Praktische overwegingen voor het ontwerp, de uitvoering en de interpretatie van studies met tests voor het buigen van hele botten van knaagdierbotten

Summary

Mechanisch testen van knaagdierbotten is een waardevolle methode om informatie te verkrijgen over de gevoeligheid van een bot voor breuken. Bij gebrek aan een goed praktisch begrip kunnen de resultaten te veel worden geïnterpreteerd of niet valide zijn. Dit protocol dient als leidraad om ervoor te zorgen dat mechanische tests nauwkeurig worden uitgevoerd om geldige en functionele gegevens te verkrijgen.

Abstract

Skeletfragiliteit die tot breuken leidt, is een Amerikaanse volksgezondheidscrisis die resulteert in 1.5 miljoen fracturen per jaar en $ 18 miljard aan directe zorgkosten. Het vermogen om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan botziekte en de respons op de behandeling is niet alleen gewenst, maar ook van cruciaal belang. Mechanisch testen van bot dient als een waardevolle techniek om de vatbaarheid van een bot voor breuken te begrijpen en te kwantificeren. Hoewel deze methode eenvoudig uit te voeren lijkt, kunnen er ongepaste en onnauwkeurige conclusies worden getrokken als de gebruiker de heersende aannames en belangrijke stappen buiten beschouwing laat. Dit is waargenomen in alle disciplines, aangezien studies nog steeds worden gepubliceerd met misbruik van methoden en onjuiste interpretatie van resultaten. Dit protocol zal dienen als inleiding voor de principes die verband houden met mechanisch testen, samen met de toepassing van deze technieken - van overwegingen van monstergrootte via weefseloogst en -opslag tot gegevensanalyse en interpretatie. Met dit in de hand kan waardevolle informatie worden verkregen over de vatbaarheid van een bot voor breuken, wat het begrip voor zowel academisch onderzoek als klinische oplossingen bevordert.

Introduction

Mechanisch testen van bot is de primaire methode om functionele informatie te extraheren met betrekking tot de gevoeligheid van een bot voor breuken. In preklinische studies kunnen verschillende testmodaliteiten worden gebruikt, maar verreweg de meest voorkomende is het buigen van lange botten. Deze tests zijn eenvoudig uit te voeren en kunnen worden gebruikt op botten variërend in grootte van mens tot muis. Aangezien muizen een van de meest bestudeerde dieren zijn in preklinisch onderzoek, zal dit protocol zich richten op buigtests die worden uitgevoerd op de femora en tibiae van muizen.

Voorafgaand aan het uitvoeren van buigtests moeten botten op de juiste manier worden geoogst en opgeslagen. De meest gebruikelijke opslagmethoden zijn van oudsher het invriezen van botten in met zoutoplossing doordrenkt gaas, het invriezen in alleen zoutoplossing of het uitdrogen van botten in ethanol ¹. Van botten die in ethanol zijn opgeslagen, is aangetoond dat ze een verhoogde stijfheid en elasticiteitsmodulus hebben en lagere vervormingsparameters hebben dan botten die bevroren zijn opgeslagen¹. Zelfs het rehydrateren van de botten voorafgaand aan het testen herstelt deze eigenschappen niet terug naar normale niveaus ¹. Ondergedompeld in zoutoplossing kan schade aan het bot veroorzaken, omdat er druk wordt uitgeoefend als de zoutoplossing uitzet. Bovendien zou een volledige dooi van de oplossing nodig zijn om de botten te verwijderen voor microcomputertomografie (μCT) scanning. Bijgevolg is het invriezen van vers geoogste botten in met zoutoplossing gedrenkt gaas de standaard opslagmethode geworden en wordt dit in dit protocol aanbevolen.

Omdat de grootte en vorm van een bot van invloed zijn op de bulksterkte en veel ziektemodellen de botgrootte en morfologie aanzienlijk veranderen, worden technische principes gebruikt om de effecten van grootte weg te normaliseren om eigenschappen te produceren die het gedrag van het weefsel schatten^. Deze aanpak vereist een dwarsdoorsnedegeometrie van de faallocatie, die meestal wordt verkregen met behulp van μCT om scans van de botten te maken voorafgaand aan het testen. μCT wordt veel gebruikt vanwege de beschikbaarheid en hoge beeldresolutie. Bovendien zijn bijdragen van zacht weefsel niet inbegrepen en vereist scannen geen chemische fixatie of andere aanpassingen aan het bot ^3,4. Bij alle vormen van CT wordt een röntgenbron op een object gericht, terwijl een detector aan de andere kant van het object de resulterende röntgenenergie meet. Dit produceert een röntgenschaduw van het monster die kan worden omgezet in een beeld ^3,5. Het object dat wordt gescand, wordt geroteerd (of de röntgenbron en detector worden rond het monster gedraaid), waardoor beelden worden gegenereerd die kunnen worden gereconstrueerd tot een driedimensionale dataset die het object^{vertegenwoordigt 5}.

De scanresolutie, of hoe dicht twee objecten bij elkaar kunnen liggen en toch afzonderlijk kunnen worden opgelost, wordt bepaald door de nominale voxelgrootte of de grootte van een pixel in de resulterende afbeelding te wijzigen. Het is algemeen aanvaard dat objecten ten minste twee keer zo groot moeten zijn als een enkele voxel om te worden geïdentificeerd³, maar een hogere verhouding zorgt voor een betere precisie. Verder zijn grotere voxels vatbaarder voor gedeeltelijke volume-effecten: wanneer een enkele voxel weefsels met verschillende dichtheden bevat, krijgt deze het gemiddelde van deze dichtheden toegewezen, in plaats van de specifieke dichtheid van een enkel weefsel, wat kan leiden tot een over- of onderschatting van weefselgebieden en mineraaldichtheid³. Hoewel deze problemen kunnen worden verholpen door kleinere voxelgroottes te kiezen, zorgt het gebruik van een hogere resolutie niet voor de eliminatie van gedeeltelijke volume-effecten en kan het een langere scantijd vereisen³. Bij het ex vivo scannen van botten wordt over het algemeen een voxelgrootte van 6-10 μm aanbevolen om de trabeculaire architectuur van muizenbotten nauwkeurig te beoordelen. Een grotere voxelgrootte van 10-17 μm kan worden gebruikt voor corticaal bot, hoewel de kleinste redelijke voxelgrootte moet worden gebruikt. Dit protocol maakt gebruik van een voxelgrootte van 10 μm, die klein genoeg is om belangrijke trabeculaire eigenschappen te onderscheiden en gedeeltelijke volume-effecten te minimaliseren zonder lange scantijd.

Röntgenenergie en energiefilterinstellingen moeten ook zorgvuldig worden gekozen, omdat de hoge mineraaldichtheid en dikte van botweefsel het uitgezonden röntgenenergiespectrum aanzienlijk verzwakt en verandert. Over het algemeen wordt aangenomen dat, omdat het uitgezonden röntgenspectrum gelijk is aan het spectrum dat het object^{verlaat 6}, het gebruik van laagenergetische röntgenstralen op dichte objecten zoals bot kan leiden tot een artefact dat bekend staat als bundelverharding⁷. Een hogere spanning van 50-70 kVp wordt aanbevolen bij het scannen van botmonsters om de incidentie van deze artefacten te verminderen⁵. Bovendien zorgt het plaatsen van een aluminium of koperen energiefilter voor een meer geconcentreerde energiestraal, waardoor artefacten verder worden geminimaliseerd ^4,7. In dit protocol wordt een aluminium filter van 0,5 mm gebruikt.

