ऑफ डायबिटीज फ्यूचर लीडर अवार्ड (NNF21SA0072746) और इंडिपेंडेंट रिसर्च फंड डेनमार्क, सपेरे ऑड (1052-00003B)। नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन सेंटर फॉर प्रोटीन रिसर्च नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन (अनुदान समझौता NNF14CC0001) द्वारा आर्थिक रूप से समर्थित है। चित्रा 1 बी biorender.com के साथ बनाया गया था। हम डॉ. रूण ई. कुहरे (नोवो नॉर्डिस्क ए/एस) को सुगंधित माउस लीवर पर फलदायी चर्चा के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-way stopcock | BD | 394601 | |
| Altromin breeding diet | Altromin Spezialfutter | 1319 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma | C8106 | |
| Catheters (0.7 mm) | BD | 381812 | |
| Filter paper (pore size 2.0 µm) | Millipore | AP2029325 | |
| Glucose kit | QuantiChromTM | DIGL-100 | Low concentration protocol |
| Ketamine | MSD Animal Health | 511485 | 90 mg/kg |
| Ligature (black sterile silk) | Agnthos | 14739 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | 230391 | |
| Non-esterified fatty acids kit | Fujifilm Wako Chemicals | NEFA-HR(2) | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate(KH2PO4) | Merck | 1.04877 | |
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Sleek tape | Mediq danmark | 4001910 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | |
| Thermostatic Circulator | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | Bath Volume 3 L, 230 V/50 Hz |
| Tubing | Tygon | E3603 | Inner diameter 1.59 mm, outer diameter 3.18 mm |
| Universal perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | Basic unit uniper UP-100, type 834 |
| Vamin | Fresenius Kabi | B05ABA01 | Mixed amino acids |
| Vessel clamp adaptor | Deutsche Biomedical | DBC1002 | |
| Vessel clamps | Deutsche Biomedical | DBC1005 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Xylazine | Rompun Vet | 530701 | 10 mg/kg |
References
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