Summary
Här presenterar vi en robust metod för in situ perfusion av muslever för att studera den akuta och direkta regleringen av levermetabolismen utan att störa leverarkitekturen men i frånvaro av extrahepatiska faktorer.
Abstract
Levern har många funktioner, bland annat näringsmetabolism. Till skillnad från andra in vitro - och in vivo-modeller för leverforskning möjliggör den isolerade perfunderade levern studier av leverbiologi och metabolism i hela levern med en intakt leverarkitektur, separerad från påverkan av extrahepatiska faktorer. Leverperfusioner utvecklades ursprungligen för råttor, men metoden har anpassats även till möss. Här beskriver vi ett protokoll för in situ-perfusion av muslevern. Levern perfunderas antegradivt genom portvenen med syresatt Krebs-Henseleit bikarbonatbuffert, och utflödet samlas upp från den suprahepatiska nedre hålvenen med fastspänning av den infrahepatiska nedre hålvenen för att sluta kretsloppet. Med hjälp av denna metod kan de direkta effekterna i levern av en testförening utvärderas med en detaljerad tidsupplösning. Leverfunktionen och livsdugligheten är stabila i minst 3 timmar, vilket gör det möjligt att inkludera interna kontroller i samma experiment. De experimentella möjligheterna med denna modell är många och kan ge insikt i leverfysiologi och leversjukdomar.
Introduction
Levern är ett viktigt organ i ämnesomsättningen. Det spelar en nyckelroll i kontrollen av hela kroppens energibalans genom att reglera glukos-, lipid- och aminosyrametabolismen. Ökningen av leversjukdomar världen över framstår som en stor global hälsobörda, och mer kunskap behövs om patofysiologin och dess konsekvenser för leverfunktioner.
Olika in vitro-modeller har utvecklats för forskning på levern för att komplettera in vivo-studier. Isolerade och odlade primära hepatocyter från gnagare och människor används i stor utsträckning. Icke-parenkymala celler kan separeras från hepatocyter med hjälp av differentiell och gradient -centrifugering, och samodling av olika celltyper är användbar för att studera intercellulär överhörning1. Även om primära humana hepatocyter anses vara den gyllene standarden för att testa läkemedelstoxicitet, har flera studier visat att hepatocyterna snabbt dedifferentieras i vävnadsodling vilket resulterar i förlust av leverfunktioner 2,3,4. Hepatocytodling i ett 3D-sfäroidsystem förbättrar dedifferentieringen, är mer stabil och verkar efterlikna levern in vivo i högre grad än de traditionella 2D-odlingssystemen5. Precisionsskurna leverskivor är en annan väletablerad in vitro-modell som håller vävnadsarkitekturen intakt och innehåller de icke-parenkymala cellerna som finns i levern6. Mer avancerade in vitro-modeller inkluderar lever-on-a-chip7 och leverorganoider8. Men med alla dessa tillvägagångssätt finns det en förlust av strukturell integritet och flödesdynamik, inklusive vektoriellt portal-hepatiskt venflöde, vilket sannolikt påverkar generaliserbarheten.
Den isolerade perfunderade råttlevern beskrevs första gången av Claude Bernard18559 och används fortfarande inom olika vetenskapliga områden för studier av leverbiologi, toxikologi och patofysiologi. Fördelarna med den perfunderade levern jämfört med de ovan nämnda in vitro-modellerna inkluderar upprätthållandet av leverarkitekturen, det vaskulära flödet, hepatocyternas polaritet och zonering samt interaktionerna mellan hepatocyter och icke-parenkymala celler. Jämfört med in vivo-studier gör den perfunderade levern det möjligt att studera levermetabolismen på ett isolerat sätt genom att undvika extrahepatiska faktorer som bärs av blodet och med fullständig kontroll över de experimentella förhållandena. Flera modifieringar har gjorts för att förbättra råttleverperfusionsmodellen under åren10,11,12,13. Även om möss har använts för isolerade perfunderade leverstudier finns mindre litteratur tillgänglig. Här presenterar vi en metod för in situ perfusion av muslevern genom kanylering av portvenen och den suprahepatiska vena cava inferior för att studera de akuta och direkta metabola svaren på metabola substrat och hormoner mätt i levervenöst levervatten från muslever i realtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök har utförts med tillstånd från Djurförsöksinspektionen, Danmarks miljö- och livsmedelsministerium (tillstånd 2018-15-0201-01397) och den lokala etiska kommittén i enlighet med EU-direktivet 2010/63/EU, National Institutes of Health (publikation nr 85-3) och enligt riktlinjerna i dansk lagstiftning om djurförsök (1987). Detta är ett terminalt ingrepp, och dödsorsaken är blodförgiftning och perforering av diafragman under djup anestesi.
