Summary
여기에서, 우리는 간 구조를 방해하지 않으면서 간 외 요인이 없는 상태에서 간 대사의 급성 및 직접적인 조절을 연구하기 위해 쥐 간의 현장 관류를 위한 강력한 방법을 제시합니다.
Abstract
간은 영양소 대사를 포함한 다양한 기능을 가지고 있습니다. 간 연구의 다른 시험관 및 생체 내 모델과 달리 분리된 관류된 간은 간외 요인의 영향에서 분리된 온전한 간 구조로 전체 간의 간 생물학 및 대사를 연구할 수 있습니다. 간 관류는 원래 쥐를 위해 개발되었지만 이 방법은 쥐에도 적용되었습니다. 여기서는 마우스 간의 in situ 관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 간은 산소가 공급된 Krebs-Henseleit 중탄산염 완충액으로 문맥을 통해 전위적으로 관류되고, 출력은 회로를 닫기 위해 하대정맥을 클램핑하여 상하정맥에서 수집됩니다. 이 방법을 사용하면 테스트 화합물의 직접적인 간 효과를 자세한 시간 분해능으로 평가할 수 있습니다. 간 기능 및 생존력은 최소 3시간 동안 안정적이므로 동일한 실험에서 내부 대조군을 포함할 수 있습니다. 이 모델을 사용한 실험 가능성은 무궁무진하며 간 생리학 및 간 질환에 대한 통찰력을 추론할 수 있습니다.
Introduction
간은 신진대사에 필수적인 기관입니다. 포도당, 지질, 아미노산 대사를 조절하여 전신 에너지 균형을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 전 세계적으로 간 질환의 증가는 주요 글로벌 건강 부담으로 부상하고 있으며 병태 생리학과 간 기능에 미치는 영향에 대한 더 많은 지식이 필요합니다.
in vivo 연구를 보완하기 위해 간 연구를 위해 다양한 in vitro 모델이 개발되었습니다. 설치류와 인간으로부터 분리되고 배양된 1차 간세포가 널리 사용됩니다. 비실질 세포는 차등 및 기울기 원심분리를 사용하여 간세포에서 분리할 수 있으며, 서로 다른 세포 유형의 공동 배양은 세포 간 누화1을 연구하는 데 유용합니다. 1차 인간 간세포는 약물 독성 테스트의 황금 표준으로 간주되지만, 여러 연구에 따르면 간세포는 조직 배양에서 빠르게 역분화되어 간 기능을 상실하는 것으로 나타났습니다 2,3,4. 3D 스페로이드 시스템에서의 간세포 배양은 역분화를 개선하고, 더 안정적이며, 기존의 2D 배양 시스템보다 생체 내에서 간을 더 높은 수준으로 모방하는 것으로 보인다5. 정밀하게 절단된 간 절편은 조직 구조를 그대로 유지하고 간에 존재하는 비실질 세포를 포함하는 또 다른 잘 정립된 체외 모델이다6. 보다 발전된 in vitro 모델에는 liver-on-a-chip7 및 간 오가노이드8가 포함됩니다. 그러나 이러한 모든 접근 방식에서는 벡터 문맥-간 정맥 흐름을 포함한 구조적 무결성 및 흐름 역학이 손실되어 일반화 가능성에 영향을 미칠 수 있습니다.
