Praktiske overvejelser ved design, udførelse og fortolkning af undersøgelser, der involverer helbenbøjningstest af gnaverknogler

Summary

Mekanisk test af gnaverben er en værdifuld metode til at udtrække oplysninger om en knogles modtagelighed for brud. I mangel af ordentlig praktisk forståelse kan resultaterne blive overfortolket eller mangle validitet. Denne protokol vil tjene som en vejledning til at sikre, at mekaniske tests udføres nøjagtigt for at give gyldige og funktionelle data.

Abstract

Skeletal skrøbelighed, der fører til brud, er en amerikansk folkesundhedskrise, der resulterer i 1,5 millioner brud hvert år og 18 milliarder dollars i direkte plejeomkostninger. Evnen til at forstå mekanismerne bag knoglesygdom og respons på behandling er ikke kun ønsket, men kritisk. Mekanisk test af knogle tjener som en værdifuld teknik til forståelse og kvantificering af en knogles modtagelighed for brud. Selvom denne metode synes enkel at udføre, kan der drages upassende og unøjagtige konklusioner, hvis brugeren ser bort fra styrende antagelser og nøgletrin. Dette er blevet observeret på tværs af discipliner, da undersøgelser fortsat offentliggøres med misbrug af metoder og forkert fortolkning af resultater. Denne protokol vil tjene som en primer for principperne forbundet med mekanisk test sammen med anvendelsen af disse teknikker - fra overvejelser om prøvestørrelse gennem vævshøst og opbevaring til dataanalyse og fortolkning. Med dette i hånden kan der opnås værdifuld information om en knogles modtagelighed for brud, hvilket fremmer forståelsen for både akademisk forskning og kliniske løsninger.

Introduction

Mekanisk test af knogle er den primære metode til at udtrække funktionel information relateret til en knogles modtagelighed for brud. I prækliniske undersøgelser kan flere testmetoder anvendes, men langt den mest almindelige er bøjning af lange knogler. Disse tests er nemme at udføre og kan bruges på knogler, der spænder i størrelse fra menneske til mus. Da mus er et af de mest almindeligt undersøgte dyr i præklinisk forskning, vil denne protokol fokusere på bøjningstest udført på lårben og skinneben hos mus.

Før der udføres bøjningstest, skal knoglerne høstes og opbevares korrekt. De mest almindelige opbevaringsmetoder har traditionelt været frysning af knogler i saltvandsgennemblødt gaze, frysning i saltvand alene eller dehydrering af knogler i ethanol ¹. Knogler lagret i ethanol har vist sig at have øget stivhed og elastisk modul og nedsat deformationsparametre i forhold til dem, der opbevares frosne¹. Selv rehydrering af knoglerne før testning genopretter ikke disse egenskaber tilbage til normale niveauer ¹. Opbevaring nedsænket i saltvand kan forårsage skade på knoglen, da trykket udøves, når saltvandet udvides. Derudover ville en fuldstændig optøning af opløsningen være nødvendig for at fjerne knoglerne til mikrocomputertomografi (μCT) scanning. Derfor er frysning af friskhøstede knogler i saltvandsgennemblødt gaze blevet standardopbevaringsmetoden og anbefales i hele denne protokol.

Fordi størrelsen og formen af en knogle påvirker dens bulkstyrke, og mange sygdomsmodeller væsentligt ændrer knoglestørrelse og morfologi, anvendes tekniske principper til at normalisere virkningerne af størrelse for at producere egenskaber, der estimerer vævets opførsel². Denne tilgang kræver tværsnitsgeometri af fejlplaceringen, som oftest erhverves ved hjælp af μCT til at oprette scanninger af knoglerne inden testning. μCT er meget udbredt på grund af dets tilgængelighed og høje billedopløsning. Desuden er bidrag fra blødt væv ikke inkluderet, og scanning kræver ikke kemisk fiksering eller andre ændringer af knoglen ^3,4. I alle former for CT er en røntgenkilde fokuseret på et objekt, mens en detektor på den anden side af objektet måler den resulterende røntgenenergi. Dette giver en røntgenskygge af prøven, der kan konverteres til et billede ^3,5. Objektet, der scannes, roteres (eller røntgenkilden og detektoren roteres rundt om prøven) og genererer billeder, der kan rekonstrueres til et tredimensionelt datasæt, der repræsenterer objektet⁵.