Ten slotte bepalen de scanrotatiestap en de rotatielengte (bijv. 180°-360°) samen het aantal vastgelegde beelden, wat de hoeveelheid ruis in de uiteindelijke scan^{bepaalt 4}. Het gemiddelde van meerdere frames in elke stap kan ruis verminderen, maar kan de scantijd verlengen⁴. Dit protocol maakt gebruik van een rotatiestap van 0,7 graden en een framegemiddelde van 2.

Nog een laatste opmerking over het scannen: hydroxyapatietkalibratiefantomen moeten worden gescand met dezelfde scaninstellingen als de experimentele botten om de omzetting van verzwakkingscoëfficiënten in mineraaldichtheid in g/cm mogelijk te maken³⁵. Dit protocol maakt gebruik van fantomen van 0,25 g/cm3 en 0,75 g/^cm3 hydroxyapatiet, hoewel er verschillende fantomen beschikbaar zijn. Houd er rekening mee dat sommige scansystemen interne fantomen gebruiken als onderdeel van de dagelijkse systeemkalibratie.

Zodra het scannen is voltooid, worden de hoekprojecties gereconstrueerd tot dwarsdoorsnedebeelden van het object, meestal met behulp van de bijbehorende software van de fabrikant. Welk systeem ook wordt gebruikt, het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het hele bot in de reconstructie wordt vastgelegd en dat de drempelwaarde op de juiste manier wordt ingesteld om de herkenning van bot versus niet-bot mogelijk te maken. Na reconstructie is het van cruciaal belang om alle scans in drie dimensies te roteren, zodat de botten consistent worden georiënteerd en goed zijn uitgelijnd met de transversale as, opnieuw met behulp van de software van de fabrikant.

Na rotatie kunnen interessegebieden (ROI) voor analyse worden geselecteerd op basis van de vraag of corticale eigenschappen, trabeculaire eigenschappen of breukgeometrie voor mechanische normalisatie gewenst zijn. Voor het laatste moeten ROI's na het testen worden geselecteerd door de afstand van de fractuurplaats tot het ene uiteinde van het bot te meten en de voxelgrootte te gebruiken om de overeenkomstige plaklocatie in het scanbestand te bepalen. Het geselecteerde gebied moet ten minste 100 μm lang zijn, met het breukpunt ongeveer in het midden van de ROI, om een adequate schatting te geven⁴.

Als ROI's zijn geselecteerd, zijn er twee eigenschappen nodig voor mechanische normalisatie (om buigspanning en rek te berekenen): de maximale afstand van de neutrale buigas tot het oppervlak waar het falen wordt geïnitieerd (verondersteld het oppervlak te zijn dat onder spanning wordt belast, bepaald door de testopstelling), en het traagheidsmoment rond de neutrale as (ook afhankelijk van de testopstelling). Dit protocol beveelt het gebruik van een aangepaste code aan om deze waarden te bepalen. Neem voor toegang tot de code rechtstreeks contact op met de corresponderende auteur of bezoek de website van het lab op https://bbml.et.iupui.edu/ voor meer informatie.

Zodra de μCT-scan is voltooid, kan het mechanisch testen beginnen. Buigtests kunnen worden uitgevoerd in vierpunts- of driepuntsconfiguraties. Vierpuntsbuigtests hebben de voorkeur omdat ze de schuifspanning in het bot tussen de belastingspunten elimineren, waardoor in dit gebied pure buiging kan plaatsvinden³. Het bot zal dan breken als gevolg van spanning, waardoor een falen ontstaat dat meer representatief is voor de werkelijke buigeigenschappen van het bot³. Het bot moet echter zo worden belast dat het op beide laadpunten dezelfde belasting levert (dit kan worden vergemakkelijkt met een draaibare laadkop). Bij driepuntsbuigtests is er een grote verandering in schuifspanning waar het belastingspunt het bot raakt, waardoor het bot op dit punt breekt als gevolg van afschuiving, niet door spanning³. ASTM-normen bevelen aan dat materialen die worden gebogen, een lengte-breedteverhouding van 16:1 moeten hebben, wat betekent dat de lengte van de steunspanwijdte 16 keer groter moet zijn dan de breedte van het bot om de impact van afschuiving ^8,9 te minimaliseren. Dit is vaak onmogelijk te bereiken bij het testen van kleine knaagdierbotten, dus de spanwijdte wordt eenvoudig zo groot mogelijk gemaakt, maar met een zo klein mogelijke verandering in de vorm van de dwarsdoorsnede. Bovendien moet bij het uitvoeren van vierpuntsbuiging de verhouding tussen de lengtes van de onderste en bovenste overspanning ~3:1⁸ zijn, wat meestal kan worden bereikt in het scheenbeen, maar het is moeilijk in het kortere dijbeen. Bovendien maken de dunnere corticale wanden van dijbenen ze vatbaar voor vervorming van het ringtype, waardoor de vorm van de botdoorsnede tijdens de test verandert (dit kan worden geaccentueerd in vierpuntstests omdat er een grotere kracht nodig is om hetzelfde buigmoment te induceren in vergelijking met driepuntsbuiging). Daarom zal driepuntsbuiging worden gebruikt voor het dijbeen van muizen, terwijl vierpuntsbuiging zal worden gebruikt voor scheenbeenderen in dit protocol.

Ten slotte is het belangrijk om het onderzoek goed aan te sturen voor statistische analyse. Een algemene aanbeveling voor mechanisch testen is om een steekproefomvang van 10-12 botten per experimentele groep te hebben om verschillen te kunnen detecteren, aangezien sommige mechanische eigenschappen, met name parameters na de opbrengst, zeer variabel kunnen zijn. In sommige gevallen kan dit betekenen dat moet worden begonnen met een grotere steekproefomvang van dieren, gezien het verloop dat tijdens het onderzoek kan optreden. Analyse van de steekproefomvang met behulp van bestaande gegevens moet worden voltooid voordat een onderzoek wordt uitgevoerd.

Er zijn tal van beperkingen en aannames, maar buigtests kunnen vrij nauwkeurige resultaten opleveren, vooral wanneer relatieve verschillen tussen groepen van belang zijn. Deze eigenschappen, samen met de analyse van trabeculaire architectuur en corticale morfologie, kunnen een beter inzicht geven in ziektetoestanden en behandelingsregimes. Als we zorgvuldig omgaan met die aspecten van het experiment die we onder controle hebben (bijv. oogsten, opslaan, scannen en testen), kunnen we erop vertrouwen dat er nauwkeurige resultaten zijn gegenereerd.

Protocol

Alle procedures die in dit protocol worden beschreven en waarbij dieren betrokken waren, zijn voorafgaand aan de procedure goedgekeurd door de Indiana University School of Science Institutional Animal and Use Committee (IACUC). Dieren die in de procedure werden beschreven, werden geëuthanaseerd via CO₂-inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie als secundair euthanasiemiddel.

