Praktiske hensyn for design, utførelse og tolkning av studier som involverer hele beinbøyetester av gnagerbein

Summary

Mekanisk testing av gnagerbein er en verdifull metode for å trekke ut informasjon om et beins følsomhet for brudd. Mangler riktig praktisk forståelse, kan resultatene bli overtolket eller mangle validitet. Denne protokollen vil fungere som en veiledning for å sikre at mekaniske tester utføres nøyaktig for å gi gyldige og funksjonelle data.

Abstract

Skjelettsårbarhet som fører til brudd er en amerikansk folkehelsekrise som resulterer i 1.5 millioner brudd hvert år og 18 milliarder dollar i direkte omsorgskostnader. Evnen til å forstå mekanismene som ligger til grunn for bein sykdom og respons på behandling er ikke bare ønsket, men kritisk. Mekanisk testing av bein tjener som en verdifull teknikk for å forstå og kvantifisere et beins følsomhet for brudd. Selv om denne metoden virker enkel å utføre, kan upassende og unøyaktige konklusjoner nås hvis styrende forutsetninger og viktige trinn blir ignorert av brukeren. Dette har blitt observert på tvers av disipliner ettersom studier fortsetter å bli publisert med misbruk av metoder og feil tolkning av resultater. Denne protokollen vil tjene som en primer for prinsippene knyttet til mekanisk testing sammen med anvendelsen av disse teknikkene - fra hensyn til prøvestørrelse gjennom vevshøsting og lagring, til dataanalyse og tolkning. Med dette i hånden kan verdifull informasjon om et beins følsomhet for brudd oppnås, noe som fremmer forståelse for både akademisk forskning og kliniske løsninger.

Introduction

Mekanisk testing av bein er den primære metoden for å trekke ut funksjonell informasjon relatert til et beins følsomhet for brudd. I prekliniske studier kan flere testmodaliteter brukes, men langt den vanligste er bøyning av lange bein. Disse testene er enkle å utføre og kan brukes på bein som varierer i størrelse fra menneske til mus. Siden mus er et av de mest studerte dyrene i preklinisk forskning, vil denne protokollen fokusere på bøyetester utført på femora og tibiae hos mus.

Før du utfører bøyetester, må bein høstes og lagres riktig. De vanligste lagringsmetodene har tradisjonelt vært frysing av bein i saltvannsdynket gasbind, frysing i saltvann alene eller dehydrering av bein i etanol ¹. Ben lagret i etanol har vist seg å ha økt stivhet og elastisk modul og reduserte deformasjonsparametere sammenlignet med de som er lagret frosset¹. Selv rehydrering av beinene før testing gjenoppretter ikke disse egenskapene tilbake til normale nivåer ¹. Lagring nedsenket i saltvann kan forårsake skade på beinet siden trykket utøves når saltvannet ekspanderer. I tillegg vil en fullstendig tining av løsningen være nødvendig for å fjerne beinene for mikrocomputertomografi (μCT) skanning. Følgelig har frysing av nyhøstede bein i saltvann-gjennomvåt gasbind blitt standard lagringsmetode og anbefales gjennom hele denne protokollen.

Fordi størrelsen og formen på et bein påvirker bulkstyrken og mange sykdomsmodeller endrer beinstørrelse og morfologi betydelig, brukes ingeniørprinsipper til å normalisere effekten av størrelse for å produsere egenskaper som estimerer vevets oppførsel². Denne tilnærmingen krever tverrsnittsgeometri av feilstedet, som oftest anskaffes ved hjelp av μCT for å lage skanninger av beinene før testing. μCT er mye brukt på grunn av tilgjengeligheten og den høye bildeoppløsningen. Videre er bidrag av bløtvev ikke inkludert, og skanning krever ikke kjemisk fiksering eller andre modifikasjoner på beinet ^3,4. I alle former for CT er en røntgenkilde fokusert på et objekt mens en detektor på den andre siden av objektet måler den resulterende røntgenenergien. Dette gir en røntgenskygge av prøven som kan konverteres til et bilde ^3,5. Objektet som skannes, roteres (eller røntgenkilden og detektoren roteres rundt prøven), og genererer bilder som kan rekonstrueres til et tredimensjonalt datasett som representerer objektet⁵.

Skanneoppløsning, eller hvor tett sammen to objekter kan være og fortsatt løses individuelt, styres ved å endre den nominelle voxelstørrelsen eller størrelsen på en piksel i det resulterende bildet. Det er generelt akseptert at objekter må være minst to ganger størrelsen på en enkelt voxel for å bli identifisert³, men et høyere forhold vil tillate forbedret presisjon. Videre er større voxels mer utsatt for partielle volumeffekter: når en enkelt voxel inneholder vev med varierende tettheter, tildeles den gjennomsnittet av disse tetthetene, i stedet for den spesifikke tettheten av et enkelt vev, noe som kan føre til over- eller underestimering av vevsområder og mineraltetthet³. Selv om disse problemene kan reduseres ved å velge mindre voxelstørrelser, sikrer ikke bruk av en høyere oppløsning eliminering av delvise volumeffekter og kan kreve lengre skannetider³. Ved skanning av bein ex vivo, anbefales en voxelstørrelse på 6-10 μm generelt for å nøyaktig vurdere den trabekulære arkitekturen til museben. En større voxelstørrelse på 10-17 μm kan brukes til kortikal bein, selv om den minste rimelige voxelstørrelsen bør brukes. Denne protokollen bruker en 10 μm voxelstørrelse, som er liten nok til å skille viktige trabekulære egenskaper og minimere delvise volumeffekter uten omfattende skannetid.

Røntgenenergi- og energifilterinnstillinger må også velges nøye, da den høye mineraltettheten og tykkelsen av beinvev i stor grad demper og endrer det overførte røntgenenergispekteret. Det antas generelt at fordi det utstrålede røntgenspekteret er ekvivalent med spekteret som går ut av objektet⁶, kan bruk av røntgenstråler med lav energi på tette gjenstander som bein føre til en artefakt kjent som stråleherding⁷. En høyere spenning på 50-70 kVp anbefales ved skanning av beinprøver for å redusere forekomsten av disse artefaktene⁵. I tillegg skaper innsetting av et energifilter av aluminium eller kobber en mer konsentrert energistråle, noe som ytterligere minimerer artefakter ^4,7. Et 0,5 mm aluminiumsfilter vil bli brukt i hele denne protokollen.