분리된 관류된 쥐의 간은 1855년 클로드 베르나르(Claude Bernard)에 의해 처음 기술되었으며, 9 간생물학, 독성학 및 병태생리학 연구를 위해 다양한 과학 분야에서 여전히 사용되고 있다. 위에서 언급한 시험관 내 모델과 비교하여 관류된 간의 장점에는 간 구조, 혈관 흐름, 간세포 극성 및 구역화, 간세포와 비실질 세포 간의 상호 작용이 유지됩니다. in vivo 연구와 비교했을 때, 관류된 간은 혈액에 의해 운반되는 간외 인자를 피하고 실험 조건을 완벽하게 제어하면서 격리된 방식으로 간 대사를 연구할 수 있습니다. 수년에 걸쳐 쥐의 간 관류 모델을 개선하기 위해 몇 가지 수정이 이루어졌습니다10,11,12,13. 쥐가 분리된 관류 간 연구에 사용되었지만, 문헌은 적습니다. 여기에서는 실시간으로 생쥐 간에서 배출되는 간에서 측정된 대사 기질 및 호르몬에 대한 급성 및 직접적인 대사 반응을 연구하기 위해 문맥 및 하대정맥의 캐뉼레이션에 의한 생쥐 간의 제자리 관류를 위한 방법을 제시합니다.
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Protocol
모든 동물실험은 덴마크 동물실험검사관, 덴마크 환경식품부(허가 2018-15-0201-01397) 및 현지 윤리위원회의 허가를 받아 EU 지침 2010/63/EU, 국립보건원(간행물 번호 85-3) 및 동물실험에 관한 덴마크 법률(1987)의 지침에 따라 수행되었습니다. 이것은 말기 절차이며 사인은 심부 마취 하에 횡격막의 출출 및 천공입니다.
1. 실험동물
- 원하는 균주, 연령 및 성별의 마우스를 얻습니다. 이 연구는 11-16주 된 수컷 C57BL/6JRj 마우스를 사용했습니다. 케이지 당 최대 5 마리의 수컷 또는 8 마리의 암컷 마우스를 수용하고 차우와 물에 대한 임시 접근을 허용하고 오전 6 시부 터 오후 6 시까 지 조명을 켜고 12 시간 / 12 시간 명암 사이클을 유지합니다.
2. 수술 전 준비
- 간 관류 완충액을 만드십시오.
- Krebs-Henseleit 버퍼. 118 mmol/L NaCl, 4.7 mmol/L KCl, 1.2 mmol/L MgSO 4 및 1.2 mmol/L KH 2 PO4를 dH 2 O에 혼합 및 용해시킵니다. 별도의 비커에 1.25 mmol/L CaCl2를 용해시키고 완충액을 추가합니다.
- 25mmol/L NaHCO3를 용해시키고 교반하면서 완충액에 천천히 첨가합니다. 버퍼를 4도에서 보관합니다. 버퍼는 최소 1개월 동안 안정적입니다.
참고: CaCl2 및 NaHCO3 를 첨가하기 전에 개별적으로 용해하지 않으면 침전이 발생할 수 있습니다.
- 2μm 필터를 통해 관류 완충액을 여과하고 HCl을 사용하여 pH를 7.5로 조정합니다.
알림: 이 단계는 밀폐된 플라스크에 보관하더라도 시간이 지남에 따라 pH가 증가하므로 실험 당일에 수행해야 합니다. - 여과 및 pH 조정 Krebs-Henseleit 관류 완충액에서 원하는 최종 농도(예: 사이드암 펌프를 통해 0.175mL/분의 속도로 주입 시 20배 농도)보다 높은 농도로 테스트 화합물을 준비합니다. 해당되는 경우, 1% BSA를 담체로 첨가한 Krebs-Henseleit 관류 완충액에 희석한 테스트 화합물(모든 펩타이드에 필수적인 튜브 및 유리 제품에 대한 접착을 방지하기 위해)을 적절한 크기의 필터를 통해 여과합니다.
3. 작동 및 관류
참고: 이 연구에 사용된 관류 설정의 그림은 그림 1에 나와 있습니다.
- 관류 완충액(95% O2, 5%CO2)을 최소 30분 동안 가스로 공급하여 간에 충분한 산소를 공급하고 작동 시작부터 올바른 pH를 유지합니다(중탄산염 완충 시스템은 연속 가스 발생 시 pH 7.4에 도달합니다. 보충 그림 1 참조).