Scanningsopløsning, eller hvor tæt to objekter kan være og stadig løses individuelt, styres ved at ændre den nominelle voxelstørrelse eller størrelsen på en pixel i det resulterende billede. Det er generelt accepteret, at objekter skal være mindst to gange størrelsen af en enkelt voxel for at blive identificeret³, men et højere forhold vil give mulighed for forbedret præcision. Endvidere er større voxels mere tilbøjelige til delvise volumeneffekter: Når en enkelt voxel indeholder væv med varierende tætheder, tildeles den gennemsnittet af disse tætheder snarere end den specifikke tæthed af et enkelt væv, hvilket kan føre til en over- eller undervurdering af vævsområder og mineraltæthed³. Selvom disse problemer kan afhjælpes ved at vælge mindre voxelstørrelser, sikrer brug af en højere opløsning ikke eliminering af delvise lydstyrkeeffekter og kan kræve længere scanningstider³. Ved scanning af knogler ex vivo anbefales en voxelstørrelse på 6-10 μm generelt for nøjagtigt at vurdere museknoglernes trabekulære arkitektur. En større voxelstørrelse på 10-17 μm kan bruges til kortikal knogle, selvom den mindste rimelige voxelstørrelse skal bruges. Denne protokol bruger en voxelstørrelse på 10 μm, hvilket er lille nok til at differentiere vigtige trabekulære egenskaber og minimere delvise volumeneffekter uden omfattende scanningstid.

Røntgenenergi og energifilterindstillinger skal også vælges omhyggeligt, da knoglevævets høje mineraltæthed og tykkelse i høj grad dæmper og ændrer det transmitterede røntgenenergispektrum. Det antages generelt, at fordi det udsendte røntgenspektrum svarer til det spektrum, der forlader objektet⁶, kan brug af lavenergi røntgenstråler på tætte genstande som knogle føre til en artefakt kendt som strålehærdning⁷. En højere spænding på 50-70 kVp anbefales ved scanning af knogleprøver for at reducere forekomsten af disse artefakter⁵. Derudover skaber indsættelse af et aluminium- eller kobberenergifilter en mere koncentreret energistråle, hvilket yderligere minimerer artefakter ^4,7. Et 0,5 mm aluminiumsfilter vil blive brugt i hele denne protokol.

Endelig styrer scanningsrotationstrinnet og rotationslængden (f.eks. 180°-360°) sammen antallet af billeder, der tages, hvilket bestemmer mængden af støj i den endelige scanning⁴. Gennemsnitligt antal billeder i hvert trin kan reducere støj, men kan øge scanningstiden⁴. Denne protokol bruger et rotationstrin på 0,7 grader og en ramme med et gennemsnit på 2.

En sidste bemærkning om scanning: hydroxyapatitkalibreringsfantomer skal scannes ved hjælp af de samme scanningsindstillinger som forsøgsknoglerne for at muliggøre konvertering af dæmpningskoefficienter til mineraldensitet i g / cm³⁵. Denne protokol bruger fantomer på 0,25 g / cm 3 og 0,75 g / cm³ hydroxyapatit, selvom forskellige fantomer er tilgængelige. Bemærk, at nogle scanningssystemer bruger interne fantomer som en del af den daglige systemkalibrering.

Når scanningen er afsluttet, rekonstrueres vinkelprojektionerne til tværsnitsbilleder af objektet, typisk ved hjælp af producentens ledsagende software. Uanset hvilket system der anvendes, er det vigtigt at sikre, at hele knoglen fanges i rekonstruktionen, og at tærskelværdien er indstillet korrekt for at muliggøre genkendelse af knogle versus ikke-knogle. Efter genopbygning er det afgørende at rotere alle scanninger i tre dimensioner, så knoglerne orienteres konsekvent og korrekt justeret med tværaksen, igen ved hjælp af producentens software.