1. Försöksdjur
- Skaffa möss av önskad stam, ålder och kön. I denna studie användes manliga C57BL/6JRj-möss i åldern 11-16 veckor. Inhys upp till 5 hanmöss eller 8 honmöss per bur med fri tillgång till mat och vatten och upprätthåll en 12 h/12 h ljus-mörkercykel med lamporna tända från 6 till 6 PM.
2. Preoperativa förberedelser
- Gör leverperfusionsbuffert.
- Krebs-Henseleit buffert. Blanda och lös upp 118 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgSO 4 och 1,2 mmol/L KH 2 PO4 i dH 2 O. Lös upp 1,25 mmol/L CaCl2i en separat bägare och tillsätt bufferten.
- Lös upp 25 mmol/L NaHCO3 och tillsätt långsamt till bufferten under omrörning. Förvara bufferten vid 4 grader. Bufferten är stabil i minst 1 månad.
OBS: Nederbörd kan uppstå om CaCl2 och NaHCO3 inte löses upp individuellt innan de tillsätts.
- Filtrera perfusionsbufferten genom ett 2 μm-filter och justera pH till 7,5 med HCl.
OBS: Detta steg bör utföras på försöksdagen, eftersom pH-värdet ökar med tiden, även när det förvaras i slutna kolvar. - Bered testföreningarna i en högre koncentration än den önskade slutliga koncentrationen (t.ex. 20 gånger koncentrationen vid infusion med en hastighet av 0,175 ml/min via en sidoarmspump) i filtrerad och pH-justerad Krebs-Henseleit perfusionsbuffert. Om det är relevant, späd testsubstans i Krebs-Henseleit perfusionsbuffert med 1 % BSA tillsatt som bärare (för att undvika vidhäftning till slangar och glas, vilket är viktigt för alla peptider), filtrerat genom ett filter av lämplig storlek.
3. Drift och perfusion
OBS: En illustration av perfusionsuppställningen som användes i denna studie finns i figur 1.
- Gasa perfusionsbufferten (95 % O 2, 5 % CO2 %) i minst 30 minuter för att tillföra tillräckligt med syre till levern och för att bibehålla rätt pH från början av operationen (bikarbonatbuffertsystemet kommer att nå ett pH på 7,4 vid kontinuerlig gasning, se kompletterande figur 1).
- Bedöva en mus genom att administrera ketamin (90 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) genom intraperitoneal injektion.
- Placera musen på rygg på ett uppvärmt operationsbord och bekräfta bristen på reflexer som svar på tånypningen. Spraya med 70% etanol för att förhindra att håret fastnar på saxen. Att fästa musen på den varma ytan hjälper till att öka stabiliteten för följande procedurer.
- Gör ett snitt med sax vid basen av buken och klipp uppåt till bröstkorgen på båda sidor för att exponera bukhålan. Flytta tarmarna åt höger med hjälp av en bomullspinne och exponera portvenen.
- Placera två ligaturer under portalvenen med hjälp av en böjd pincett och förbered en lös knut för varje ligatur.
- För in en 0,7 mm kateter i portvenen. När den är perforerad, ta bort nålen från katetern och för katetern genom venen tills kateterns spets är nära levern, som illustreras i figur 2. Blod strömmar in i katetern.
- Dra åt ligaturerna. Om katetern inte är fylld med blod, fyll den med perfusionsbuffert för att undvika att en luftbubbla förs in.