- 복강 내 주사로 케타민(90mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)을 투여하여 마우스를 마취합니다.
- 가열된 수술대에 마우스를 누운 상태로 놓고 발가락 꼬집음에 대한 반응으로 반사 신경이 부족한지 확인합니다. 머리카락이 가위에 달라붙지 않도록 70% 에탄올을 뿌립니다. 마우스를 따뜻한 표면에 고정하면 다음 절차의 안정성을 높이는 데 도움이 됩니다.
- 복부 기저부를 가위로 절개하고 양쪽 흉곽까지 위쪽으로 절개하여 복강을 노출시킵니다. 면봉을 사용하여 장을 오른쪽으로 움직여 문맥을 노출시킵니다.
- 구부러진 집게를 사용하여 문맥 아래에 두 개의 합자를 놓고 각 합자에 대해 느슨한 매듭을 준비합니다.
- 문맥에 0.7mm 카테터를 삽입합니다. 구멍이 뚫리면 그림 2와 같이 카테터에서 바늘을 제거하고 카테터 끝이 간에 가까워질 때까지 카테터를 정맥을 통해 안내합니다. 혈액이 카테터로 흐릅니다.
- 합자를 조입니다. 카테터에 혈액이 채워져 있지 않으면 기포가 유입되지 않도록 관류 완충액으로 채우십시오.
- 관류 튜브를 부착하고 0.8mL/min의 관류 유속으로 롤러 펌프를 시작하여 37°C에서 Krebs-Henseleit 중탄산염 완충액으로 간 관류를 시작합니다. 간은 몇 초 안에 창백해집니다.
- 가위를 사용하여 흉곽과 횡격막을 자릅니다. 이 시점에서 동물은 안락사됩니다. 미세한 점포를 사용하여 suprahepatic inferior vena cava 아래에 합자를 놓습니다. 마우스 뒤쪽에 펜, 말린 거즈 또는 기타 일회용품을 놓아 정맥에 더 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.
- 심장의 우심방을 통해 하대정맥상에 카테터를 삽입합니다. 구멍이 뚫리면 카테터에서 바늘을 제거하고 카테터 끝이 간에 가까워질 때까지 카테터를 정맥을 통해 안내합니다. 혈액과 관류 완충액은 즉시 소진됩니다.
- 합자를 조이고 관류 유출물 수집을 위한 튜브를 부착합니다. 모든 튜브를 방수 테이프(매끄러운 테이프 또는 이와 유사한 테이프)로 고정합니다.
- vessel clamp 어댑터를 사용하여 혼합을 방지하기 위해 오른쪽 신장 정맥 바로 위의 infrahepatic vena cava를 가로질러 vessel clamp를 배치합니다(그림 2).
- 관류 유속을 3.5mL/분으로 높이고 타이머를 시작합니다. 압력 기록을 시작합니다. 성공적인 관류는 일반적으로 ~10mm/Hg의 압력을 초래합니다.
- 간을 식염수로 적신 멸균 드레이프로 덮고 실험 중에 식염수를 첨가하여 건조를 방지합니다.
- 1분 동안 관류 유출물을 수집하고 부피를 측정합니다. 부피는 약 3.5mL/분이어야 합니다. 이 단계에서는 혈액이 섞이지 않을 것으로 예상되며, 심장은 더 이상 펌프질을 하지 않습니다.
- 실험을 시작하기 전에 30분의 평형 기간 동안 기다리십시오.