1. Oogsten, bewaren en ontdooien van botten

1. Oogst en opslag
   1. Plaats de muis met de buikzijde naar boven. Gebruik een scalpel (of een scheermesje of schaar) om een incisie te maken op de geschatte kruising van het dijbeen en het bekken aan één kant.
   2. Ga door met de eerste incisie dorsaal totdat het heupgewricht is gelokaliseerd; Zoek naar de heupkop die eruitziet als een kleine witte bol die aan het bekken is bevestigd.
   3. Oefen druk uit met de rand van een scalpel op de proximale rand van de heupkop totdat de heupkop uit de kom springt. Snijd extra weefsel weg om de achterpoot vrij te maken van de rest van het karkas.
   4. Met de achterpoot geïsoleerd, scheidt u het scheenbeen en het dijbeen door flexie bij het kniegewricht te induceren. Beweeg de scalpel in mediaal-laterale richting aan de voorkant van de knie om door aangrenzend weefsel te snijden, inclusief de ligamenten tussen de botten.
   5. Als dit de botten niet scheidt, verleng dan het kniegewricht om toegang te krijgen tot het achterste oppervlak. Zorg ervoor dat u het bot niet snijdt of het gewrichtskraakbeen schraapt.
   6. Zodra het dijbeen en het scheenbeen zijn gescheiden, verwijdert u de achtervoet van het scheenbeen door het gewricht te buigen en een mediaal-laterale zaagbeweging op het achterste oppervlak van het gewricht te gebruiken. Verleng indien nodig het gewricht om het voorste oppervlak bloot te leggen. Pas op dat u niet in het bot snijdt.
   7. Eenmaal geïsoleerd, reinigt u de botten van al het aanhangende zachte weefsel. Als u vierpuntsbuigtests op het scheenbeen uitvoert, verwijder dan ook het kuitbeen. Het kuitbeen is verbonden door ligamenten aan het proximale uiteinde, maar is vergroeid met het scheenbeen nabij het distale uiteinde van het bot. Gebruik een scherpe schaar in de buurt van het verbindingspunt om het kuitbeen te scheiden.
   8. Wikkel de geïsoleerde en gereinigde botten apart in in zoutoplossing gedrenkt gaas en bewaar ze bij -20 °C. Doe dit direct na de oogst.
   9. Herhaal de stappen 1.1.1 tot en met 1.1.8 voor de andere zijde van het karkas.
      OPMERKING: Als er weerstand is bij het scheiden van de botten in de stappen 1.1.4-1.1.6, is het het beste om de stappen te herhalen in plaats van te proberen de botten uit elkaar te trekken. Krachtige bewegingen kunnen leiden tot beschadiging of breuk van de botten.
2. Ontdooien
   OPMERKING: Het aantal vries-dooicycli dat een bot ondergaat, moet tot een minimum worden beperkt, aangezien overmatige vries-dooicycli de mechanische eigenschappen van bot nadelig kunnen beïnvloeden. Gedeeltelijk ontdooien voor μCT-scanning kan worden bereikt door het bot 5-10 minuten op kamertemperatuur te laten staan. Ontdooi het bot alleen volledig bij het uitvoeren van buigtests zoals hieronder beschreven.
   1. 's Nachts bij voorkeur dooi
      1. Verplaats de botten van -20 °C opslag naar 1-4°C in een koelcel of koelkast. Zorg ervoor dat de botten daar 8-12 uur blijven om volledig te ontdooien voordat u gaat testen.
   2. Snel ontdooien
      1. Stel de temperatuur van het bad in op ongeveer 37 °C. Eenmaal op deze temperatuur voeg je de botten toe aan het bad.
      2. Laat de botten ongeveer 1 uur in het bad liggen.

2. μCT-scannen

1. Wikkel de botten voorafgaand aan het scannen in parafilm om de hydratatie te behouden. Bewaar alle andere botten op ijs terwijl u wacht om gescand te worden.
2. Eenmaal gewikkeld in parafilm, plaatst u het bot in een houder om te communiceren met de scanner. Zorg ervoor dat alle gescande botten in dezelfde richting zijn uitgelijnd, aangezien consistente uitlijning de rotatie later in de analyse vereenvoudigt.
3. Pas de scaninstellingen aan op basis van de toepassing van de scan. De volgende algemene scaninstellingen worden aanbevolen voor muisbotten: resolutie/voxelgrootte: 10 μm; pixelgrootte: gemiddeld, 2000 x 1048; filter: 0,5 mm aluminium; rotatie stap: 0,7; Gemiddelde van het frame: 2.
   NOTITIE: Deze instellingen kunnen verschillen afhankelijk van het systeem dat wordt gebruikt om te scannen, en indien nodig moeten de handleiding van de fabrikant en de gebruiker worden geraadpleegd.
4. Zodra de röntgenbron is ingeschakeld, voert u een vlakveldcorrectie uit om artefacten te minimaliseren. Om dit te doen, moet u er eerst voor zorgen dat de kamer leeg is en het vlakke veld uitschakelen.
5. Meet de gemiddelde intensiteit van het veld en stel deze in op 60%. Zodra u op 60% staat, werkt u het platte veld bij en schakelt u het weer in.
6. Zorg ervoor dat de gemiddelde intensiteit nu (86-88%) is.
   OPMERKING: Dit proces kan variëren afhankelijk van het gebruikte μCT-systeem. Raadpleeg de gebruikershandleiding voordat u het proces probeert.
7. Zodra de vlakveldcorrectie met succes is uitgevoerd, plaatst u de houder in de kamer. Zorg ervoor dat de monsters gecentreerd en waterpas zijn voordat u het voetstuk in de kamer plaatst.
8. Zodra het voetstuk is vastgezet, sluit u de kamer, zorgt u ervoor dat het hele bot in de scan wordt vastgelegd (een verkenningsweergave kan nodig zijn) en start u de scan.
9. Bewaar de botten na het scannen opnieuw in een met zoutoplossing doordrenkt gaas bij -20 °C.

3. μCT-reconstructie

1. Selecteer een ROI die het hele bot vastlegt bij de reconstructie. Om dit te doen, bekijkt u de grootste dwarsdoorsnede van bot en bepaalt u de ROI op basis van deze doorsnede.
2. Stel de drempelwaarde van de software in om een juiste herkenning van bot mogelijk te maken in vergelijking met niet-bot. Gebruik hiervoor een histogram waarin een onderste beperking is ingesteld op 0 en de bovenste beperking is ingesteld aan het einde van de piekhistogramgegevens.
3. Pas aanvullende instellingen aan, waaronder vermindering van ringartefacten en verharding van de straal tot respectievelijk 5 en 20%. Controleer of de uitlijningscompensatie binnen het bereik van -7 tot 7 ligt. Deze waarden kunnen variëren afhankelijk van de software. Zorg ervoor dat ze zijn geverifieerd met de gebruikershandleiding en op de fabrikant gebaseerde instructies voordat u met de reconstructie begint.
   OPMERKING: Artefacten kunnen tijdens de reconstructie worden geminimaliseerd met behulp van correcties voor straalverharding, ringartefacten en compensatie voor verkeerde uitlijning. Compensatie voor verkeerde uitlijning kan fungeren als een indicator van de kwaliteit van de scan en als deze buiten een door de fabrikant gespecificeerd bereik valt, moet de scan worden herhaald. De reconstructie-instellingen zijn echter afhankelijk van de software en de gebruikershandleiding moet worden geraadpleegd.

4. μCT-rotatie

OPMERKING: Eenmaal gereconstrueerd, moeten scans worden geroteerd om een consistente oriëntatie over alle botten vast te stellen en om ervoor te zorgen dat dwarsdoorsneden van het resulterende bot normaal worden genomen ten opzichte van de lengteas met zo min mogelijk offsethoek. Dit moet worden gedaan met de software van de gebruiker naar keuze.