- Fäst perfusionsslangen och initiera perfusion av levern med Krebs-Henseleit bikarbonatbuffert vid 37 °C genom att starta rullpumpen med ett perfusionsflöde på 0,8 ml/min. Levern blir blek inom några sekunder.
- Klipp av bröstkorgen och diafragman med en sax. Vid denna tidpunkt avlivas djuret. Placera en ligatur under den suprahepatiska nedre hålvenen med hjälp av en pincett med fin spets. Placera en penna, rullad gasbinda eller annat engångsföremål under musens baksida för att göra venen mer tillgänglig.
- För in en kateter i den suprahepatiska nedre hålvenen via hjärtats högra förmak. När den är perforerad, ta bort nålen från katetern och för katetern genom venen tills kateterns spets är nära levern. Blod- och perfusionsbufferten tar slut omedelbart.
- Dra åt ligaturen och fäst ett rör för uppsamling av perfusionsavloppsvatten. Fäst alla rör med vattentät tejp (slät tejp eller liknande).
- Använd en adapter för kärlklämma för att placera en kärlklämma tvärs över den infrahepatiska vena cava omedelbart ovanför höger njurven för att förhindra inblandning (Figur 2).
- Öka perfusionsflödet till 3.5 ml/min och starta en timer. Starta tryckregistreringen. Lyckad perfusion resulterar vanligtvis i ett tryck på ~10 mm/Hg.
- Täck levern med ett sterilt draperi fuktat med saltlösning och tillsätt koksaltlösning under experimentet för att förhindra att den torkar.
- Samla upp perfusionsavloppsvattnet i 1 minut och mät volymen. Volymen bör vara cirka 3.5 ml/min. Inblandning av blod förväntas inte i detta skede, och hjärtat pumpar inte längre.
- Vänta på en jämviktsperiod på 30 minuter innan du påbörjar experimentet.
Figur 1: En illustration av perfusionsinställningen. (A)Operationsbordet är upphöjt på ett stativstativ och uppvärmt till 37 °C. Perfusionsbufferten gasas (95 % O 2, 5 % CO2 %), pumpas via en peristaltisk rullpump och värms upp i värmeväxlaren med en inbyggd bubbelfälla. Systemet består dessutom av en manometer och en spindelpump för justering av perfusionstrycket. Perfusionstrycket registreras kontinuerligt och visualiseras via en givare på en PC, ett tryckregistreringsprogram. (B) Den röda rutan fångar anslutningarna för trevägskranar. Den första trevägskranen är öppen för infusion av en testförening via en sprutpump och den andra är stängd. Den tredje är öppen för kontinuerliga tryckmätningar. Den fjärde kranen kan användas för att samla in indataprover, för t.ex. gasanalys över den perfunderade levern. Kopplingarna kan modifieras efter behov för specifika experiment som kräver fler eller färre infusionsslangar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Foton av musens bukhåla före och under leverperfusion. (A)Den gröna pricken visar platsen för spetsen på portalvenkatetern. Det är viktigt att kateterns spets är placerad strax under portalvenens förgreningspunkt i vänster och höger leverportven, men ovanför bukspottkörtelns tolvfingertarmsgren för att undvika läckage. Den gula pricken indikerar den korrekta placeringen av kärlklämman på den infrahepatiska nedre hålvenen mellan höger njurven och levern för att undvika återflöde av blod till den perfunderade levern. (B, C) En perfunderad muslever med de två katetrarna införda i portvenen (B) och suprahepatisk inferior vena cava (C) och kärlklämman på den infrahepatiska inferior vena cava (B). Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Experimentera
- Starta experimentet genom att samla in de första baslinjeproverna med hjälp av en fraktionsuppsamlare i slutet av jämviktsperioden. Samla in proverna med önskat tidsintervall och lägg dem omedelbart på is.
- Kontrollera bubbelfällan regelbundet och fyll på med perfusionsbuffert när den är nästan tom.
- Ta ett prov av bufferten genom en trevägskran omedelbart innan den går in i organet och från uppsamlingskatetern som förs in i nedre hålvenen (efter att den har perfunderats genom levern).