그림 1: 관류 설정 그림. (A) 수술대를 삼각대 스탠드에 올려 놓고 37°C로 가열합니다. 관류 완충액은 가스화되고(95% O2, 5%CO2) 연동 롤러 펌프를 통해 펌핑되고, 버블 트랩이 내장된 열교환기에서 가열됩니다. 또한 이 시스템은 관류 압력 조정을 위한 압력 게이지와 스핀들 펌프로 구성됩니다. 관류 압력은 압력 기록 프로그램인 PC의 변환기를 통해 지속적으로 기록되고 시각화됩니다. (B) 빨간색 상자는 3방향 스톱콕의 연결을 캡처합니다. 첫 번째 3방향 마개는 주사기 펌프를 통해 테스트 화합물을 주입하기 위해 열려 있고 두 번째 마개는 닫혀 있습니다. 세 번째는 연속 압력 측정을 위해 열려 있습니다. 제4 마개는 예를 들어, 관류된 간을 가로지르는 가스 분석을 위해 입력 샘플을 수집하는데 사용될 수 있다. 커넥터는 더 많거나 적은 주입 라인이 필요한 특정 실험을 위해 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 간 관류 전과 관류 중 쥐 복강 사진 . (A)녹색 점은 문맥 카테터 끝의 위치를 나타냅니다. 카테터의 끝은 문맥의 분지 지점 바로 아래에 좌우 간문맥으로 위치하지만 누출을 방지하기 위해 췌장-십이지장 가지 위에 위치하는 것이 중요합니다. 노란색 점은 관류된 간으로 혈액이 역류하는 것을 방지하기 위해 오른쪽 신장 정맥과 간 사이의 하대정맥에 혈관 클램프의 정확한 위치를 나타냅니다. (나, 씨) 문맥(B)과 상하정맥(C)에 삽입된 두 개의 카테터와 혈관이 하대정맥(B)에 고정되어 있는 관류된 쥐 간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 실험
- 평형 기간이 끝날 때 분획 수집기를 사용하여 첫 번째 기준선 샘플을 수집하여 실험을 시작합니다. 원하는 시간 간격으로 샘플을 수집하여 즉시 얼음 위에 놓습니다.
- 버블 트랩을 정기적으로 점검하고 비어있을 때 관류 버퍼로 다시 채우십시오.
- 완충액이 장기에 들어가기 직전에 3방향 마개를 통해 그리고 하대정맥에 삽입된 수집 카테터(간을 통해 관류된 후)에서 완충액 샘플을 채취합니다.
- 혈액 가스 분석기로 샘플을 측정하여 장기가 대사 적으로 활성화되어 있는지 확인합니다 (CO2 분압 증가 및 pH 감소로 나타남).
- 실험이 끝날 때 4.3-4.4단계를 반복하여 실험 전반에 걸쳐 생존 가능성을 평가합니다(보충 그림 2).
알림: 산소 분압의 감소는 튜브, 장기 등의 산소 손실로 인해 신뢰할 수 있는 호흡 측정을 제공하지 않습니다. - 기준선 관류 15분 후 주사기 펌프를 사용하여 원하는 유속으로 3방향 스톱콕을 통해 테스트 물질을 주입하여 첫 번째 자극을 시작합니다(예: 사이드암 펌프를 통해 20mL/분의 속도로 주입할 때 테스트 물질의 0.175배 농도). 또는 기준선 완충액을 최종 농도에 시험 화합물을 포함하는 새로운(산소화 및 가열) 완충액으로 전환합니다.
- 자극을 멈추고 두 번째 자극을 시작하기 전에 20-30분 동안 기준선 샘플을 수집합니다.
- 실험이 끝나면 5-10분 동안 적절한 양성 대조군을 주입합니다.
- 실험 후 관류된 간을 절제하고 무게를 측정하여 간 무게에 대한 출력을 정규화합니다. 단백질 함량을 측정하기 위해 간을 액체 질소에 스냅 냉동하여 단백질 함량에 대한 출력을 정상화합니다.
5. 생화학적 측정
- 관류 완충액(사내 또는 상업적으로 이용 가능한 비색 또는 ELISA 분석)에서 측정에 적합한 분석을 사용하여 관심 분자의 농도를 정량화합니다. 이 완충액은 대사체학(metabolomics) 및 단백질체학(proteomics)과 같은 대부분의 오믹스 기반 기술과 호환됩니다.