Efter rotation kan interesseområder (ROI) til analyse vælges ud fra, om kortikale egenskaber, trabekulære egenskaber eller brudgeometri til mekanisk normalisering ønskes. For sidstnævnte bør ROI'er vælges efter test ved at måle afstanden fra frakturstedet til den ene ende af knoglen og bruge voxelstørrelse til at bestemme den tilsvarende skiveplacering i scanningsfilen. Det valgte område skal være mindst 100 μm langt med brudpunktet i det omtrentlige centrum af ROI for at give tilstrækkelig estimering⁴.

Når ROI'er er valgt, er der brug for to egenskaber til mekanisk normalisering (for at beregne bøjningsspænding og belastning): den maksimale afstand fra den neutrale bøjningsakse til overfladen, hvor fejl startes (antages at være overfladen belastet i spænding, bestemt af testopsætningen) og inertimomentet omkring den neutrale akse (også afhængig af testopsætning). Denne protokol anbefaler, at du bruger en brugerdefineret kode til at bestemme disse værdier. For at få adgang til koden skal du kontakte den tilsvarende forfatter direkte eller besøge laboratoriewebstedet på https://bbml.et.iupui.edu/ for mere information.

Når μCT-scanning er afsluttet, kan mekanisk test begynde. Bøjningstest kan udføres i enten firepunkts- eller trepunktskonfigurationer. Firepunktsbøjningstest foretrækkes, da de eliminerer forskydningsspænding i knoglen mellem læssepunkter, hvilket gør det muligt at foretage ren bøjning i dette område³. Knoglen vil derefter bryde på grund af spænding, hvilket skaber en fejl, der er mere repræsentativ for knoglens sande bøjningsegenskaber³. Benet skal dog belastes på en sådan måde, at det giver samme belastning på begge læssepunkter (dette kan lettes med et drejeligt læssehoved). I trepunkts bøjningstest er der en stor ændring i forskydningsspænding, hvor belastningspunktet møder knoglen, hvilket får knoglen til at bryde på dette tidspunkt på grund af forskydning, ikke spænding³. ASTM-standarder anbefaler, at materialer, der gennemgår bøjning, skal have et forhold mellem længde og bredde på 16: 1, hvilket betyder, at længden af støttespændet skal være 16 gange større end knoglens bredde for at minimere påvirkningen af forskydning ^8,9. Dette er ofte umuligt at opnå, når man tester små gnaverben, så belastningsspændvidden gøres simpelthen så stor som muligt, men med så lille en ændring i tværsnitsform som muligt. Desuden skal forholdet mellem længderne af det nedre og øvre spændvidde, når der udføres firepunktsbøjning, være ~ 3: 1⁸, hvilket normalt kan opnås i skinnebenet, men det er vanskeligt i den kortere lårben. Derudover gør lårbenets tyndere kortikale vægge dem modtagelige for deformation af ringtypen, som ændrer formen på knogletværsnittet under testen (dette kan forstærkes i firepunktstest, da der kræves en større kraft for at fremkalde det samme bøjningsmoment sammenlignet med trepunktsbøjning). Derfor vil trepunktsbøjning blive brugt til musefemora, mens firepunktsbøjning vil blive brugt til skinneben i hele denne protokol.

Endelig er det vigtigt at drive undersøgelsen korrekt til statistisk analyse. En generel anbefaling til mekanisk test er at have en prøvestørrelse på 10-12 knogler pr. eksperimentel gruppe for at kunne detektere forskelle, da nogle mekaniske egenskaber, især postyield parametre, kan være meget variable. I nogle tilfælde kan dette betyde at starte med en højere dyreprøvestørrelse givet slid, der kan forekomme under undersøgelsen. Analyse af stikprøvestørrelse ved hjælp af eksisterende data bør afsluttes, inden der forsøges en undersøgelse.

Der er mange begrænsninger og antagelser, men bøjningstest kan give ret nøjagtige resultater, især når relative forskelle mellem grupper er af interesse. Disse egenskaber kan sammen med analysen af trabekulær arkitektur og kortikal morfologi give bedre indsigt i sygdomstilstande og behandlingsregimer. Hvis der udvises omhu med de aspekter af eksperimentet, der er under vores kontrol (f.eks. høst, opbevaring, scanning og test), kan vi føle os sikre på, at der er genereret nøjagtige resultater.