Til slutt kontrollerer skannerotasjonstrinnet og rotasjonslengden (f.eks. 180°-360°) sammen antall bilder som tas, noe som bestemmer mengden støy i den endelige skanningen⁴. Gjennomsnitt av flere bilder i hvert trinn kan redusere støy, men kan øke skannetiden⁴. Denne protokollen bruker et rotasjonstrinn på 0,7 grader og et rammegjennomsnitt på 2.

En siste merknad om skanning: hydroksyapatitt kalibreringsfantomer bør skannes med de samme skanneinnstillingene som eksperimentelle bein for å muliggjøre konvertering av dempingskoeffisienter til mineraltetthet i g / cm³⁵. Denne protokollen bruker fantomer på 0,25 g / cm3 og 0,75 g /^cm3 hydroksyapatitt, selv om forskjellige fantomer er tilgjengelige. Vær oppmerksom på at noen skannesystemer bruker interne fantomer som en del av den daglige systemkalibreringen.

Når skanningen er fullført, blir vinkelprojeksjonene rekonstruert til tverrsnittsbilder av objektet, vanligvis ved hjelp av produsentens medfølgende programvare. Uansett hvilket system som brukes, er det viktig å sikre at hele beinet er fanget i rekonstruksjonen, og at terskel er satt riktig for å tillate anerkjennelse av bein versus ikke-bein. Etter rekonstruksjon er det viktig å rotere alle skanninger i tre dimensjoner slik at bein er orientert konsekvent og riktig justert med tverraksen, igjen ved hjelp av produsentens programvare.

Etter rotasjon kan interesseregioner (ROI) for analyse velges basert på om kortikale egenskaper, trabekulære egenskaper eller bruddgeometri for mekanisk normalisering er ønsket. For sistnevnte bør ROI velges etter testing ved å måle avstanden fra bruddstedet til den ene enden av beinet og bruke voxelstørrelse for å bestemme den tilsvarende stykkeplasseringen i skannefilen. Den valgte regionen bør være minst 100 μm lang, med bruddpunktet i det omtrentlige sentrum av avkastningen, for å gi tilstrekkelig estimering⁴.

Når ROI er valgt, er det nødvendig med to egenskaper for mekanisk normalisering (for å beregne bøyespenning og belastning): den maksimale avstanden fra den nøytrale bøyeaksen til overflaten der svikt initieres (antas å være overflaten lastet i spenning, bestemt av testoppsettet), og treghetsmomentet rundt den nøytrale aksen, (også avhengig av testoppsett). Denne protokollen anbefaler bruk av en egendefinert kode for å bestemme disse verdiene. For tilgang til koden, kontakt den korresponderende forfatteren direkte eller besøk laboratoriets nettside på https://bbml.et.iupui.edu/ for mer informasjon.

Når μCT-skanningen er fullført, kan mekanisk testing begynne. Bøyetester kan utføres i enten firepunkts eller trepunktskonfigurasjoner. Firepunkts bøyetester foretrekkes, da de eliminerer skjærspenning i beinet mellom lastepunktene, noe som muliggjør ren bøying i dette området³. Benet vil da sprekke på grunn av spenning, noe som skaper en feil som er mer representativ for de sanne bøyeegenskapene til beinet³. Benet må imidlertid belastes på en slik måte at det leverer samme belastning på begge lastepunktene (dette kan forenkles med et svingbart lastehode). I trepunkts bøyetester er det en stor endring i skjærspenning der belastningspunktet møter beinet, noe som fører til at beinet brekker på dette punktet på grunn av skjær, ikke spenning³. ASTM-standarder anbefaler at materialer som bøyes bør ha et lengde-til-bredde-forhold på 16: 1, noe som betyr at lengden på støttespennet skal være 16 ganger større enn bredden på beinet for å minimere påvirkning av skjær ^8,9. Dette er ofte umulig å oppnå når man tester små gnagerbein, så lastespennet blir ganske enkelt gjort så stort som mulig, men med så liten endring i tverrsnittsform som mulig. Videre, når du utfører firepunktsbøyning, bør forholdet mellom lengdene på nedre og øvre spenn være ~ 3: 1⁸, som vanligvis kan oppnås i tibia, men det er vanskelig i kortere lårben. I tillegg gjør de tynnere kortikale veggene i lårbenene dem utsatt for ringtype deformasjon som endrer formen på beintverrsnittet under testen (dette kan fremheves i firepunktstester, da en større kraft er nødvendig for å indusere det samme bøyemomentet sammenlignet med trepunktsbøyning). Derfor vil trepunktsbøying bli brukt for mus femora mens firepunktsbøying vil bli brukt til tibiae gjennom hele denne protokollen.

Til slutt er det viktig å drive studien riktig for statistisk analyse. En generell anbefaling for mekanisk testing er å ha en prøvestørrelse på 10-12 bein per eksperimentell gruppe for å kunne oppdage forskjeller, da noen mekaniske egenskaper, spesielt postyieldparametere, kan være svært variable. I noen tilfeller kan dette bety å starte med en høyere dyreprøvestørrelse gitt slitasje som kan oppstå under studien. Prøvestørrelsesanalyse ved hjelp av eksisterende data bør fullføres før du prøver en studie.

Det er mange begrensninger og antagelser, men bøyetester kan gi ganske nøyaktige resultater, spesielt når relative forskjeller mellom grupper er av interesse. Disse egenskapene, sammen med analyse av trabekulær arkitektur og kortikal morfologi, kan gi bedre innsikt i sykdomstilstander og behandlingsregimer. Hvis vi er forsiktige med de aspektene av eksperimentet som er i vår kontroll (f.eks. høsting, lagring, skanning og testing), kan vi føle oss sikre på at nøyaktige resultater er generert.

Protocol

Alle prosedyrer beskrevet i denne protokollen som involverte dyr har blitt godkjent av Indiana University School of Science Institutional Animal and Use Committee (IACUC) før prosedyren. Dyr beskrevet i prosedyren ble avlivet via CO₂-inhalasjon etterfulgt av cervikal dislokasjon som et sekundært middel til eutanasi.