참고: 이 연구에서 요소는 이전에 설명한 비색 분석을 기반으로측정되었습니다 14. 글루코스 및 비에스테르화 지방산은 시판되는 키트를 사용하여 정량하였다.
6. 데이터 분석
- 시간 경과에 따른 분비 출력을 보여주는 XY 그래프로 데이터를 표시합니다.
참고: in vivo 연구에서와 같이 측정된 출력(mmol/L) 대신 실제 출력(농도 × 유속, 예: μmol/min)으로 데이터를 표현할 수 있다는 것이 in vitro 관류 시스템의 장점 중 하나입니다. 다른 마우스 모델을 비교할 때 간 무게에 대한 출력을 정규화하거나, 지방 함량 증가로 인해 간 무게가 증가할 수 있는 비만 또는 간 질환이 있는 마우스 모델과 대조군 마우스를 비교할 때 총 단백질 함량(BCA로 측정)으로 정규화하는 것을 고려하십시오. - 요약 데이터를 기준선 및 자극 기간(일반적으로 15-30분) 동안 평균 또는 총 출력을 나타내는 동물당 개별 점으로 표시하거나 연구 설계에 따라 각 자극 기간에 대해 이전 기준선을 사용하여 증분 출력을 나타냅니다.
- 쌍체 t-검정(두 그룹) 또는 반복 자극이 있는 일원 분산 분석(두 개 이상의 그룹)을 사용하여 여러 검정을 위한 적절한 사후 검정을 사용하여 데이터를 분석합니다.
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Representative Results
자극 또는 기질이 관심 분자의 방출로 이어지는지 여부를 결정하기 위해서는 꾸준한 기준선이 필요합니다. 그림 3A 는 성공적인 실험의 예를 보여줍니다. 관류된 간에서 요소의 생성은 2분 간격으로 측정되며 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 두 자극 기간 각각에 앞서는 기준선 기간은 일정합니다. 두 자극 기간 동안의 평균 요소 생산량과 각각의 이전 기준선은 그림 3B에 나와 있습니다. 기간 간의 통계적 유의성은 반복 측정과 함께 일원 분산 분석을 사용하여 테스트되었습니다. 이러한 결과를 바탕으로 혼합 아미노산을 사용한 2회 연속 자극에 대한 요소 반응이 유사하다는 결론을 내릴 수 있으며, 이는 다른 용량 또는 테스트 화합물로 반복된 자극을 평가하는 데 중요한 대조 실험입니다.
ureagenesis 이외에, 위 의정서를 사용하여 간 glycogenlysis 및 lipolysis를 공부하는 것이 가능합니다. 그림 3C-F는 글루카곤 주입 중 별도의 실험 데이터를 보여줍니다. 글루코스(그림 3C) 및 비에스테르화 지방산(NEFA)(그림 3E)의 방출을 4분 주기로 측정하였다. 글루카곤 주입 중에 각각 포도당과 NEFA가 크게 증가하기 전에 포도당(그림 3C) 및 NEFA(그림 3E)의 꾸준한 기초 방출이 관찰됩니다. 기초 상태와 글루카곤 주입 중 평균값을 기반으로 글루카곤이 간 당분해(그림 3D) 및 지방 분해(그림 3F)를 빠르게 자극한다는 결론을 내릴 수 있습니다.
그림 4는 명백히 실패한 실험의 예를 보여줍니다. 요소의 기초 방출이 불안정하고 자극 주기가 서로 너무 가까워 다음 자극이 시작되기 전에 요소 생성이 기초 수준으로 돌아갑니다. 꾸준한 기초 기간이 없으면 하나의 요소 반응과 다음 요소 반응을 구별할 수 없습니다. 이러한 데이터로부터, 서로 다른 포도당 농도가 관류된 쥐 간에서 아미노산 유도 요소 형성에 영향을 미치는지 여부를 결론짓는 것은 불가능하다. 대신 실험 프로토콜은 각 자극 기간 전에 일정한 기준선에 도달하기 위해 두 번의 연속 자극 사이에 20-30분의 기준선 기간으로 설계되어야 합니다.