Protocol

Alle procedurer, der er beskrevet i hele denne protokol, og som involverede dyr, er blevet godkendt af Indiana University School of Science Institutional Animal and Use Committee (IACUC) forud for proceduren. Dyr beskrevet i proceduren blev aflivet via CO₂indånding efterfulgt af cervikal dislokation som et sekundært middel til eutanasi.

1. Høst, opbevaring og optøning af knogler

1. Høst og opbevaring
   1. Placer musens ventrale side opad. Brug en skalpel (eller et barberblad eller en saks) til at lave et snit ved det omtrentlige kryds mellem lårbenet og bækkenet på den ene side.
   2. Fortsæt det indledende snit dorsalt, indtil hofteleddet er placeret; Se efter lårbenshovedet, der fremstår som en lille hvid kugle fastgjort til bækkenet.
   3. Påfør tryk med kanten af en skalpel på den proksimale kant af lårhovedet, indtil lårbenshovedet springer ud af stikkontakten. Punktafgifter yderligere væv for at frigøre bagbenet fra resten af slagtekroppen.
   4. Med bagbenet isoleret, adskille skinneben og lårben ved at inducere bøjning ved knæleddet. Flyt skalpellen i medial-lateral retning på knæets forreste overflade for at skære gennem ethvert tilstødende væv, herunder ledbåndene mellem knoglerne.
   5. Hvis dette ikke adskiller knoglerne, skal du forlænge knæleddet for at give adgang til den bageste overflade. Pas på at undgå at skære knoglen eller skrabe ledbrusk.
   6. Når lårbenet og skinnebenet er adskilt, skal du fjerne bagfoden fra skinnebenet ved at bøje leddet og bruge en medial-lateral savbevægelse på den bageste overflade af leddet. Forlæng om nødvendigt leddet for at udsætte den forreste overflade. Pas på at undgå at skære knoglen.
   7. Når du er isoleret, skal du rense knoglerne for alt klæbende blødt væv. Hvis du udfører firepunkts bøjningstest på skinnebenet, skal du også fjerne fibulaen. Fibula er forbundet med ledbånd i den proksimale ende, men er smeltet sammen med skinnebenet nær den distale ende af knoglen. Brug en skarp saks nær forbindelsespunktet til at adskille fibulaen.
   8. De isolerede og rensede knogler pakkes separat ind i saltvandsgennemblødt gaze og opbevares ved -20 °C. Gør dette umiddelbart efter høst.
   9. Trin 1.1.1 til 1.1.8 gentages for den anden side af slagtekroppen.
      BEMÆRK: Hvis der er modstand, når man forsøger at adskille knoglerne i trin 1.1.4-1.1.6, er det bedst at gentage trinene i stedet for at forsøge at trække knoglerne fra hinanden. Kraftige bevægelser kan føre til skader eller brud på knoglerne.
2. Optøning
   BEMÆRK: Antallet af fryse-optøningscyklusser, som en knogle gennemgår, bør minimeres, da overdreven fryse-optøningscyklusser kan påvirke knoglens mekaniske egenskaber negativt. Delvis optøning ved μCT-scanning kan opnås ved at lade knoglen stå ved stuetemperatur i 5-10 min. Optø kun knoglen fuldstændigt, når du udfører bøjningstest som beskrevet nedenfor.
   1. Optøning natten over foretrækkes
      1. Flyt knoglerne fra -20 °C opbevaring til 1-4 °C i et kølerum eller køleskab. Sørg for, at knoglerne forbliver der i 8-12 timer for at tø helt op inden test.
   2. Hurtig optøning
      1. Badets temperatur indstilles til ca. 37 °C. Når du er ved denne temperatur, skal du tilføje knoglerne til badet.
      2. Lad knoglerne stå i badet i ca. 1 time.