1. Rotatie van het dijbeen
   1. Draai het dijbeen zodat alle botten dezelfde lengterichting hebben. Oriënteer bijvoorbeeld alle botten met het proximale uiteinde van het bot aan de bovenkant van de scan.
   2. Draai het bot zodat de oriëntatie van de dwarsdoorsnede van alle botten hetzelfde is. Draai bijvoorbeeld de botten zodat de voorste kant altijd aan de rechterkant van scans zit.
   3. Zodra deze aanpassingen zijn gemaakt, zet u de scan recht om ervoor te zorgen dat de symmetrie rond de centrale as behouden blijft.
   4. Sla de geroteerde gegevensset op.
2. Tibia rotatie
   1. Herhaal stap 4.1.1-4.1.4 voor het scheenbeen.

5. Mechanische testprocedure

1. Voorbereiding
   1. Zorg ervoor dat voorafgaand aan mechanische tests een μCT-scan met een resolutie van 6-10 μm is verkregen en gereconstrueerd om te verifiëren dat voor elk monster een kwaliteitsscan is verkregen om de geometrie van de dwarsdoorsnede op de plaats van de breuk te berekenen (secties 2-3).
   2. Met verkregen en geverifieerde scans, ontdooit u alle botten voordat u gaat testen (sectie 1). Test alle botten van één experiment op dezelfde dag en randomiseer de volgorde van testen om gebruikersvooringenomenheid en systeemvariabiliteit tussen monsters en experimentele groepen te minimaliseren. Zorg ervoor dat de botten tijdens het testproces gehydrateerd blijven.
2. Opstelling van het apparaat
   1. Zoek een load cell met de juiste gevoeligheid en capaciteit voor het sample. Houd rekening met het verwachte storingsbereik voor het sample en kies een load cell met ongeveer 50% meer capaciteit en maximale gevoeligheid (bijv. een load cell van 10 lbf met een capaciteit van 45 N voor een muizenbot in het faalbereik van 0-25 N).
   2. Lokaliseer laad- en steunspaninrichtingen.
   3. Installeer de load cell en de bevestigingen zoals weergegeven in afbeelding 1, door de load cell op de bovenste of onderste steun van de tester te schroeven, de bovenste laadinrichting op de load cell en de onderste bevestiging op de onderste steun van de tester. Zorg voor een goede pasvorm.
      OPMERKING: De bevestiging van de load cell aan de bovenste bevestiging wordt over het algemeen aanbevolen bij het uitvoeren van buigtests om contact van vloeistof met de load cell te voorkomen, maar indien nodig kan de onderkant worden gebruikt.
   4. Zodra de load cell en de armaturen zijn geïnstalleerd, selecteert u een lengte van de steunspanwijdte en zorgt u ervoor dat deze constant blijft voor alle monsters die worden getest. Om een steunspanwijdte te kiezen, zoekt u eerst het kortste bot in de monsterset.
   5. Oriënteer het bot tussen de armaturen zoals weergegeven in afbeelding 2.
   6. Voor driepuntsbuiging van het dijbeen, volg figuur 2A. Zorg ervoor dat het voorste oppervlak van het bot zich tegen de steunspanwijdte bevindt en dat het spangebied zich binnen de diafyse van het monster bevindt. Vermijd het opnemen van de derde trochanter aan het proximale uiteinde en het overgangspunt waar het bot zich verwijdt in de metafyse en condylen aan het distale uiteinde.
   7. Zorg er bij vierpuntsbuiging voor dat de steun- en laadoverspanningen op één lijn liggen en met elkaar gecentreerd zijn. Volg figuur 2B om het bot in de armaturen te laden.
      1. Stel de lengte van de steun- en laadoverspanningen in op een verhouding^van 3:1 8 (bijv. 9 mm steunoverspanning en 3 mm laadoverspanning).
      2. Voor een scheenbeen belast u het mediale oppervlak van het bot tegen de steunspanwijdte met één steun op de overgang tussen scheenbeen en kuitbeen. De andere steun zal waarschijnlijk net na de scheenbeenkam worden geplaatst. Zorg ervoor dat de belastingsoverspanning, gecentreerd binnen de steunspanwijdte, vervolgens een uniform deel van het bot bevat.
   8. Meet de afstand van de steunspanwijdte bij het uitvoeren van driepuntsbuiging en zowel de belastings- als de steunspanwijdte bij het uitvoeren van 4-puntsbuiging en noteer deze afstanden. Zorg ervoor dat deze waarde wordt geregistreerd vanuit het midden van de laadpunten voor zowel de metingen van de laad- als de steunspanwijdte.
   9. Plaats het bot terug in zoutoplossing of rehydrateer met een bolus zoutoplossing.
      OPMERKING: Bij het selecteren van punten voor een belastingsoverspanning wordt aanbevolen om cirkelvormige punten te gebruiken (een straal van 0.75 mm is voldoende omdat deze de belasting verdeelt en tegelijkertijd contact maakt met het bot op de raaklijn van de cirkel). Hoewel de theorie een mesrand aanbeveelt om een puntbelasting weer te geven, zal dit het bot verpletteren op het punt van belastingstoepassing, wat leidt tot overschattingen van de rek en onderschatting van de modulus.
   10. Zorg ervoor dat alle onderdelen van het armatuur goed vastzitten en vrij van beweging zijn.
3. Installatie van de software
   1. Zorg ervoor dat de tester correct is aangesloten op de computer via de moduledoos, loadcelkanalen en eventuele andere vereisten volgens de systeemhandleiding.
   2. Maak in de software die aan de mechanische tester is gekoppeld een buigtestprofiel met een helling met een verplaatsingssnelheid die langzaam genoeg is om geen visco-elastische effecten te veroorzaken (0,025 mm/s wordt vaak gebruikt) om het bot te belasten tot bezwijken.
   3. Een minimale bemonsteringsfrequentie van 25 Hz wordt ook aanbevolen bij het maken van een testprofiel, hoewel een hogere bemonsteringsfrequentie de voorkeur heeft.
   4. Maak één map per studiegroep en sla elke toets op als een afzonderlijk bestand in die map.
4. Laden en testen van monsters
   1. Kies een goed ontdooid bot (zie stap 1.2). Meet en registreer de volledige lengte met schuifmaten.
   2. Laad het monster op de armaturen zoals weergegeven in afbeelding 2A als u een dijbeen test in driepuntsbuiging en figuur 2B als u een scheenbeen test in vierpuntsbuiging.
   3. Wijzig de bestandsnaam om het te testen monster weer te geven.
   4. Zet de lading op nul (niet de verplaatsing). Zet de verhuizer van het systeem aan; Zorg ervoor dat het niet in de belastings- of verplaatsingsregeling staat.
   5. Wees voorzichtig en breng een minimale voorspanning aan op het bot om de positie vast te zetten en te voorkomen dat het bot gaat rollen, maar zorg ervoor dat het het monster niet in gevaar brengt. Streef naar een voorspanning van ongeveer 0,25 N. Zorg ervoor dat de gewenste botoriëntatie wordt gehandhaafd voordat u verder gaat.
   6. Hydrateer het monster door het royaal te overgieten met zoutoplossing.
   7. Begin de buigtest door Start of Uitvoeren in de software te selecteren. KRITIEK: Houd het monster gedurende de hele test zorgvuldig in de gaten en noteer tests waar zich problemen hebben voorgedaan (bijv. rollen, uitglijden).
      OPMERKING: Deze problemen kunnen de gegevens in gevaar brengen en opmerkingen over deze tests zijn nuttig om te raadplegen tijdens de analyse.
   8. Let op het bot dat begint te breken (aan de trekzijde). De meeste tests gaan door totdat er een storing optreedt. Op dit punt wordt de test beëindigd via de geprogrammeerde limieten. Als er een storing optreedt maar de tester blijft verplaatsen, stop dan handmatig de test om schade aan de load cell te voorkomen.
   9. Zodra het testen is voltooid, meet u de lengte van het distale uiteinde tot het breekpunt met behulp van een schuifmaat en noteert u deze.
   10. Herhaal stap 5.4.1 – 5.4.9 voor elk monster.