그림 3: 관류된 쥐 간의 고품질 데이터. (ᅡ,ᄂ) 요소 총량은 기초 조건 및 혼합 아미노산(10mM) 및 포도당(6mM)의 투여 기간에 대한 반응으로 표시됩니다. 데이터는 (A) 평균 ± SEM 및 (B) 각 자극 및 이전 기초 기간(각 점은 마우스를 나타냄) 동안의 평균값(n = 6)으로 표시됩니다. (씨, 디) 글루코스 및 (E,F) 비에스테르화 유리 지방산(NEFA) 총 출력은 글루카곤(10nM)의 투여에 대한 기초 조건 및 반응으로 표시됩니다. 데이터는 기초 및 자극 기간 동안의 (C,E) 평균 ± SEM 및 (D,F) 평균값(각 점은 마우스를 나타냄), n = 6으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 관류된 쥐 간의 저품질 데이터. 요소 총 생산량은 혼합 아미노산(10mM) 및 포도당 농도 감소(18mM, 12mM, 6mM, 3mM 및 0mM)에 대한 반응으로 기초 조건에서 표시됩니다. 데이터는 SEM± 평균, n = 3으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 95% O2 + 5% CO2로 가스를 주입하는 동안 Krebs-Henseleit 중탄산염 완충액의 산소 및 이산화탄소 및 pH의 시간 의존적 분압. (A) 95 % O 2 + 5 % CO2 로 가스 주입 시작 후 표시된 시점에서 관류 시스템을 통과 한 후 수집 된 Krebs-Henseleit 관류 완충액 (실험 전에 pH가 조정되지 않음) 샘플의 산소, (B) 이산화탄소 및 (C) pH의 분압. 관류 완충액 샘플은 혈액-가스 분석기로 측정하였다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 관류된 간 전체의 산소 및 이산화탄소 및 pH 분압의 변화. (A) 산소, (B) 이산화탄소 및 (C) pH의 분압은 간에 도달하기 직전과 1분 및 180분에 관류된 간을 실험에 통과시킨 후 수집된 Krebs-Henseleit 관류 완충액 샘플에서 수집되었습니다. 관류 샘플은 혈액 가스 분석기로 측정하였다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. **Holm-Sidak 방법을 사용하여 다중 검정에 대해 보정된 다중 쌍체 t-검정에 의해 P < 0.01, ****P < 0.0001. n =14입니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
분리된 관류된 쥐의 간은 간 대사의 역학 및 분자 메커니즘 연구를 위한 강력한 연구 도구입니다. 분 단위 샘플 수집의 가능성은 간에 대한 테스트 화합물의 직접적인 효과에 대한 자세한 평가를 제공합니다. in vivo 연구와 비교했을 때, 관류된 간을 사용하면 혈액에 의해 운반되는 간외 인자를 피하고 실험 조건을 완벽하게 제어하면서 격리된 방식으로 간 대사를 연구할 수 있습니다. 분리된 간세포를 사용하는 시험관 내 연구와 비교했을 때 간 관류의 장점은 간 구조, 극성, 구역 분할 및 혈관 무결성의 유지입니다. 간 관류의 또 다른 장점은 시료 크기가 커서(3.5mL/분) 동일한 시료에서 여러 결과를 측정할 수 있다는 것입니다. 관류된 간은, 그러나, 그런 기계장치가 일어나는 데 몇 시간이 걸릴지도 모르기 때문에, 전사 규칙에 의존하는 효력을 공부할 때 이상적이지 않습니다. 대사 연구 외에도 이 프로토콜은 간의 내분비 기능(호르몬 및 헤파토카인 분비)과 약물 및 생체 이물의 간 대사를 연구하기 위해 다른 연구 분야에 적용될 수 있습니다.