- Mät proverna med en blodgasanalysator för att bekräfta att organet är metaboliskt aktivt (indikeras av en ökning av partialtrycket av CO2 och en minskning av pH).
- Upprepa steg 4.3-4.4 i slutet av försöket för att bedöma genomförbarheten under hela försöket (kompletterande figur 2).
OBS: Minskningen av syrgaspartialtrycket ger inte ett tillförlitligt mått på andningen på grund av syreförluster från slangar, organ etc. - Efter 15 minuters perfusion vid baslinjen inleds den första stimuleringen med att ett testämne infunderas genom en trevägskran med önskad flödeshastighet med hjälp av en sprutpump (t.ex. 20 gånger koncentrationen av testämnet vid infusion med en hastighet av 0,175 ml/min via en sidoarmspump). Alternativt kan baslinjebufferten bytas ut mot en ny (syresatt och uppvärmd) buffert som innehåller testföreningen i den slutliga koncentrationen.
- Avbryt stimuleringen och samla baslinjeprover i 20-30 minuter innan du påbörjar den andra stimuleringen.
- I slutet av experimentet, infundera en lämplig positiv kontroll i 5-10 minuter.
- Efter experimentet avlägsnas den perfunderade levern och vägs den för att normalisera produktionen till levervikt. Snap-frys levern i flytande kväve för potentiell mätning av proteininnehåll för att normalisera produktionen till proteininnehåll.
5. Biokemiska mätningar
- Kvantifiera koncentrationen av molekylen av intresse med hjälp av analyser som är lämpliga för mätningar i perfusionsbuffert (interna eller kommersiellt tillgängliga kolorimetriska eller ELISA-analyser). Bufferten är kompatibel med de flesta omics-baserade tekniker som metabolomik och proteomik.
OBS: I denna studie mättes urea baserat på en kolorimetrisk analys som tidigare beskrivits14. Glukos och icke-förestrade fettsyror kvantifierades med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit.
6. Analys av data
- Presentera data i XY-grafer som visar sekretoriska utdata över tid.
OBS: Det är en av fördelarna med in vitro-perfusionssystemet att det är möjligt att uttrycka data som den faktiska effekten (koncentration × flödeshastighet, t.ex. μmol/min) i stället för den uppmätta koncentrationen i produktionen (mmol/L) som i in vivo-studier. Överväg att normalisera produktionen till levervikten när du jämför olika musmodeller eller till det totala proteininnehållet (mätt med BCA) när du jämför kontrollmöss med musmodeller med fetma eller leversjukdomar där en ökning av levervikten kan bero på ökad fetthalt. - Presentera sammanfattande data som enskilda punkter per djur som representerar medelvärdet eller den totala produktionen under baslinjen och under en stimuleringsperiod (vanligtvis 15-30 min) eller inkrementell produktion med hjälp av föregående baslinje för varje stimuleringsperiod beroende på studiedesignen.
- Analysera data med hjälp av parat t-test (två grupper) eller envägs ANOVA med upprepade stimuleringar (fler än två grupper) med ett lämpligt post-hoc-test för multipeltestning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En stadig baslinje krävs för att avgöra om en stimulans eller ett substrat leder till frisättning av molekylen av intresse. Figur 3A visar ett exempel på ett lyckat experiment. Produktionen av urea i den perfunderade levern mäts i 2 minuters intervaller och visas som medelvärde ± SEM. Baslinjeperioderna som föregår var och en av de två stimuleringsperioderna är stabila. Den genomsnittliga ureaproduktionen under de två stimuleringsperioderna och de föregående baslinjerna visas i figur 3B. Statistisk signifikans mellan perioderna testades med hjälp av envägs ANOVA med upprepade mätningar. Baserat på dessa resultat kan man dra slutsatsen att ureasvaret på två på varandra följande stimuleringar med blandade aminosyror är likartat, vilket är ett viktigt kontrollexperiment vid utvärdering av upprepade stimuleringar med olika doser eller testsubstanser.