Afbeelding 1: Opstelling van de mechanische tester. (A) Driepunts- en (B) vierpuntsbuigproeven. De load cell wordt in het geel weergegeven, de laadinrichtingen in blauw en de steuninrichtingen in groen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Oriëntatie van botten tussen armaturen . (A) Juiste oriëntatie van een dijbeen in driepuntsbuigende belastingsinrichtingen met (van boven naar beneden) aanzichten vanaf de mediale, voorste en achterste zijde van het dijbeen wanneer deze correct zijn gepositioneerd. De laadinrichtingen worden in oranje weergegeven en de steuninrichtingen worden in blauw weergegeven. De onderste overspanningen moeten worden aangepast om zoveel mogelijk van het meest rechte deel van de diafyse op te nemen, en de bovenste armatuur moet tussen die overspanningen worden gecentreerd. (B) Juiste oriëntatie van een scheenbeen voor vierpuntsbuiging met (van boven naar beneden) aanzichten vanaf de voorste, laterale en mediale zijden van het scheenbeen. Het bot moet zo worden belast dat het mediale oppervlak contact maakt met het onderste armatuur en het laterale oppervlak contact maakt met het bovenste armatuur. De overgang tussen scheenbeen en kuitbeen moet net buiten de laadspanwijdte worden geplaatst. De overspanningen moeten worden aangepast om zo goed mogelijk te voldoen aan een verhouding tussen belasting en steunspanning van 1:3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. ROI-selectie

1. Nadat de pauzelengtes zijn geregistreerd, laadt u de geroteerde afbeeldingen in de software van de gebruiker naar keuze. Zodra de geroteerde afbeeldingen zijn geladen, lokaliseert en registreert u de bovenste en onderste plakjes van het bot.
2. Bereken het verschil tussen de bovenste en onderste schijf. Vermenigvuldig deze waarde met de scanning-voxelgrootte om de totale lengte van het bot in micrometers te bepalen.
3. Om de locatie van de breuk in de CT-scan te lokaliseren, deelt u de geregistreerde pauzelengte (in micrometers) door de voxelgrootte om het aantal μCT-plakjes te verkrijgen vanaf het distale uiteinde van de scan tot het breekpunt.
4. Selecteer een ROI, gecentreerd op deze locatie. Stel eerst de totale gewenste lengte van de ROI in (minimaal 100 μm). Zoek het aantal plakjes dat deze lengte vertegenwoordigt door de lengte in micrometers te delen door de voxelgrootte om het totale aantal plakjes in de ROI te bepalen.
5. Om de ondergrens van de ROI te verkrijgen, deelt u het totale aantal ROI-segmenten door 2 en trekt u deze waarde af van de eerder berekende pauzelocatie in stap 6.4.
6. Tel de totale lengte van de ROI in segmenten op bij de eerder berekende waarde om de bovengrens van de ROI te verkrijgen.
7. Selecteer de juiste ROI, op basis van berekende grenzen, en sla deze op.

7. Normalisatie van kracht- en verplaatsingsgegevens

NOTITIE: De mechanische tester genereert alleen punten met x- en y-coördinaten (verplaatsing, kracht). Deze punten kunnen worden omgezet in spanning en rek met behulp van de Euler-Bernoulli-buigspannings- en rekvergelijkingen, maar deze vereisen geometrische eigenschappen die zijn verkregen uit μCT-scans. De kwantificering van deze eigenschappen kan worden uitgevoerd met de voorkeurssoftware van de gebruiker. We geven de voorkeur aan een aangepaste code, die volledige controle geeft over alle inputs, berekeningen en outputs. Zoals eerder vermeld, kunt u voor toegang tot de code rechtstreeks contact opnemen met de corresponderende auteur of de website van het lab bezoeken op https://bbml.et.iupui.edu/ voor meer informatie. De spannings- en rekvergelijkingen, evenals de noodzakelijke geometrische eigenschappen die uit μCT-scans moeten worden verkregen om deze te berekenen, worden hieronder besproken.

1. Normalisatievergelijkingen voor driepuntsbuiging
   1. De vergelijking die wordt gebruikt om de spanning bij driepuntsbuiging te berekenen, wordt hieronder weergegeven in vergelijking 1. In deze vergelijking staat "F" voor kracht en "L" voor de lengte van de steunspanwijdte. Krachtwaarden worden tijdens de test door de mechanische tester geregistreerd. Zorg ervoor dat de lengte van de steunspanwijdte wordt geregistreerd voordat u gaat testen. "c" en "I" zijn geometrische eigenschappen die worden berekend met behulp van μCT-scans (paragraaf 7.3).
      (1)
   2. De vergelijking voor het berekenen van de rek wordt hieronder weergegeven in vergelijking 2; "c" en "L" vertegenwoordigen dezelfde eigenschappen voor zowel spannings- als rekberekeningen. "D" staat voor de verplaatsingswaarden die tijdens de tests door de mechanische tester zijn geregistreerd.
      (2)
2. Normalisatievergelijkingen voor vierpuntsbuiging
   1. De vergelijking voor spanning in vierpuntsbuiging wordt hieronder weergegeven in vergelijking 3. "F" en "I" blijven dezelfde variabelen die in stap 7.1.1 zijn besproken. Bereken "a" op basis van de afmetingen van de ondersteuning en het belastingsbereik voorafgaand aan de test. Als de aanbevolen verhouding van 3:1 voor ondersteuning en laadspanwijdte voor vierpuntsbuiging wordt gevolgd, is "a" een derde van de lengte van de steunoverspanning.
      (3)
   2. De vergelijking voor rek in vierpuntsbuiging wordt hieronder weergegeven in vergelijking 4. "c" en "a" duiden op dezelfde eigenschappen voor zowel spannings- als rekberekeningen. "D" staat voor de verplaatsingswaarden die door de mechanische tester tijdens de tests zijn geregistreerd.
      (4)
3. Berekening van geometrische eigenschappen op basis van μCT-scans
   1. De variabele "c" staat voor de afstand van de neutrale as tot het oppervlak van het bot dat onder spanning stond. Bepaal daarom het zwaartepunt van elke dwarsdoorsnede in de μCT-scans, aangezien de neutrale as door het zwaartepunt gaat.
      1. Indien de in stap 5.2.6 beschreven testrichting van een dijbeen in driepuntsbuiging wordt gevolgd, meet dan "c" ten opzichte van het voorste oppervlak.
      2. Als u de in stap 5.2.7 beschreven testrichting van een scheenbeen volgt, meet dan "c" ten opzichte van het mediale oppervlak van het bot.
   2. De variabele "I" vertegenwoordigt het traagheidsmoment rond de as van buiging (de mediaal-laterale as voor een dijbeen; de voorste-achterste as voor een scheenbeen). Bereken deze waarde met behulp van vergelijking 5. In deze vergelijking is "dA" de oppervlakte van elke pixel die is vastgelegd in de μCT-scan, terwijl y de berekende afstand van elke pixel tot de neutrale as is.
      (5)