이 방법의 가장 중요한 단계는 문맥에 카테터를 삽입하는 것입니다. 카테터의 끝은 좌우 간문맥으로 들어가는 문맥의 분기점 바로 앞에 위치하는 것이 중요합니다(그림 2). 카테터의 끝을 너무 멀리 밀면 간의 일부만 제대로 관류됩니다. 문맥에서 너무 아래쪽에 위치하면 췌장-십이지장 가지를 통한 누출이 발생할 수 있습니다. 채취를 위한 두 번째 카테터의 배치는 이 단계에서 간이 이미 산소가 공급된 완충액으로 관류되어 있기 때문에 덜 긴급합니다. 수술이 성공적으로 수행되면 간은 일정한 압력과 관류 출력으로 최소 3시간 동안 호흡하고 반응합니다(보충 그림 2). 이 단계에서 관류 시스템에서 기포를 피하는 것이 성공적인 실험을 위한 가장 중요한 요소입니다. 버퍼에 산소가 지속적으로 공급되기 때문에 기포를 완전히 피하기는 어렵지만 기포는 관류 시스템의 버블 트랩에 갇혀야 합니다. 따라서 버블 트랩을 주시하고 비어있을 때 관류 완충액으로 다시 채우는 것이 중요합니다.
크렙스-헨셀레이트 완충액(Krebs-Henseleit buffer, KHB)은 간 관류에 가장 널리 사용되는 용액이다13. 기존 제형은 2.5mmol/L CaCl2를 함유하고 있지만 칼슘이 미토콘드리아 손상에 기여한다는 이전 연구에 근거하여 1.25mmol/L CaCl212에 불과한 완충액을 사용합니다. 완충액에 적혈구, 알부민 또는 포도당을 첨가할 필요가 없다11. 제안된 완충액은 또한 질량 분석법 기반 대사체학과 같은 고급 생화학 기술을 사용하여 분자 프로파일링을 가능하게 합니다. 최적의 투여량을 결정하고 생리학적 대 약리학적 효과를 평가하기 위해 다양한 농도의 시험 화합물을 테스트할 수 있습니다. 이 연구에서 수행된 실험에서 10mM AA는 식후 수준에 해당하는 높은 생리학적 범위에 있는 반면 10nM 글루카곤은 약리학적 용량에 해당합니다. 그림 4에서 볼 수 있듯이 각 반응의 역학과 분자 메커니즘을 비교할 수 있도록 두 개의 연속 자극 사이에 20-30분의 기준선을 포함하는 것이 중요합니다.
관류액 샘플의 혈액은 후속 분석(예: 요소 및 포도당 농도의 비색 측정)을 방해할 수 있으므로 피하는 것이 중요합니다. 평형 기간 ~15분 후에 수집된 샘플에 혈액이 나타나거나, 주입을 위해 3방향 밸브가 열리거나, 버블 트랩이 채워질 때 혈관 클램프가 올바르게 배치되지 않았을 수 있습니다.
경험에 비추어 볼 때, 성공적인 수술은 수집 카테터를 삽입한 후 몇 분 이내에 ~10mmHg의 안정적인 포털 압력과 3.5mL/min의 출력 유속을 초래합니다. 압력이 상당히 높거나 지속적으로 증가하는 경우, 또는 수집된 출력 유량이 3.5mL/min이 아니거나 지속적으로 떨어지는 경우 다음과 같은 몇 가지 이벤트를 고려해야 합니다: 1) 모든 간엽이 균등하게 관류되고 균일한 옅은 색을 나타내는가? 그렇지 않은 경우, 폐색이 발생했거나(종종 기포; 면봉으로 간엽을 조심스럽게 "마사지"합니다. 이것은 때때로 기포를 방출하여 압력이 즉시 떨어지는 데 도움이 됩니다), 문맥 카테터가 너무 위로 밀려서 간문맥의 두 가지 중 하나에만 공급됩니다(카테터를 몇 밀리미터 뒤로 조심스럽게 당기십시오). 2) 상대정맥이 꼬여 있습니까? 이것은 수집 튜브의 남성 부분을 정맥에 삽입된 카테터의 여성 부분에 부착할 때 발생할 수 있습니다. 수집 튜브를 조심스럽게 제거하고 압력이 떨어지는지 관찰하십시오. 3) 채취 카테터가 하대정맥 아래로 너무 멀리 밀려서 카테터 끝이 간에 끼어 있습니까? 필요한 경우 조심스럽게 몇 밀리미터를 집어넣습니다.