Förutom ureagenes är det möjligt att studera leverglykogenolys och lipolys med hjälp av ovanstående protokoll. Figur 3C-F visar data från ett separat experiment under en infusion med glukagon. Frisättningen av glukos (Figur 3C) och de icke-förestrade fettsyrorna (NEFA) (Figur 3E) mättes i 4-minutersperioder. En stadig basal frisättning av glukos (Figur 3C) och NEFA (Figur 3E) observeras före en kraftig ökning av glukos respektive NEFA under glukagoninfusionen. Baserat på medelvärdena vid basaltillståndet och under glukagoninfusionen kan man dra slutsatsen att glukagon snabbt stimulerar leverglykogenolys (figur 3D) och lipolys (figur 3F).
Figur 4 visar ett exempel på till synes misslyckade experiment. Den basala frisättningen av urea är ostadig och stimuleringsperioderna är för nära varandra för att ureaproduktionen ska hinna återgå till basala nivåer innan nästa stimulering börjar. Utan stabila basalperioder är det inte möjligt att skilja ett ureasvar från ett annat. Från dessa data är det omöjligt att dra slutsatsen om olika glukoskoncentrationer påverkar aminosyrainducerad ureagenes i den perfunderade muslevern. Experimentella protokoll bör istället utformas med 20-30 minuters baslinjeperioder mellan två på varandra följande stimuleringar för att nå en stadig baslinje före varje stimuleringsperiod.
Figur 3: Data av god kvalitet från den perfunderade muslevern. (A,B) Totalt urea visas under basala förhållanden och som svar på perioder av administrering av blandade aminosyror (10 mM) och glukos (6 mM). Data presenteras som (A) medelvärde ± SEM och (B) medelvärden under varje stimulering och föregående basalperiod (varje punkt representerar en mus), n = 6. (C, D) Totalproduktionen av glukos och (E,F) icke-förestrade fria fettsyror (NEFA) visas under basala förhållanden och vid administrering av glukagon (10 nM). Data presenteras som (C,E) medelvärden ± SEM och (D,F) medelvärden under basal- och stimuleringsperioden (varje punkt representerar en mus), n = 6. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Data av dålig kvalitet från den perfunderade muslevern. Total produktion av urea visas under basala förhållanden som svar på blandade aminosyror (10 mM) och minskande koncentrationer av glukos (18 mM, 12 mM, 6 mM, 3 mM och 0 mM). Data presenteras som medelvärde ± SEM, n = 3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsfigur 1: Tidsberoende partialtryck av syre och koldioxid och pH i Krebs-Henseleit bikarbonatbuffert under gasning med 95 % O 2 + 5 % CO2 . A) Partialtryck av syre, B) koldioxid och C) pH i prover av Krebs-Henseleit perfusionsbuffert (pH som inte justerats före försöket) som samlats in efter att ha gått igenom perfusionssystemet vid angivna tidpunkter efter gasningens början med 95 %O2 + 5 % CO2 . Perfusionsbuffertprover mättes med en blodgasanalysator. Klicka här för att ladda ner figuren.
Tilläggsfigur 2: Förändringar i partialtrycket av syre och koldioxid och pH över den perfunderade levern. A) Partialtryck av syre, B) koldioxid och C) pH i prover av Krebs-Henseleit perfusionsbuffert som samlats in omedelbart innan de når levern och efter att ha passerat den perfunderade levern efter 1 minut och 180 minuter in i ett experiment. Perfusionsproverna mättes med en blodgasanalysator. Data visas som medelvärde ± SD. **P < 0,01, ****P < 0,0001 genom multipla parade t-tester korrigerade för multipla tester med Holm-Sidak-metoden. n = 14. Klicka här för att ladda ner figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den isolerade perfunderade muslevern är ett starkt forskningsverktyg för studier av dynamiken och de molekylära mekanismerna i levermetabolismen. Möjligheten att samla in prover minut för minut ger en detaljerad utvärdering av den direkta effekten av en testförening på levern. Jämfört med in vivo-studier gör den perfunderade levern det möjligt för oss att studera levermetabolismen på ett isolerat sätt och undvika extrahepatiska faktorer som bärs av blodet och med fullständig kontroll över de experimentella förhållandena. Fördelarna med leverperfusion jämfört med in vitro-studier med isolerade hepatocyter är upprätthållandet av leverarkitekturen, polariteten, zondelningen och vaskulär integritet. En annan fördel med leverperfusion är den stora provvolymen (3,5 ml/min), vilket gör det möjligt att mäta flera utfall i samma prov. Den perfunderade levern är dock inte idealisk när man studerar effekter som är beroende av transkriptionell reglering eftersom sådana mekanismer kan ta flera timmar att inträffa. Förutom metabolisk forskning kan protokollet tillämpas inom andra forskningsområden för att studera leverns endokrina funktioner (utsöndring av hormoner och hepatokiner) och levermetabolismen av läkemedel och xenobiotika.