1. Høsting, lagring og tining av bein

1. Høsting og lagring
   1. Plasser musen ventral side opp. Bruk en skalpell (eller et barberblad eller saks) for å lage et snitt i det omtrentlige krysset mellom lårbenet og bekkenet på den ene siden.
   2. Fortsett det første snittet dorsalt til hofteleddet er lokalisert; Se etter lårhodet som vises som en liten hvit kule festet til bekkenet.
   3. Påfør trykk med kanten av en skalpell til den proksimale kanten av lårhodet til lårhodet spretter ut av kontakten. Excise ekstra vev for å frigjøre bakbenet fra resten av.
   4. Med bakbenet isolert, skille tibia og lårben ved å indusere fleksjon i kneleddet. Beveg skalpellen i medial-lateral retning på den fremre overflaten av kneet for å kutte gjennom tilstøtende vev, inkludert leddbåndene mellom beinene.
   5. Hvis dette ikke skiller beinene, strekker du kneleddet for å gi tilgang til den bakre overflaten. Vær forsiktig så du ikke kutter beinet eller skraper leddbrusk.
   6. Når lårbenet og tibia er skilt, fjern bakfoten fra tibia ved å bøye leddet og bruke en medial-lateral sagbevegelse på den bakre overflaten av leddet. Om nødvendig, forleng leddet for å eksponere den fremre overflaten. Vær forsiktig så du ikke kutter beinet.
   7. Når isolert, rengjør beinene av alt vedheftende bløtvev. Hvis du utfører firepunkts bøyetester på tibia, fjern fibulaen også. Fibula er forbundet med leddbånd i den proksimale enden, men er smeltet til tibia nær den distale enden av beinet. Bruk skarp saks i nærheten av koblingspunktet for å skille fibulaen.
   8. Pakk de isolerte og rengjorte knoklene separat inn i saltvannsgjennomvåt gasbind og oppbevar dem ved -20 °C. Gjør dette umiddelbart etter høsting.
   9. Gjenta trinn 1.1.1 til og med 1.1.8 for den andre siden av.
      MERK: Hvis det er motstand når du prøver å skille beinene i trinn 1.1.4-1.1.6, er det best å gjenta trinnene i stedet for å prøve å trekke beinene fra hverandre. Kraftige bevegelser kan føre til skade eller brudd på beinene.
2. Tining
   MERK: Antall fryse-tine sykluser et bein gjennomgår bør minimeres som overdreven fryse-tine sykluser kan skade de mekaniske egenskapene til bein. Delvis tining for μCT-skanning kan oppnås ved å la benet stå i romtemperatur i 5-10 min. Bare tine benet helt når du utfører bøyetester som beskrevet nedenfor.
   1. Tining over natten
      1. Flytt knoklene fra -20 °C oppbevaring til 1-4 °C i kjølerom eller kjøleskap. Sørg for at beinene forblir der i 8-12 timer for å tine helt før testing.
   2. Rask tining
      1. Sett temperaturen på badekaret til ca. 37 °C. En gang ved denne temperaturen, legg beinene til badekaret.
      2. La beinene ligge i badekaret i ca. 1 time.

2. μCT-skanning

1. Pakk beinene inn i parafilm før skanning for å opprettholde hydrering. Hold alle andre bein på is mens du venter på å bli skannet.
2. Når det er pakket inn i parafilm, plasser benet i en holder for å kommunisere med skanneren. Forsikre deg om at alle skannede bein er justert i samme retning, da konsekvent justering vil forenkle rotasjonen senere i analysen.
3. Juster skanneinnstillingene i henhold til applikasjonen av skanningen. Følgende generelle skanneinnstillinger anbefales for musebein: oppløsning/voxelstørrelse: 10 μm; pikselstørrelse: medium, 2000 x 1048; filter: 0,5 mm aluminium; rotasjon trinn: 0,7; Gjennomsnitt av ramme: 2.
   MERK: Disse innstillingene kan variere avhengig av systemet som brukes til å skanne, og produsentens og brukerhåndboken bør konsulteres etter behov.
4. Når røntgenkilden er på, utfører du en flatfeltkorreksjon for å minimere artefakter. For å gjøre dette, må du først sørge for at kammeret er tomt og slå av det flate feltet.
5. Mål den gjennomsnittlige intensiteten til feltet og juster den til 60%. Når du har 60 %, oppdaterer du det flate feltet og slår det på igjen.
6. Sørg for at gjennomsnittlig intensitet er nå (86-88%).
   MERK: Denne prosessen kan variere avhengig av μCT-systemet som brukes. Se brukerhåndboken før du prøver prosessen.
7. Når flatfeltkorreksjonen er utført, plasser holderen i kammeret. Forsikre deg om at prøvene er sentrert og i vater før du plasserer sokkelen i kammeret.
8. Når sokkelen er sikret, lukker du kammeret, sørger for at hele beinet blir fanget i skanningen (en speidervisning kan være nødvendig), og start skanningen.
9. Etter skanning skal skjelettet oppbevares på nytt i saltvannsdynket gasbind ved -20 °C.

3. μCT rekonstruksjon

1. Velg en avkastning som vil fange opp hele beinet i rekonstruksjonen. For å gjøre dette, se det største tverrsnittet av bein og størrelse avkastningen basert på dette tverrsnittet.
2. Sett terskelen til programvaren for å tillate riktig anerkjennelse av bein sammenlignet med ikke-bein. Hvis du vil gjøre dette, bruker du et histogram der en nedre begrensning er satt til 0 og den øvre begrensningen er satt på slutten av topphistogramdataene.
3. Juster tilleggsinnstillinger, inkludert reduksjon av ringartefakter og stråleherding til henholdsvis 5 og 20 %. Kontroller at feiljusteringskompensasjonen er innenfor området -7 til 7. Disse verdiene kan variere avhengig av programvaren. Forsikre deg om at de er verifisert med brukerhåndboken og produsentbaserte instruksjoner før du begynner rekonstruksjonen.
   MERK: Artefakter kan minimeres under rekonstruksjon ved hjelp av korrigeringer for stråleherding, ringartefakter og feiljusteringskompensasjon. Feiljusteringskompensasjon kan fungere som en indikator på kvaliteten på skanningen, og hvis den er utenfor et produsentspesifisert område, må skanningen gjentas. Rekonstruksjonsinnstillinger vil imidlertid være programvareavhengige, og brukerhåndboken bør konsulteres.

4. μCT rotasjon

MERK: Når de er rekonstruert, må skanningene roteres for å etablere konsistent orientering over alle bein, og for å sikre at tverrsnitt av det resulterende beinet blir tatt normalt til lengdeaksen med så liten offsetvinkel som mulig. Dette bør gjøres med brukerens programvare du velger.