2. μCT-scanning

1. Pak knoglerne ind i parafilm før scanning for at opretholde hydrering. Hold alle andre knogler på is, mens du venter på at blive scannet.
2. Når den er pakket ind i parafilm, skal du placere knoglen i en holder for at kommunikere med scanneren. Sørg for, at alle scannede knogler er justeret i samme retning, da konsekvent justering vil forenkle rotationen senere i analysen.
3. Juster scanningsindstillingerne i henhold til scanningens anvendelse. Følgende generelle scanningsindstillinger anbefales til museknogler: opløsning/voxelstørrelse: 10 μm; pixelstørrelse: medium, 2000 x 1048; filter: 0,5 mm aluminium; rotation trin: 0,7; ramme gennemsnit: 2.
   BEMÆRK: Disse indstillinger kan variere afhængigt af det system, der bruges til at scanne, og producentens og brugervejledningen skal konsulteres efter behov.
4. Når røntgenkilden er tændt, skal du udføre en korrektion af fladt felt for at minimere artefakter. For at gøre dette skal du først sikre dig, at kammeret er tomt og slukke for det flade felt.
5. Mål feltets gennemsnitlige intensitet og juster den til 60%. Når du er på 60%, skal du opdatere det flade felt og tænde det igen.
6. Sørg for, at den gennemsnitlige intensitet er nu (86-88%).
   BEMÆRK: Denne proces kan variere afhængigt af det anvendte μCT-system. Se brugervejledningen, før du forsøger processen.
7. Når korrektionen af fladfeltet er udført, anbringes holderen i kammeret. Sørg for, at prøverne er centreret og plan, inden du placerer piedestalen i kammeret.
8. Når piedestalen er sikret, skal du lukke kammeret, sikre dig, at hele knoglen bliver fanget i scanningen (en spejdervisning kan være nødvendig) og starte scanningen.
9. Efter scanningen opbevares knoglerne igen i saltvandsgennemblødt gaze ved -20 °C.

3. μCT-rekonstruktion

1. Vælg en ROI, der vil fange hele knoglen i rekonstruktion. For at gøre dette skal du se det største tværsnit af knogle og størrelse ROI baseret på dette tværsnit.
2. Indstil tærsklen for softwaren for at muliggøre korrekt genkendelse af knogle sammenlignet med ikke-knogle. For at gøre dette skal du bruge et histogram, hvor en nedre begrænsning er indstillet til 0, og den øverste begrænsning er indstillet i slutningen af peak histogramdataene.
3. Juster yderligere indstillinger, herunder reduktion af ringartefakter og strålehærdning til henholdsvis 5 og 20%. Kontroller, at forskydningskompensationen ligger inden for området -7 til 7. Disse værdier kan variere afhængigt af softwaren. Sørg for, at de er verificeret med brugervejledningen og producentens instruktioner, inden du begynder at rekonstruktion.
   BEMÆRK: Artefakter kan minimeres under genopbygning ved hjælp af korrektioner for strålehærdning, ringartefakter og kompensation for forkert justering. Kompensation for forkert justering kan fungere som en indikator for scanningens kvalitet, og hvis den ligger uden for et producentspecificeret interval, skal scanningen gentages. Rekonstruktionsindstillingerne vil dog være softwareafhængige, og brugervejledningen skal konsulteres.

4. μCT-rotation

BEMÆRK: Når scanningerne er rekonstrueret, skal de roteres for at etablere ensartet orientering på tværs af alle knogler og for at sikre, at tværsnit af den resulterende knogle tages normalt til længdeaksen med så lidt forskudt vinkel som muligt. Dette skal gøres med brugerens valgte software.

1. Lårbenets rotation
   1. Drej lårbenet, så alle knogler har samme langsgående orientering. For eksempel orientere alle knogler med den proksimale ende af knoglen øverst på scanningen.
   2. Drej knoglen, så tværsnitsorienteringen af alle knogler er den samme. For eksempel drej knoglerne, så den forreste side altid er på højre side af scanninger.
   3. Når disse justeringer er foretaget, skal du rette scanningen for at sikre, at symmetrien opretholdes omkring den centrale akse.
   4. Gem det roterede datasæt.
2. Tibia rotation
   1. Gentag trin 4.1.1-4.1.4 for skinnebenet.