8. Mechanische testeigenschappen van belang

1. Alvorens mechanische eigenschappen te berekenen, genereert u een kracht-verplaatsingscurve en een spannings-rekcurve (ideale curven hieronder weergegeven in figuur 3, samen met significante eigenschappen).
   OPMERKING: Het testen van biologische monsters levert niet altijd curven op die lijken op deze geïdealiseerde voorbeelden, maar ze blijven een nuttige gids.
2. Bestudeer deze curven voorafgaand aan de analyse om fouten in het testen op te sporen, zoals het rollen of uitglijden van botten. Deze fouten veroorzaken meestal hobbels of vlakke gebieden in het initiële lineaire deel van de curve. Verwijder op dit punt overtollige gegevens, inclusief gegevens die mogelijk zijn verzameld voordat de tester in contact kwam met het bot of gegevens na een storing.
3. Zodra u verzekerd bent van een kwaliteitstest door de geplotte curves, begint u met de analyse van significante eigenschappen.
   1. Stijfheid en elasticiteitsmodulus
      1. Bereken de stijfheid alleen met behulp van het elastische gebied van de kracht-verplaatsingscurve. De helling van de curve in dit gebied is stijfheid.
      2. Bereken de elasticiteitsmodulus met behulp van de helling van alleen het elastische deel van de spannings-rekcurve.
   2. Vloeigrens
      OPMERKING: Er zijn twee vloeipunten, één op de kracht-verplaatsingscurve en één op de spannings-rekcurve. De (x,y) waarden voor dit punt van de kracht-verplaatsingscurve staan bekend als verplaatsing naar vloei en vloeikracht, terwijl die uit de spannings-rekcurve bekend staan als rek tot vloeigrens en vloeigrens. Deze punten vertegenwoordigen het einde van het elastische gebied van de curve en kunnen op de onderstaande manieren worden gevonden.
      1. Spannings-rekcurvemethode: Bereken een lijnafwijking van (0,0) met 0,2% rek (2,000 microrek) maar met dezelfde helling als de elasticiteitsmodulus. Zet deze lijn uit op de spannings-rek grafiek; De positie waar deze lijn de spannings-rekcurve snijdt, wordt gedefinieerd als het vloeipunt. Gebruik deze vloeigrens en rekcoördinaat om de analoge kracht- en verplaatsingswaarden te vinden; Deze waarden vertegenwoordigen de vloeikracht en de verplaatsing naar de opbrengstwaarden.
      2. Secansmethode: Bereken de stijfheid op basis van de kracht-verplaatsingscurve en verminder de stijfheid met een gekozen percentage (5-10%). Teken een lijn vanaf (0,0) met de helling van deze verminderde stijfheid en laat deze kruisen met de kracht-verplaatsingscurve. Het snijpunt heeft de coördinaten (verplaatsing om mee te geven, vloeikracht).
         OPMERKING: De secansmethode kan worden gebruikt om de vloeigrens te bepalen zonder spannings-rekgegevens.
   3. Ultieme kracht en ultieme stress
      1. Bereken de uiteindelijke kracht en de uiteindelijke spanning door de maximale waarde in de respectievelijke datasets te vinden.
   4. Verplaatsings- en rekeigenschappen
      1. Verplaatsing naar vloei en rek naar opbrengstwaarden die de verplaatsing of rek tot het vloeipunt vertegenwoordigen. Om ze te vinden, zoekt u de opbrengst zoals beschreven in stap 8.3.2.
      2. De totale verplaatsings- en totale rekwaarden vertegenwoordigen de totale verplaatsing of totale rek die een monster tijdens de test heeft ervaren en komen overeen met het faalpunt.
      3. Verplaatsing na opbrengst en spanning na opbrengst: Verplaatsing na opbrengst wordt vaak gerapporteerd en kan worden berekend door de verplaatsing af te trekken van de opbrengst van de totale verplaatsing. Bereken de rek na de opbrengst door de rek af te trekken van de totale rek, maar rapporteer dit met de nodige voorzichtigheid, aangezien de rek eerst wordt afgeleid in de veronderstelling dat het materiaal lineair elastisch is (voorrek). Dit maakt een maatregel na opbrengst ongeldig.
   5. Energetische eigenschappen
      1. Bereken energie als het gebied onder de kracht-verplaatsing of de spanning-rek curve.
      2. Het gebied onder de kracht-verplaatsingscurve staat bekend als werk. Het gebied dat wordt berekend onder het pre-yield gedeelte van de curve, of het elastische gebied, staat bekend als elastisch werk of energie. Het gebied dat onder de curve voorbij het vloeipunt of het plastische gebied wordt berekend, staat bekend als na-opbrengst of plastisch werk, of verloren energie.
      3. De berekende totale oppervlakte onder de spannings-rekcurve staat bekend als taaiheid of taaiheidsmodulus, terwijl de oppervlakte berekend onder de spannings-rekcurve tot aan het vloeipunt bekend staat als veerkracht. Taaiheid na de oogst wordt, net als de stam na de oogst, vaak niet gerapporteerd vanwege de aannames van de rekvergelijkingen waar deze eigenschap niet onder valt.

Figuur 3: Kracht-verplaatsing en spanning-rek curves. (A) Ideale kracht-verplaatsingscurve; (B) ideale spannings-rekcurve met de lijn die is afgeleid van de 0,2% offset-methode die wordt gebruikt voor de berekening van de vloeigrens in rood (merk op dat deze lijn dezelfde helling heeft als die van het elastische gedeelte van de curve). De belangrijkste eigenschappen die kunnen worden verkregen uit de kracht-verplaatsingscurve zijn onder meer vloeikracht, uiteindelijke kracht, verplaatsing tot opbrengst, totale verplaatsing en arbeid. Eigenschappen op weefselniveau die kunnen worden verkregen uit de stress-rekcurve zijn onder meer opbrengstspanning, ultieme spanning, rek tot opbrengst, totale rek, veerkracht en taaiheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Representative Results

Na voltooiing van CT-scans kunnen de meeste ontoereikende scans worden opgevangen in reconstructie. Vaak hebben slechte scans een hoge compensatie voor verkeerde uitlijning, wat een duidelijke indicatie is van een fout tijdens de scan. Er kunnen echter fouten optreden in andere stappen en deze kunnen ook leiden tot onnauwkeurige gegevens. Deze fouten kunnen vaak worden opgemerkt wanneer de individueel berekende architecturale eigenschappen worden onderzocht. Als waarden ver buiten het bereik van anderen in een groep vallen, moeten de scan, ROI en methode voor het berekenen van de eigenschappen opnieuw worden onderzocht.

Zodra de buigtests zijn voltooid, moeten de kracht-verplaatsingsplots van elke test worden onderzocht om slechte tests te identificeren die mogelijk uit de dataset moeten worden verwijderd. Een voorbeeld van een problematische test is weergegeven in figuur 4. De grafiek in figuur 4A toont de resultaten van een correct uitgevoerde buigtest. Er is een duidelijk lineair gebied zonder een toespoor met een lage helling, een vloeipunt, een ultiem punt (maximale kracht), een afname van de kracht naarmate de verplaatsing voorbij de maximale kracht reikt, en een faalpunt. De curve is vloeiend zonder abrupte veranderingen in de belasting tot nadat het eindpunt is bereikt. Bijgevolg kunnen eigenschappen uit deze test gemakkelijk worden geïdentificeerd en vertrouwd. De grafiek in figuur 4B toont het resultaat van een buigtest met meerdere betreffende kenmerken. De abrupte veranderingen in de belasting en het verschijnen van meerdere pieken in de plot zijn belangrijke indicatoren van problemen met deze test. Hoewel er bij een goede test kleine pieken kunnen optreden in de buurt van de ultieme kracht, suggereren de omvang en het aantal pieken in deze grafiek dat het bot tijdens de test kan zijn gerold. Of ze nu worden waargenomen en genoteerd tijdens de test of bij het onderzoeken van de tests voorafgaand aan de analyse, de monstergegevens moeten worden onderzocht tijdens de analyse na de test. Als de gegevens inderdaad gebrekkig zijn of ver buiten het bereik van andere monsters in de groep liggen, zou het ideaal zijn om deze test niet op te nemen in de uiteindelijke dataset. Dit is een van de redenen om het experiment op de juiste manier aan te drijven met priori vermogensberekeningen. Het is misschien mogelijk om alleen bepaalde eigenschappen van een steekproef te rapporteren (in dit geval kunnen preopbrengsteigenschappen acceptabel zijn), maar dit is niet ideaal en moet duidelijk worden uitgelegd wanneer het wordt gerapporteerd.