1. Femur rotasjon
   1. Roter lårbenet slik at alle bein har samme langsgående orientering. For eksempel, orienter alle bein med den proksimale enden av beinet øverst på skanningen.
   2. Roter beinet slik at tverrsnittsorienteringen til alle bein er den samme. For eksempel, roter beinene slik at den fremre siden alltid er på høyre side av skanninger.
   3. Når disse justeringene er gjort, retter du ut skanningen for å sikre at symmetrien opprettholdes om den sentrale aksen.
   4. Lagre det roterte datasettet.
2. Tibia rotasjon
   1. Gjenta trinn 4.1.1-4.1.4 for tibia.

5. Mekanisk testprosedyre

1. Forberedelse
   1. Før mekanisk testing, sørg for at en 6-10 μm oppløsning μCT-skanning er oppnådd og rekonstruert for å verifisere at det er oppnådd en kvalitetsskanning for hver prøve for å beregne tverrsnittsgeometri på bruddstedet (avsnitt 2-3).
   2. Med skanninger oppnådd og verifisert, tine alle bein før testing (avsnitt 1). Test alle bein fra ett eksperiment på samme dag og randomiser testrekkefølgen for å minimere brukerforstyrrelser og systemvariabilitet på tvers av prøver og eksperimentelle grupper. Sørg for at beinene forblir hydrert gjennom hele testprosessen.
2. Apparat oppsett
   1. Finn en lastcelle med passende følsomhet og kapasitet for prøven. Vurder det forventede feilområdet for prøven og velg en lastcelle med omtrent 50 % mer kapasitet samtidig som følsomheten maksimeres (f.eks. en lastcelle på 10 lbf med en kapasitet på 45 N for et museben i feilområdet 0-25 N).
   2. Finn laste- og støttespenningsarmaturer.
   3. Installer lastcellen og armaturene som vist i figur 1, ved å skru lastcellen på enten topp- eller bunnstøtten til testeren, den øverste lastearmaturen på lastcellen og bunnarmaturen på testerens bunnstøtte. Sørg for en sikker passform.
      MERK: Festing av lastcellen til topparmaturen anbefales generelt når du utfører bøyetester for å unngå væskekontakt med lastcellen, men bunnen kan brukes om nødvendig.
   4. Når lastcellen og armaturene er installert, velger du en støttelengde og sørger for at den forblir konstant for alle prøvene som testes. For å velge en støttespenningsavstand, finn først det korteste beinet i prøvesettet.
   5. Orienter benet mellom armaturene som vist i figur 2.
   6. For trepunktsbøyning av lårbenet, følg figur 2A. Forsikre deg om at den fremre overflaten av beinet er mot støttespennet og at spenningsområdet er innenfor prøvens diafyse. Unngå å inkludere den tredje trokanteren på den proksimale enden og overgangspunktet der beinet utvider seg til metafysen og kondylene på den distale enden.
   7. For firepunkts bøying, sørg for at støtte- og lastespennene er justert og sentrert med hverandre. Følg figur 2B for å legge beinet i armaturene.
      1. Still inn støtte- og lastespennlengdene til å følge et 3:1-forhold⁸ (f.eks. 9 mm støttespenn og 3 mm lastespenn).
      2. For en tibia, belast den mediale overflaten av beinet mot støttespennet med en støtte ved tibia/fibula-overgangen. Den andre støtten vil sannsynligvis bli plassert like etter tibialkammen. Forsikre lastespennet, sentrert innenfor støttespennet, og inneholder deretter et jevnt område av beinet.
   8. Mål støttespennavstanden hvis du utfører trepunktsbøying og både laste- og støttespenningsavstander hvis du utfører 4-punkts bøying og registrer disse avstandene. Forsikre deg om at denne verdien registreres fra midten av lastepunktene for både laste- og støttespenningsmålingene.
   9. Legg benet tilbake i saltvann eller rehydrater med en bolus av saltvann.
      MERK: Når du velger punkter for et lastespenn, anbefales det å bruke sirkulære punkter (en radius på 0,75 mm er tilstrekkelig da den fordeler lasten samtidig som den kommer i kontakt med beinet ved sirkelens tangent). Mens teorien anbefaler en knivkant for å representere en punktbelastning, vil dette knuse beinet ved belastningspunktet, noe som fører til overestimering av belastning og underestimering av modul.
   10. Forsikre deg om at alle deler av armaturen er tette og fri for bevegelse.
3. Oppsett av programvare
   1. Forsikre deg om at testeren er riktig koblet til datamaskinen via modulboksen, lastcellekanaler og andre krav i henhold til systemhåndboken.
   2. I programvaren som er forbundet med den mekaniske testeren, opprett en bøyetestprofil med en rampe som har en forskyvningshastighet som er langsom nok til ikke å indusere viskoelastiske effekter (0,025 mm / s brukes ofte) for å laste beinet til svikt.
   3. En minste samplingsfrekvens på 25 Hz anbefales også når du oppretter en testprofil, selv om en høyere samplingsfrekvens foretrekkes.
   4. Opprett én mappe per studiegruppe, og lagre hver prøve som en individuell fil i den mappen.
4. Lasting og testing av prøver
   1. Velg et riktig tint ben (se trinn 1.2). Mål og registrer hele lengden med kalipere.
   2. Legg prøven på armaturene som vist i figur 2A hvis du tester et lårben i trepunktsbøyning og figur 2B hvis du tester en tibia i firepunktsbøyning.
   3. Endre filnavnet for å gjenspeile prøven som testes.
   4. Null belastningen (ikke forskyvningen). Slå på flytteren til systemet; Forsikre deg om at den ikke er i last- eller forskyvningskontroll.
   5. Vær forsiktig, bruk en minimal forspenning på beinet for å sikre posisjonen og forhindre at beinet ruller, men sørg for at det ikke kompromitterer prøven. Sikt etter en forspenning på ca. 0,25 N. Sørg for at ønsket benorientering opprettholdes før du fortsetter.
   6. Hydrater prøven ved å dynke den sjenerøst med saltvann.
   7. Start bøyetesten ved å velge Start eller Kjør i programvaren. KRITISK: Se nøye på prøven for hele testen og noter testene der det oppstod problemer (f.eks. rulling, glidning).
      MERK: Disse problemene kan kompromittere data, og notater om disse testene vil være nyttige å konsultere under analysen.
   8. Se etter at beinet begynner å sprekke (på strekksiden). De fleste tester vil fortsette til feil oppstår. På dette tidspunktet vil testen avsluttes via sine programmerte grenser. Hvis det oppstår feil, men testeren fortsetter å forskyve, må du stoppe testen manuelt for å forhindre skade på lastcellen.
   9. Når testingen er fullført, måler du lengden fra den distale enden til bruddpunktet ved hjelp av kaliper og registrerer det.
   10. Gjenta trinn 5.4.1 – 5.4.9 for hver prøve.