Det mest kritiska steget för denna metod är placeringen av katetern i portvenen. Det är viktigt att kateterns spets är placerad omedelbart före portalvenens förgreningspunkt i vänster och höger leverportvener (figur 2). Om kateterns spets trycks för långt kommer endast en del av levern att perfunderas ordentligt. Om den placeras för långt ner i portvenen kan läckage genom bukspottkörtel-tolvfingertarmsgrenen uppstå. Placering av den andra katetern för uppsamling är mindre brådskande eftersom levern redan i detta steg är perfunderad med den syresatta bufferten. När operationen har utförts framgångsrikt kommer levern att andas och reagera i minst 3 timmar med ett konstant tryck och perfusionseffekt (tilläggsfigur 2). I detta skede är undvikandet av luftbubblor i perfusionssystemet den viktigaste faktorn för ett lyckat experiment. Luftbubblor är svåra att undvika helt eftersom bufferten kontinuerligt gasas med syre, men bubblorna bör fångas i perfusionssystemets bubbelfälla. Det är därför viktigt att hålla ett öga på bubbelfällan och fylla på den med perfusionsbuffert när den är nästan tom.
Krebs-Henseleit-buffert (KHB) är den mest använda lösningen för leverperfusioner13. Den klassiska formuleringen innehåller 2,5 mmol/L CaCl 2 men baserat på en tidigare studie som visar att kalcium bidrar till mitokondriell skada använder vi en buffert med endast 1,25 mmol/L CaCl212. Tillsats av erytrocyter, albumin eller glukos till bufferten behövs inte11. Den föreslagna bufferten möjliggör också molekylär profilering med hjälp av avancerade biokemiska tekniker såsom masspektrometribaserad metabolomik. Olika koncentrationer av en testsubstans kan testas för att bestämma den optimala dosen och för att utvärdera fysiologiska kontra farmakologiska effekter. I de experiment som utfördes i denna studie ligger 10 mM AA i det höga fysiologiska intervallet som motsvarar postprandiala nivåer, medan 10 nM glukagon motsvarar en farmakologisk dos. Som visas i figur 4 är det viktigt att inkludera 20-30 minuters baslinjeperiod mellan två på varandra följande stimuleringar för att kunna jämföra dynamiken och de molekylära mekanismerna för respektive svar.
Det är viktigt att undvika blod i perfusatproverna eftersom det kan störa de efterföljande analyserna, t.ex. kolorimetrisk bestämning av urea- och glukoskoncentrationer. Om blod dyker upp i de insamlade proverna efter ~15 minuter in i jämviktsperioden, när en 3-vägsventil öppnas för infusioner eller när bubbelfällan är fylld, är kärlklämman på den infrahepatiska vena cava sannolikt inte korrekt placerad.
Enligt vår erfarenhet resulterar en lyckad operation i ett stabilt porttryck på ~10 mmHg och ett utgående flöde på 3,5 ml/min inom några minuter efter att uppsamlingskatetern satts in. Om trycket är betydligt högre eller kontinuerligt ökar, eller om det uppsamlade utgående flödet inte är 3,5 ml/min eller kontinuerligt sjunker, bör flera händelser beaktas: 1) Är alla leverlober lika perfunderade och visar en enhetlig blek färg? Om inte, kan en ocklusion ha inträffat (ofta en luftbubbla; "massera" försiktigt leverloben med en bomullspinne; detta hjälper ibland till att frigöra luftbubblan varigenom trycket sjunker omedelbart), eller så har portvenskatetern tryckts för långt upp och försörjer därmed bara en av de två grenarna av leverns portalven (försök försiktigt att dra tillbaka katetern några millimeter). 2) Är den suprahepatiska nedre hålvenen vriden? Detta kan inträffa när den manliga delen av uppsamlingsröret fästs på den kvinnliga delen av katetern som förs in i venen; Ta försiktigt bort uppsamlingsröret och observera om trycket sjunker. 3) Är uppsamlingskatetern för långt ner i den suprahepatiska nedre hålvenen så att kateterns spets har kilats in i levern? Dra försiktigt tillbaka några millimeter om det behövs.