Figuur 4: Kracht-verplaatsingsgrafieken. (A) Ideale kracht-verplaatsingsgrafiek. (B) Krachtverplaatsingsgrafiek als gevolg van een slechte buigtest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Met alle kracht-verplaatsingsplotten onderzocht en waarden genormaliseerd naar stress-rek, kunnen de eigenschappen van belang op meerdere manieren worden geïdentificeerd en getoond. In figuur 5 zijn de resulterende kracht-verplaatsings- en spanning-rekgrafieken voor een hele studie weergegeven. Dit zijn schematische weergaven waarbij de kracht en verplaatsing op het beginpunt (0,0), de opbrengst, het eindpunt en het falen voor elk bot worden bepaald en vervolgens de kracht/spanning en verplaatsing/rek worden gemiddeld om een gemiddelde grafiek voor elke groep te verkrijgen. De grafieken worden niet gebruikt voor statistische analyse, maar ze kunnen worden gebruikt om te laten zien hoe het algehele gedrag varieert als gevolg van factoren zoals een behandeling of ziektetoestand. De grafieken in figuur 5 zijn afkomstig van een studie waarin controlemuizen werden vergeleken met muizen die werden geïnduceerd met een toestand van diabetes type 2 en chronische nierziekte (T2D-CKD). De rechter scheenbeenderen van deze dieren werden getest met behulp van vierpuntsbuiging en geanalyseerd om de eigenschappen te verkrijgen die in protocolsectie 8 worden besproken. Uit figuur 5 blijkt duidelijk dat de T2D-CKD-groep verminderde mechanische eigenschappen had, waaronder sterkte en stijfheid, zowel op structureel als op weefselniveau. Deze muizen lijken ook verminderde postyield-eigenschappen te hebben, een indicator van broosheid. Deze waarnemingspunten mogen niet worden gebruikt om definitieve conclusies te trekken uit een onderzoek. Ze fungeren eerder als een visuele weergave en moeten worden geverifieerd door een statistische analyse uit te voeren op alle eigenschappen die van belang zijn.

Figuur 5: Krachtverplaatsings- en stress-rekgrafieken voor een volledige studie . (A) Krachtverplaatsingsdiagram voor controledieren en dieren met diabetes type 2 en chronische nierziekte. Deze grafiek resulteerde in het middelen van de vloeikracht, verplaatsing naar opbrengst, ultieme kracht, ultieme verplaatsing, faalkracht en totale verplaatsing voor elke groep en het uitzetten van deze gemiddelden samen met de standaarddeviatie. (B) Stressbelasting voor controledieren en dieren met type 2D-CNZ. Deze grafiek was het resultaat van het gemiddelde van de opbrengstspanning, de spanning van de stam tot de opbrengst, de uiteindelijke spanning, de uiteindelijke rek, de faalspanning en de totale spanning en het uitzetten van de resulterende gemiddelden samen met de standaarddeviatie. Afkorting: T2D-CKD = type 2 diabetes- en chronische nierziekte-geïnduceerde dieren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De mechanische gegevens en de resultaten van een tweezijdige t-toets zijn weergegeven in tabel I. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. Een algemeen onderzoek suggereert gegevens binnen de juiste marges en met verwachte niveaus van variabiliteit. Merk op dat postyield-eigenschappen meestal de grootste variatie vertonen en daarom vaak de grootste steekproefomvang vereisen om betekenisvolle verschillen te detecteren. Zoals de schematische curven in figuur 5 suggereerden, zijn er significante dalingen in bijna alle structurele en weefselniveau mechanische eigenschappen. Uit deze gegevens kan worden geconcludeerd dat de geïnduceerde ziektetoestand leidde tot botten die zwakker, minder stijf en vatbaarder zijn voor breuken als gevolg van verlies van vervormbaarheid en verminderde taaiheid. Studies met meer genuanceerde vergelijkingen zijn misschien niet zo eenvoudig te interpreteren. Een voorbeeld hiervan kan zijn als significante verbeteringen worden waargenomen in mechanische eigenschappen op structureel niveau, maar niet in mechanische eigenschappen op weefselniveau. In dit geval worden de waargenomen effecten waarschijnlijk veroorzaakt door veranderingen in de architectuur van het bot (bijv. groter oppervlak, verhoogde corticale dikte) in plaats van verbeteringen in de botkwaliteit op weefselniveau. Het botoppervlak is bijvoorbeeld toegenomen als gevolg van de toename van geweven bot, maar de weefselkwaliteit is afgenomen omdat er nu een ongeorganiseerd geweven bot aanwezig is in plaats van een georganiseerd lamellair bot. Dit zou kunnen worden ondersteund door μCT-analyse waarin statistisch significante verbeteringen in de architectuur kunnen worden waargenomen. Daarentegen kunnen er significante verbeteringen zijn in mechanische eigenschappen op weefselniveau met minimale/geen verbeteringen in mechanische eigenschappen op structureel niveau. Deze hoge weefselkwaliteit zou de valkuilen van kleinere botten kunnen maskeren. De interpretatie van gegevens kan nog ingewikkelder worden als er veranderingen worden waargenomen in preyield-eigenschappen, maar niet in postyield-eigenschappen of vice versa. In het eerste geval kan een verandering in het vermogen van het bot om vervorming te weerstaan worden verbeterd, terwijl het vermogen om schade te verdragen dat niet is. In elk van deze gevallen is de mogelijkheid om te verwijzen naar architecturale eigenschappen uit μCT-analyse zeer nuttig en moet deze worden gebruikt (hoewel het beschrijven van die methode buiten het bestek van dit artikel valt). Vanwege de complexiteit van de interpretatie van deze eigenschappen, zorgt het presenteren van alle eigenschappen in tabel- of figuurvorm (niet alleen die eigenschappen die het gemakkelijkst te interpreteren zijn, zoals ultieme kracht, of die het verhaal vertellen dat men wil vertellen) voor een completere weergave van de mechanische effecten.