Figur 1: Oppsett av mekanisk tester. (A) Trepunkts og (B) firepunkts bøyetester. Lastcellen vises i gult, lastearmaturene vises i blått, og støttearmaturene vises i grønt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Orientering av bein mellom inventar . (A) Riktig orientering av et lårben i trepunkts bøyende lastearmaturer som viser (fra topp til bunn) utsikt fra medial, fremre og bakre side av lårbenet når det er riktig plassert. Lastearmaturene vises i oransje og støttearmaturene vises i blått. De nederste spennene bør justeres for å inkludere så mye av den retteste delen av diafysen som mulig, og topparmaturen bør sentreres mellom disse spennene. (B) Riktig orientering av en tibia for firepunktsbøyning som viser (fra topp til bunn) utsikt fra de fremre, laterale og mediale sidene av tibia. Benet skal belastes slik at den mediale overflaten kommer i kontakt med bunnarmaturen, og sideflaten kommer i kontakt med topparmaturen. Tibia-fibula-krysset skal plasseres like utenfor lastespennet. Spenn bør justeres for best å møte et last-til-støtte-spanforhold på 1:3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

6. Valg av avkastning

1. Når pauselengdene er registrert, laster du de roterte bildene inn i brukerens valgte programvare. Når de roterte bildene er lastet inn, finn og registrer de øverste og nederste skivene av beinet.
2. Beregn forskjellen mellom topp- og bunnstykkene. Multipliser denne verdien med skanningsvoxelstørrelsen for å bestemme den totale lengden på beinet i mikrometer.
3. For å lokalisere bruddstedet i CT-skanningen, del den registrerte pauselengden (i mikrometer) med voxelstørrelse for å oppnå antall μCT-skiver fra den distale enden av skanningen til bruddpunktet.
4. Velg en avkastning, sentrert på denne plasseringen. Angi først den totale ønskede lengden på avkastningen (minst 100 μm). Finn antall skiver denne lengden representerer ved å dele lengden i mikrometer med voxelstørrelsen for å bestemme det totale antallet skiver i avkastningen.
5. Hvis du vil oppnå den nedre grensen for avkastningen, deler du det totale antallet ROI-stykker med 2 og trekker denne verdien fra den tidligere beregnede pauseplasseringen i trinn 6.4.
6. Legg til den totale lengden på avkastningen i stykker til den tidligere beregnede verdien for å få den øvre grensen for avkastningen.
7. Velg riktig avkastning, basert på beregnede grenser, og lagre den.

7. Normalisering av kraft- og forskyvningsdata

MERK: Den mekaniske testeren vil bare generere poeng med x- og y-koordinater (forskyvning, kraft). Disse punktene kan konverteres til spenning og tøyning ved hjelp av Euler-Bernoulli bøyespennings- og tøyningsligninger, men disse krever geometriske egenskaper oppnådd fra μCT-skanninger. Kvantifiseringen av disse egenskapene kan utføres med brukerens foretrukne programvare. Vi foretrekker en tilpasset kode, som gir full kontroll over alle innganger, beregninger og utganger. Som nevnt tidligere, for tilgang til koden, kontakt den tilsvarende forfatteren direkte eller besøk laboratoriets nettside på https://bbml.et.iupui.edu/ for mer informasjon. Spennings- og tøyningsligningene, samt de nødvendige geometriske egenskapene som må oppnås fra μCT-skanninger, for å beregne disse er diskutert nedenfor.

1. Trepunkts bøyningsnormaliseringsligninger
   1. Ligningen som brukes til å beregne spenning i trepunktsbøyning er vist nedenfor i ligning 1. I denne ligningen representerer "F" kraft og "L" lengden på støttespennet. Kraftverdier registreres av den mekaniske testeren under testen. Forsikre deg om at lengden på støtteperioden registreres før testing. "c" og "I" er geometriske egenskaper som vil bli beregnet ved hjelp av μCT-skanninger (seksjon 7.3).
      (1)
   2. Ligningen for å beregne tøyning er vist nedenfor i ligning 2; "c" og "L" representerer de samme egenskapene for både spennings- og tøyningsberegninger. "D" betyr forskyvningsverdier registrert av den mekaniske testeren under tester.
      (2)
2. Firepunkts bøyningsnormaliseringsligninger
   1. Ligningen for spenning i firepunktsbøying er vist nedenfor i ligning 3. "F" og "I" forblir de samme variablene som diskuteres i trinn 7.1.1. Beregn "a" fra målingene av støtte- og lastespennet før testing. Hvis du følger det anbefalte forholdet 3: 1 for støtte til lastespenn for firepunktsbøying, vil "a" være en tredjedel av støttespennlengden.
      (3)
   2. Ligningen for tøyning i firepunktsbøying er vist nedenfor i ligning 4. "C" og "A" betyr de samme egenskapene for både spennings- og tøyningsberegninger. "D" betyr forskyvningsverdiene som registreres av den mekaniske testeren under tester.
      (4)
3. Beregning av geometriske egenskaper fra μCT-skanninger
   1. Variabelen "c" representerer avstanden fra nøytralaksen til overflaten av beinet som ble lastet i spenning. Følgelig bestemme sentroiden for hvert tverrsnitt i μCT-skanningene siden den nøytrale aksen passerer gjennom sentroid.
      1. Hvis du følger testretningen til et lårben i trepunktsbøyning beskrevet i trinn 5.2.6, måler du "c" i forhold til den fremre overflaten.
      2. Hvis du følger testorienteringen til en tibia beskrevet i trinn 5.2.7, måler du "c" med hensyn til den mediale overflaten av beinet.
   2. Variabelen "I" representerer treghetsmomentet om bøyningsaksen (medial-lateralaksen for et lårben; den fremre-bakre aksen for en tibia). Beregn denne verdien ved hjelp av ligning 5. I denne ligningen er "dA" området for hver piksel som er fanget i μCT-skanningen, mens y er den beregnede avstanden til hver piksel fra den nøytrale aksen.
      (5)