Sammanfattningsvis är den perfunderade muslevern en fysiologiskt relevant in vitro experimentell modell som kan användas för att studera de dynamiska effekterna av en given förening på levern. Kvaliteten på verksamheten är avgörande för kvaliteten på de data som erhålls, och enligt vår erfarenhet tar det ~2 månaders utbildning innan data av tillfredsställande kvalitet kan förväntas. När man väl har lärt sig tekniken är möjligheterna med denna metod många, inklusive användning av transgena eller knockout-donatordjur med avseende på de gener som är av intresse samt musmodeller av leversjukdomar. Försöken kan dock begränsas av potentiella toxiska biverkningar (som sannolikt är mycket allvarligare in vivo) eller dålig löslighet hos testföreningarna. Sådana föreningar kan ges oralt till donatordjuren vid en lämplig tidpunkt före perfusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter som är relevanta för denna artikel.
Acknowledgments
Studierna och Nicolai J. Wewer Albrechtsen stöddes av Novo Nordisk Foundation Excellence Emerging Investigator Grant - Endocrinology and Metabolism (Application No. NNF19OC0055001), European Foundation for the Study of Diabetes Future Leader Award (NNF21SA0072746) och den oberoende forskningsfonden i Danmark, Sapere Aude (1052-00003B). Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research stöds ekonomiskt av Novo Nordisk Foundation (Grant agreement NNF14CC0001). Figur 1B skapades med biorender.com. Vi tackar Dr. Rune E. Kuhre (Novo Nordisk A/S) för givande diskussioner om den perfunderade muslevern.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-way stopcock | BD | 394601 | |
| Altromin breeding diet | Altromin Spezialfutter | 1319 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma | C8106 | |
| Catheters (0.7 mm) | BD | 381812 | |
| Filter paper (pore size 2.0 µm) | Millipore | AP2029325 | |
| Glucose kit | QuantiChromTM | DIGL-100 | Low concentration protocol |
| Ketamine | MSD Animal Health | 511485 | 90 mg/kg |
| Ligature (black sterile silk) | Agnthos | 14739 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma | 230391 | |
| Non-esterified fatty acids kit | Fujifilm Wako Chemicals | NEFA-HR(2) | |
| Operating table, heated on tripod stand, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate(KH2PO4) | Merck | 1.04877 | |
| Roller Pump, with four channels | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Sleek tape | Mediq danmark | 4001910 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S1679 | |
| Thermostatic Circulator | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | Bath Volume 3 L, 230 V/50 Hz |
| Tubing | Tygon | E3603 | Inner diameter 1.59 mm, outer diameter 3.18 mm |
| Universal perfusion system | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | Basic unit uniper UP-100, type 834 |
| Vamin | Fresenius Kabi | B05ABA01 | Mixed amino acids |
| Vessel clamp adaptor | Deutsche Biomedical | DBC1002 | |
| Vessel clamps | Deutsche Biomedical | DBC1005 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Xylazine | Rompun Vet | 530701 | 10 mg/kg |
References
- Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response. Scientific Reports. 6, 25329 (2016).
- Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
- Seirup, M., et al. Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro. Genomics. 114 (3), 110330 (2022).
- Gupta, R., et al. Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq. Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137 (2021).
- Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX. Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
- Bartošek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. Isolated Liver Perfusion and its Applications. , Raven Press. New York. (1973).
- Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations. Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).
- Mischinger, H. J., et al. An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates. Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).
- Vairetti, M., et al. Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2. Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).
- Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).
- Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -G. Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium. Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).