			Beheersen	T2D-CKD	P-waarde
Vloeigrens (N)			19,7 ± 2,9	15.2 ± 2.6	0.0032**
Ultieme kracht (N)			22,8 ± 3	17,6 ± 3,4	0.0031**
Verplaatsing naar opbrengst (μm)			205 ± 17	190 ± 21	0.1039
Verplaatsing na opbrengst (μm)			246 ± 235	60 ± 51	0.0435*
Totale verplaatsing (μm)			451 ± 230	249 ± 53	0.0278*
Stijfheid (N/mm)			110 ± 10	91 ± 13	0.0037**
Werk om te oogsten (mJ)			2,16 ± 0,45	1,54 ± 0,36	0.0055**
Werk na de opbrengst (mJ)			4.24 ± 3.01	1,04 ± 0,9	0.0109*
Totaal werk (mJ)			6.4 ± 2.88	2,58 ± 0,97	0.0025**
Opbrengst Stress (MPa)			180 ± 20	157 ± 25	0.0504
Ultieme stress (MPa)			209 ± 26	181 ± 27	0.0434*
Soort tot oogst (mɛ)			16.8 ± 2	16,4 ± 1,5	0.5771
Totale belasting (mɛ)			36,6 ± 17,2	21,5 ± 4,3	0.0277*
Modulus (GPa)			12.2 ± 1.1	10.9 ± 1.1	0.0171*
Veerkracht (MPa)			1,62 ± 0,33	1,38 ± 0,33	0.1377
Taaiheid (MPa)			4,85 ± 2,29	2,26 ± 0,73	0.0076**

Tabel 1: Resultaten van mechanische tests en statistische analyses. Waarden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. P-waarden zijn het resultaat van een tweezijdige ongepaarde t-toets. * P < 0,05 en ** P < 0,01. Afkorting: T2D-CKD = type 2 diabetes- en chronische nierziekte-geïnduceerde dieren.

Discussion

Tijdens het scan- en testproces zijn er momenten waarop probleemoplossing en optimalisatie op hun plaats zijn. De eerste hiervan doet zich voor bij het scannen van botten met behulp van μCT. Hoewel veel systemen worden geleverd met een houder waarin één object kan worden vastgehouden en gescand, kunnen op maat gemaakte houders worden gemaakt om meerdere botten tegelijkertijd te scannen. Het scannen van meerdere botten kan een uitstekend punt voor optimalisatie zijn, maar voorzichtigheid is geboden tijdens het scan- en analyseproces om ervoor te zorgen dat er geen artefacten worden geïnduceerd. Aangezien röntgenstralen bij elke hoektoename door (en verzwakt worden) door verschillende hoeveelheden botweefsel, kan dit leiden tot onnauwkeurigheid in de resulterende gegevens.

Een tweede punt voor het oplossen van problemen doet zich voor bij de reconstructie van scans. Afhankelijk van het gebruikte programma kan de gebruiker het dichtheidsvenster voor reconstructie definiëren, berekend op basis van de dempingscoëfficiëntwaarden van de scan. Dit is een lineaire coëfficiënt die wordt gebruikt om aan te geven hoeveel de röntgenstraal wordt verzwakt door een object⁵. Sommige programma's verkrijgen deze dichtheden en zetten ze om in grijswaardenwaarden van 0 tot 255 in een histogram. Twee waarden worden weergegeven in een histogram en staan bekend als contrastlimieten¹⁰, die op de juiste manier moeten worden ingesteld om herkenning van bot- versus niet-botvoxels mogelijk te maken. De lagere waarde wordt normaal gesproken ingesteld op een grijsschaalwaarde van nul, terwijl de hogere contrastwaarde wordt aanbevolen in te stellen op 10-20% van de maximale demping van het materiaal van belang (bot)¹⁰. Er kunnen fouten optreden in de analyse als deze waarde niet op de juiste manier is ingesteld, omdat delen van de gegevens kunnen worden afgesneden. Daarom moet deze waarde worden aangepast afhankelijk van het monster dat is gescand. De beste praktijk is om het histogram op een logaritmische schaal te bekijken en de bovengrens te selecteren als een getal dat iets groter is dan het uiteinde van de logaritmische staart om ervoor te zorgen dat alle botgegevens worden opgenomen¹⁰.

Extra punten voor het oplossen van problemen doen zich voor tijdens mechanische tests en analyses. Tijdens het testen en het bekijken van kracht-verplaatsingscurven na de test, kunnen gerolde monsters worden opgemerkt en moeten ze uit de dataset worden verwijderd, zoals besproken in de representatieve resultaten. Bovendien moet voorzichtigheid worden betracht met betrekking tot de oriëntatie van het bot, aangezien er aannames zijn die de vorm van het geteste bot bepalen. Bij het gebruik van Euler-Bernoulli-buigvergelijkingen om spanning en rek te berekenen, wordt aangenomen dat het monster een uniforme doorsnede heeft over de lengte³. Aangezien de meeste botten geen uniforme doorsnede hebben, is het het beste om het meest uniforme deel van het bot te selecteren om te testen (over de gehele steunspanwijdte voor driepuntsbuiging of tussen de belastingspunten voor vierpuntsbuiging).

Bij een dijbeen heeft testen in driepuntsbuiging bij de middenschacht de voorkeur. Vanwege de zachte kromming van het bot, moet men in de richting van de kromming testen om lokale knik van het oppervlak te voorkomen (d.w.z. het dijbeen testen met het voorste oppervlak onder spanning). Het scheenbeen heeft een meer variabele dwarsdoorsnedevorm, dus het ideale gebied om te testen begint net proximaal van de kruising van het scheenbeen en het kuitbeen. Als het bot wordt geplaatst met het mediale oppervlak onder spanning, is het te testen botgebied vlak en heeft het de minste variabiliteit in straal en traagheidsmoment in de buigrichting. Voorzichtigheid is ook geboden bij het interpreteren van de resultaten van de buigtests vanwege de veronderstelling dat het materiaal isotroop, homogeen en lineair elastisch is - elk van deze veronderstellingen wordt tot op zekere hoogte geschonden bij het testen van bot³. Het onvermogen van Bone om aan deze veronderstellingen te voldoen, leidt tot resultaten van buigtests die met de nodige voorzichtigheid moeten worden geïnterpreteerd. De eigenschappen die het meest zorgvuldig moeten worden geïnterpreteerd, zijn die welke zijn afgeleid van de spannings-rekcurve voorbij het vloeipunt, aangezien het passeren van de vloei per definitie in strijd is met de lineair-elastische aanname. Hoewel normalisatie van de vorm van het bot kan worden gedaan, wordt het niet aanbevolen om te proberen te normaliseren naar het lichaamsgewicht van het dier, tenzij er grove verschillen zijn tussen groepen. In dit geval kan een analyse van de covariantie worden uitgevoerd om deze verschillen te compenseren, maar algemene normalisatie van het lichaamsgewicht moet in de meeste gevallen worden vermeden.

Ondanks de problemen bij het oplossen van problemen die zich tijdens dit proces kunnen voordoen, leveren buigtests mechanische eigenschappen op die de gevoeligheid van een bot voor breuken kunnen beschrijven. Deze tests zijn ook relatief eenvoudig en snel uit te voeren. Hoewel absolute waarden van deze tests niet altijd volledig geldig zijn, kan het kunnen detecteren van relatieve verschillen tussen groepen vrij nauwkeurig zijn voor monsters van verschillende groottes en vormen. De verkregen mechanische eigenschappen bieden functionele relevantie in studies waar verschillen in bot kunnen worden verwacht. Hoewel monotone faaltests de meest voorkomende en gemakkelijk toegankelijke mechanische test zijn, kunnen andere methoden, waaronder vermoeiingslevensduur en breuktaaiheid, aanvullende mechanische eigenschappen aan het licht brengen die van belang zijn en kunnen worden overwogen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAn	Bruker	NA	CT Scan Analysis Software
DataViewer	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Coding platform used for data analysis
NRecon	Bruker	NA	CT Scan Reconstruction software
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software	Micro Photonics Inc	SKY-016814	Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object