8. Mekaniske testegenskaper av interesse

1. Før du beregner noen mekaniske egenskaper, generer en kraftforskyvningskurve og spenning-tøyningskurve (ideelle kurver vist nedenfor i figur 3, sammen med signifikante egenskaper).
   MERK: Testing av biologiske prøver genererer ikke alltid kurver som ser ut som disse idealiserte eksemplene, men de forblir en nyttig guide.
2. Undersøk disse kurvene før analyse for å oppdage feil i testing, for eksempel et bein som ruller eller glir. Disse feilene forårsaker vanligvis humper eller flate områder i den første lineære delen av kurven. Fjern overflødige data, inkludert eventuelle data som kan ha blitt samlet inn før testeren kontaktet beinet eller dataene etter feil, på dette tidspunktet.
3. Når du er sikret en kvalitetstest av de plottede kurvene, begynner du å analysere betydelige egenskaper.
   1. Stivhet og elastisk modul
      1. Beregn stivhet ved å bruke bare det elastiske området av kraft-forskyvningskurven. Kurvens helling i denne regionen er stivhet.
      2. Beregn elastisk modul ved å bruke hellingen til bare den elastiske delen av spenningsbelastningskurven.
   2. Utbyttepunkt
      MERK: Det er to avkastningspunkter, ett på kraftforskyvningskurven og ett på spenning-tøyningskurven. (x,y) verdiene for dette punktet fra kraftforskyvningskurven er kjent som forskyvning for å gi og gi kraft, mens de fra spenning-tøyningskurven er kjent som belastning for å gi og gi stress. Disse punktene representerer enden av det elastiske området av kurven og kan finnes på måtene som er oppført nedenfor.
      1. Spenning-tøyningskurvemetode: Beregn en linjeforskyvning fra (0,0) med 0,2% tøyning (2000 mikrotøyning), men med samme helling som den elastiske modulen. Plott denne linjen på stressbelastningsgrafen; Posisjonen der denne linjen avskjærer spenningsbelastningskurven er definert som flytepunktet. Bruk denne flytespennings- og tøyningskoordinaten for å finne analoge kraft- og forskyvningsverdier; Disse verdiene vil representere avkastningskraft og forskyvning til avkastningsverdier.
      2. Sekantmetode: Beregne stivhet fra kraft-forskyvningskurven og redusere stivheten med en valgt prosentandel (5-10%). Plott en linje som starter på (0,0) med hellingen til denne reduserte stivheten og la den krysse med kraftforskyvningskurven. Skjæringspunktet vil ha koordinatene (forskyvning for å gi, gi kraft).
         MERK: Sekantmetoden kan brukes til å finne flytepunktet uten spenningsbelastningsdata.
   3. Ultimat kraft og ultimat stress
      1. Beregn ultimat kraft og ultimat stress ved å finne maksimumsverdien i de respektive datasettene.
   4. Forskyvning og tøyningsegenskaper
      1. Forskyvning til utbytte og belastning for å gi verdier som representerer forskyvningen eller belastningen til utbyttepunktet. For å finne dem, finn avkastningen som beskrevet i trinn 8.3.2.
      2. Verdier for total forskyvning og total tøyning representerer den totale forskyvningen eller den totale belastningen en prøve opplevde gjennom testen, og samsvarer med feilpunktet.
      3. Forskyvning etter utbytte og belastning etter avkastning: Forskyvning etter avkastning rapporteres ofte og kan beregnes ved å trekke forskyvning for å gi fra total forskyvning. Beregn belastning etter utbytte ved å trekke belastning for å gi fra total belastning, men rapporter dette med forsiktighet, da belastning først er avledet under antagelsen om at materialet er lineært elastisk (preyield). Dette gjør et postyield-mål utsatt for ugyldighet.
   5. Energi egenskaper
      1. Beregn energi som området under kraftforskyvningen eller spenningsbelastningskurven.
      2. Arealet under kraftforskyvningskurven er kjent som arbeid. Arealet beregnet under pre-yield-delen av kurven, eller det elastiske området, er kjent som elastisk arbeid eller energi. Arealet beregnet under kurven forbi utbyttepunktet, eller plastområdet, er kjent som etteravkastning eller plastarbeid, eller tapt energi.
      3. Det beregnede totale arealet under spenning-tøyningskurven er kjent som seighet eller seighetsmodul, mens området beregnet under spenning-tøyningskurven opp til utbyttepunktet er kjent som motstandskraft. Seighet etter avkastning, som belastning etter avkastning, rapporteres ofte ikke på grunn av forutsetningene i belastningsligningene om at denne egenskapen ikke faller under.

Figur 3: Kraftforskyvning og spenning-tøyningskurver. (A) Ideell kraftforskyvningskurve; (B) ideell spenning-tøyningskurve med linjen avledet fra 0,2% offsetmetoden som brukes til å beregne utbyttepunktet vist i rødt (merk at denne linjen har samme helling som for kurvens elastiske område). Nøkkelegenskaper som kan oppnås fra kraftforskyvningskurven inkluderer utbyttekraft, ultimate kraft, forskyvning for å gi, total forskyvning og arbeid. Vevsnivåegenskaper som kan oppnås fra stressbelastningskurven inkluderer flytespenning, ultimat stress, belastning for å gi, total belastning, motstandskraft og seighet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

Etter fullført CT-skanning kan de fleste utilstrekkelige skanninger fanges opp i rekonstruksjon. Ofte vil dårlige skanninger ha en høy feiljusteringskompensasjon som er en klar indikator på en feil under skanningen. Det kan imidlertid oppstå feil i andre trinn og kan også føre til unøyaktige data. Disse feilene kan ofte oppdages når de enkelte beregnede arkitektoniske egenskapene undersøkes. Hvis verdier faller langt utenfor rekkevidden til andre i en gruppe, bør skanningen, avkastningen og metoden for å beregne egenskapene undersøkes på nytt.

Når bøyetestene er fullført, bør kraftforskyvningsplottene fra hver test undersøkes for å identifisere dårlige tester som kanskje må fjernes fra datasettet. Et eksempel på en problematisk test er vist i figur 4. Plottet i figur 4A viser resultatene av en korrekt utført bøyetest. Det er et klart lineært område som mangler en lavskråning toe-in, et flytepunkt, et ultimat punkt (maksimal kraft), et fall i kraft når forskyvningen strekker seg forbi maksimal kraft og et feilpunkt. Kurven er jevn uten brå endringer i lasting før etter at det endelige punktet er nådd. Følgelig kan egenskaper fra denne testen lett identifiseres og stole på. Plottet vist i figur 4B viser resultatet av en bøyetest med flere omstridte trekk. De brå endringene i lasting og utseendet på flere topper i plottet er viktige indikatorer på problemer med denne testen. Mens mindre topper kan forekomme i en skikkelig test nær den ultimate kraften, antyder størrelsen og antall topper i denne tomten at beinet kan ha rullet under testen. Enten det observeres og noteres under testen eller ved undersøkelse av testene før analyse, bør prøvedataene undersøkes under analysen etter testing. Hvis dataene faktisk er feil eller langt utenfor rekkevidden av andre prøver i gruppen, ville det være ideelt å ikke inkludere denne testen i det endelige datasettet. Dette er en grunn til å drive eksperimentet riktig med priori effektberegninger. Det kan være mulig å rapportere bare visse egenskaper fra et utvalg (i dette tilfellet kan preyield-egenskaper være akseptable), men dette er ikke ideelt og bør forklares tydelig når det rapporteres.