요약하면, 관류된 쥐의 간은 생리학적으로 관련된 시험관 내 실험 모델로, 간에 대한 주어진 화합물의 동적 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 작업의 품질은 얻은 데이터의 품질에 매우 중요하며, 경험상 만족스러운 품질의 데이터를 기대할 수 있으려면 ~2개월의 교육이 필요합니다. 일단 기술이 학습되면, 이 방법의 가능성은 간 질환의 마우스 모델뿐만 아니라 관심 유전자에 관한 형질전환 또는 녹아웃 기증자 동물의 사용을 포함하여 무수히 많습니다. 그러나 실험은 잠재적인 독성 부작용( 생체 내에서 훨씬 더 심각할 수 있음) 또는 시험 화합물의 용해도 불량으로 인해 제한될 수 있습니다. 이러한 화합물은 관류 전 적절한 시기에 기증 동물에게 경구 투여될 수 있다.
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Disclosures
저자는 이 기사와 관련된 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구와 Nicolai J. Wewer Albrechtsen은 Novo Nordisk Foundation Excellence Emerging Investigator Grant - Endocrinology and Metabolism(Application No. NNF19OC0055001), 유럽 당뇨병 연구 재단 미래 지도자상(NNF21SA0072746) 및 덴마크 독립 연구 기금, Sapere Aude(1052-00003B). 노보 노디스크 재단 단백질 연구 센터(Center for Protein Research)는 노보 노디스크 재단(Novo Nordisk Foundation)의 재정 지원을 받고 있습니다(보조금 계약 NNF14CC0001). 그림 1B는 biorender.com 로 작성되었습니다. 관류된 쥐의 간에 대한 유익한 토론을 해주신 Dr. Rune E. Kuhre(Novo Nordisk A/S)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-way stopcock | BD | 394601 | |
| Altromin breeding diet | Altromin Spezialfutter | 1319 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma | C8106 | |
| Catheters (0.7 mm) | BD | 381812 | |
| Filter paper (pore size 2.0 µm) | Millipore | AP2029325 | |
| Glucose kit | QuantiChromTM | DIGL-100 | Low concentration protocol |
| Ketamine | MSD Animal Health | 511485 | 90 mg/kg |
| Ligature (black sterile silk) | Agnthos | 14739 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | 230391 | |
| Non-esterified fatty acids kit | Fujifilm Wako Chemicals | NEFA-HR(2) | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate(KH2PO4) | Merck | 1.04877 | |
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Sleek tape | Mediq danmark | 4001910 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | |
| Thermostatic Circulator | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | Bath Volume 3 L, 230 V/50 Hz |
| Tubing | Tygon | E3603 | Inner diameter 1.59 mm, outer diameter 3.18 mm |
| Universal perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | Basic unit uniper UP-100, type 834 |
| Vamin | Fresenius Kabi | B05ABA01 | Mixed amino acids |
| Vessel clamp adaptor | Deutsche Biomedical | DBC1002 | |
| Vessel clamps | Deutsche Biomedical | DBC1005 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Xylazine | Rompun Vet | 530701 | 10 mg/kg |
References
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