Figur 4: Kraftforskyvningsplott. (A) Ideelt kraftforskyvningsplott. (B) Kraftforskyvningsplott som følge av en dårlig bøyetest. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Med alle kraftforskyvningsplott undersøkt og verdier normalisert til spenningsbelastning, kan egenskapene av interesse identifiseres og vises på flere måter. I figur 5 er resulterende kraftforskyvnings- og spenningsbelastningsplott for en hel studie vist. Dette er skjematiske representasjoner der kraften og forskyvningen ved startpunktet (0,0), utbytte, endelig punkt og svikt for hvert bein bestemmes, og deretter blir kraften/spenningen og forskyvningen/belastningen gjennomsnittet for å gi et gjennomsnittlig plott for hver gruppe. Plottene brukes ikke til statistisk analyse, men de kan brukes til å vise hvordan den generelle oppførselen varierer på grunn av faktorer som behandling eller sykdomstilstand. Plottene vist i figur 5 er fra en studie som sammenlignet kontrollmus med de induserte med en tilstand av type 2 diabetes og kronisk nyresykdom (T2D-CKD). Den rette tibiae av disse dyrene ble testet til svikt ved hjelp av firepunkts bøying og analysert for å oppnå egenskapene diskutert i protokoll avsnitt 8. Fra figur 5 er det klart at T2D-CKD-gruppen hadde reduserte mekaniske egenskaper, inkludert styrke og stivhet, både på struktur- og vevsnivå. Disse musene ser også ut til å ha reduserte postyieldegenskaper, en indikator på sprøhet. Disse plottene bør ikke brukes til å trekke endelige konklusjoner fra en studie. Snarere fungerer de som en visuell representasjon og bør verifiseres ved å utføre en statistisk analyse på alle eiendommer av interesse.

Figur 5: Kraftforskyvning og spenningsbelastningsplott for en hel studie. (A) Kraftfortrengningsplott for kontrolldyr og type 2 diabetes- og kronisk nyresykdomsinduserte dyr. Dette plottet resulterte ved å beregne gjennomsnitt av avkastningskraften, forskyvningen for å gi, den ultimate kraften, den ultimate forskyvningen, sviktkraften og den totale forskyvningen for hver gruppe og plotte disse midlene sammen med standardavvik. (B) Stressbelastning for kontrolldyr og T2D-CKD-dyr. Dette plottet var et resultat av gjennomsnittlig avkastningsstress, belastning for å gi, ultimat stress, ultimate belastning, sviktstress og total belastning og plotting av de resulterende midlene sammen med standardavvik. Forkortelse: T2D-CKD = type 2 diabetes- og kronisk nyresykdom-induserte dyr. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

De mekaniske dataene og resultatene fra en tosidig t-test er vist i tabell I. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. En generell undersøkelse antyder data innenfor riktige områder og med forventede nivåer av variabilitet. Vær oppmerksom på at etteravkastningsegenskaper har en tendens til å ha størst variasjon og derfor ofte krever de største utvalgsstørrelsene for å oppdage meningsfulle forskjeller. Som de skjematiske kurvene i figur 5 antydet, er det signifikante reduksjoner i nesten alle mekaniske egenskaper på struktur- og vevsnivå. Fra disse dataene kan det konkluderes med at den induserte sykdomstilstanden førte til bein som er svakere, mindre stive og mer utsatt for brudd på grunn av tap av deformabilitet og redusert seighet. Studier med mer nyanserte sammenligninger er kanskje ikke like enkle å tolke. Et eksempel på dette kan være hvis det observeres betydelige forbedringer på tvers av mekaniske egenskaper på strukturnivå, men ikke mekaniske egenskaper på vevsnivå. I dette tilfellet er de observerte effektene sannsynligvis drevet av endringer i beinarkitekturen (f.eks. økt areal, økt kortikal tykkelse) i stedet for forbedringer i beinkvalitet på vevsnivå. For eksempel økte beinarealet på grunn av forsterkningen av vevd bein, men vevskvaliteten har gått ned ettersom et uorganisert vevd bein nå er tilstede i stedet for et organisert lamellbein. Dette kan støttes av μCT-analyse der statistisk signifikante forbedringer i arkitekturen kan observeres. Derimot kan det være betydelige forbedringer i mekaniske egenskaper på vevsnivå med minimale/ingen forbedringer i mekaniske egenskaper på strukturnivå. Denne høye vevskvaliteten kan maskere fallgruvene til mindre bein. Datatolkningen kan bli ytterligere innviklet hvis det observeres endringer i preyield-egenskaper, men ikke i postyield-egenskaper eller omvendt. I førstnevnte tilfelle kan en endring i beinets evne til å motstå deformasjon forbedres, mens evnen til å tolerere skade ikke er det. I hvert av disse tilfellene er muligheten til å referere til arkitektoniske egenskaper fra μCT-analyse svært fordelaktig og bør benyttes (selv om det å beskrive denne metoden er utenfor omfanget av dette papiret). På grunn av kompleksiteten i tolkningen av disse egenskapene, gir presentasjon av alle egenskaper i tabell- eller figurform (ikke bare de egenskapene som pleier å være lettest å tolke, for eksempel ultimate kraft, eller som forteller historien man ønsker å fortelle) en mer fullstendig representasjon av de mekaniske påvirkningene.

			Kontroll	T2D-CKD	P-verdi
Flytekraft (N)			19,7 ± 2,9	15.2 ± 2.6	0.0032**
Ultimate Force (N)			22,8 ± 3	17.6 ± 3.4	0.0031**
Forskyvning til utbytte (μm)			205 ± 17	190 ± 21	0.1039
Forskyvning etter utbytte (μm)			246 ± 235	60 ± 51	0.0435*
Total forskyvning (μm)			451 ± 230	249 ± 53	0.0278*
Stivhet (N/mm)			110 ± 10	91 ± 13	0.0037**
Arbeid for å gi (mJ)			2,16 ± 0,45	1,54 ± 0,36	0.0055**
Postyield Arbeid (mJ)			4,24 ± 3,01	1,04 ± 0,9	0.0109*
Totalt arbeid (mJ)			6,4 ± 2,88	2,58 ± 0,97	0.0025**
Flytespenning (MPa)			180 ± 20	157 ± 25	0.0504
Ultimat stress (MPa)			209 ± 26	181 ± 27	0.0434*
Belastning å gi (mɛ)			16,8 ± 2	16,4 ± 1,5	0.5771
Total belastning (mɛ)			36,6 ± 17,2	21,5 ± 4.3	0.0277*
Modul (GPa)			12.2 ± 1.1	1.1 1.1 ± 10.9	0.0171*
Motstandsdyktighet (MPa)			1,62 ± 0,33	1,38 ± 0,33	0.1377
Seighet (MPa)			4,85 ± 2,29	2,26 ± 0,73	0.0076**

Tabell 1: Resultater av mekanisk testing og statistisk analyse. Verdier vist som gjennomsnitt ± standardavvik. P-verdier er et resultat av en tosidig, upparet t-test. * P < 0,05 og ** P < 0,01. Forkortelse: T2D-CKD = type 2 diabetes- og kronisk nyresykdom-induserte dyr.

Discussion

Gjennom hele skanne- og testprosessen er det øyeblikk når feilsøking og optimalisering er passende. Den første av disse oppstår når du skanner bein ved hjelp av μCT. Mens mange systemer kommer med en holder der ett objekt kan holdes og skannes, kan tilpassede holdere fremstilles for å skanne flere bein samtidig. Skanning av flere bein kan være et utmerket poeng for optimalisering, men forsiktighet bør tas gjennom hele skannings- og analyseprosessen for å sikre at artefakter ikke blir indusert. Når røntgenstråler passerer gjennom (og dempes av) varierende mengder beinvev ved hvert vinkeltrinn, kan dette føre til unøyaktighet i de resulterende dataene.

Et annet punkt for feilsøking oppstår i rekonstruksjon av skanninger. Avhengig av hvilket program som brukes, kan brukeren definere tetthetsvinduet for rekonstruksjon, beregnet ut fra dempingskoeffisientverdiene til skanningen. Dette er en lineær koeffisient som brukes til å representere hvor mye røntgenstrålen dempes av et objekt⁵. Noen programmer henter disse tetthetene og konverterer dem til gråtoneverdier fra 0 til 255 i et histogram. To verdier vil bli vist i et histogram og er kjent som kontrastgrenser¹⁰, som må settes hensiktsmessig for å tillate gjenkjennelse av bein versus ikke-bein voxels. Den laveste verdien vil normalt settes til en gråskalaverdi på null, mens verdien for høyere kontrast anbefales å settes til 10–20 % av maksimal demping av materialet av interesse (bein)¹⁰. Det kan oppstå feil i analysen hvis denne verdien ikke er riktig angitt, da deler av data kan bli kuttet av. Derfor må denne verdien justeres avhengig av prøven som ble skannet. Den beste fremgangsmåten er å vise histogrammet på en logaritmisk skala og velge den øvre grensen som et tall som er litt større enn enden av den logaritmiske halen for å sikre at alle beindata er inkludert¹⁰.

Ytterligere punkter for feilsøking oppstår under mekanisk testing og analyse. Under testing og visning av kraftforskyvningskurver etter testen, kan prøver som rullet bli oppdaget og bør fjernes fra datasettet som diskutert i de representative resultatene. Videre bør det utvises forsiktighet med hensyn til orienteringen av beinet, da det er forutsetninger som styrer formen på beinet som testes. Ved bruk av Euler-Bernoulli bøyeligninger for å beregne spenning og tøyning, antas det at prøven har et jevnt tverrsnitt langs lengden³. Gitt at de fleste bein ikke har et jevnt tverrsnitt, er det best å velge den mest ensartede regionen av beinet for å teste (over hele støttespennet for trepunktsbøyning eller mellom lastepunktene for firepunktsbøyning).

I et lårben foretrekkes testing i trepunktsbøyning ved midtakselen. På grunn av den milde krumningen av beinet, bør man teste i krumningsretningen for å forhindre lokal overflateknekking (dvs. teste lårbenet med den fremre overflaten i spenning). Tibia har en mer variabel tverrsnittsform, så den ideelle regionen å teste begynner like proksimalt til krysset mellom tibia og fibula. Hvis benet er plassert med den mediale overflaten i spenning, er benområdet som testes flatt og har minst variasjon i radius og treghetsmoment i bøyningsretningen. Forsiktighet bør også utvises ved tolkning av resultatene av bøyetestene på grunn av antagelsen om at materialet er isotropt, homogent og lineært elastisk - hver av disse antagelsene brytes til en viss grad ved testing av bein³. Bones manglende evne til å tilpasse disse antagelsene fører til resultater fra bøyetester som må tolkes med forsiktighet. Egenskapene som må tolkes mest nøye er de som er avledet fra spenningsbelastningskurven forbi utbyttepunktet, siden passerende utbytte per definisjon bryter med den lineære elastiske forutsetningen. Mens normalisering til beinets form kan gjøres, anbefales det ikke å forsøke å normalisere til dyrs kroppsvekt med mindre det er grove forskjeller mellom grupper. I dette tilfellet kan en kovariansanalyse utføres for å kompensere for disse forskjellene, men generell normalisering til kroppsvekt bør unngås i de fleste tilfeller.

Til tross for feilsøkingsproblemene som kan oppstå gjennom denne prosessen, gir bøyetester mekaniske egenskaper som kan beskrive et beins følsomhet for brudd. Disse testene er også relativt enkle og raske å utføre. Selv om absolutte verdier fra disse testene kanskje ikke alltid er helt gyldige, kan det være ganske nøyaktig å kunne oppdage relative forskjeller mellom grupper for prøver av forskjellige størrelser og former. De mekaniske egenskapene som er oppnådd, gir funksjonell relevans i studier der forskjeller i bein kan forventes. Selv om monotone feiltester er den vanligste og lettest for lett tilgjengelige mekaniske tester, kan andre metoder, inkludert utmattingslevetid og bruddseighet, avsløre ytterligere mekaniske egenskaper av interesse og kan vurderes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAn	Bruker	NA	CT Scan Analysis Software
DataViewer	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Coding platform used for data analysis
NRecon	Bruker	NA	CT Scan Reconstruction software
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software	Micro Photonics Inc	SKY-016814	Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object