5. Procedure for mekanisk prøvning

1. Præparation
   1. Før mekanisk test skal du sikre dig, at der er opnået en μCT-scanning med en opløsning på 6-10 μm, som er rekonstrueret for at verificere, at der er opnået en kvalitetsscanning for hver prøve til beregning af tværsnitsgeometri på brudstedet (afsnit 2-3).
   2. Med scanninger opnået og verificeret, optø alle knogler inden testning (afsnit 1) . Test alle knogler fra et eksperiment på samme dag, og randomiser testrækkefølgen for at minimere brugerbias og systemvariabilitet på tværs af prøver og eksperimentelle grupper. Sørg for, at knoglerne forbliver hydreret under hele testprocessen.
2. Opsætning af apparater
   1. Find en vejecelle med passende følsomhed og kapacitet til prøven. Overvej det forventede fejlområde for prøven, og vælg en vejecelle med ca. 50 % større kapacitet, samtidig med at følsomheden maksimeres (f.eks. en 10 lbf-vejecelle med en kapacitet på 45 N for en museknogle i fejlområdet 0-25 N).
   2. Find lastning og understøt spændviddearmaturer.
   3. Installer vejecellen og armaturerne som vist i figur 1 ved at skrue vejecellen fast på enten testerens øverste eller nederste støtte, den øverste påfyldningsarmatur på vejecellen og den nederste armatur på testerens bundstøtte. Sørg for en sikker pasform.
      BEMÆRK: Fastgørelse af vejecellen til det øverste armatur anbefales generelt, når der udføres bøjningstest for at undgå kontakt med væske med vejecellen, men bunden kan bruges, hvis det er nødvendigt.
   4. Når vejecellen og armaturerne er installeret, skal du vælge en længde på støttespændet og sikre, at den forbliver konstant for alle prøver, der testes. For at vælge en afstand til støttespænd skal du først finde den korteste knogle i prøvesættet.
   5. Vend knoglen mellem armaturerne som vist i figur 2.
   6. For trepunktsbøjning af lårbenet, følg figur 2A. Sørg for, at den forreste overflade af knoglen er mod støttespændet, og at spændviddeområdet er inden for prøvens diafyse. Undgå at inkludere den tredje trochanter på den proksimale ende og overgangspunktet, hvor knoglen udvides til metafysen og kondyler i den distale ende.
   7. Ved firepunktsbøjning skal du sørge for, at støtte- og lastspændene er justeret og centreret i forhold til hinanden. Følg figur 2B for at indlæse knoglen i armaturerne.
      1. Indstil støtte- og lastspændlængderne, så de følger et 3:1-forhold⁸ (f.eks. 9 mm støttespændvidde og 3 mm lastspændvidde).
      2. For en skinneben, belastning den mediale overflade af knoglen mod støttespændet med en støtte ved tibia / fibula krydset. Den anden støtte vil sandsynligvis blive placeret lige efter tibialkammen. Sørg for, at belastningsspændvidden, centreret inden for støttespændet, indeholder derefter et ensartet område af knoglen.
   8. Mål støttespændeafstanden, hvis du udfører trepunktsbøjning, og både laste- og støttespændeafstande, hvis du udfører 4-punktsbøjning, og registrer disse afstande. Sørg for, at denne værdi registreres fra midten af lastepunkterne for både belastnings- og støttespændsmålingerne.
   9. Placer knoglen tilbage i saltvand eller rehydrer med en bolus saltvand.
      BEMÆRK: Når du vælger punkter for et belastningsspænd, anbefales det at bruge cirkulære punkter (en radius på 0,75 mm er tilstrækkelig, da den fordeler belastningen, samtidig med at den kommer i kontakt med knoglen ved cirklens tangent). Mens teorien anbefaler en knivsæg til at repræsentere en punktbelastning, vil dette knuse knoglen ved belastningspunktet, hvilket fører til overvurderinger af belastning og undervurdering af modul.
   10. Sørg for, at alle dele af armaturet er stramme og fri for bevægelse.
3. Software opsætning
   1. Sørg for, at testeren er korrekt tilsluttet computeren via modulboksen, vejecellekanaler og andre krav i henhold til systemmanualen.
   2. I softwaren, der er forbundet med den mekaniske tester, skal du oprette en bøjningstestprofil med en rampe, der har en forskydningshastighed , der er langsom nok til ikke at fremkalde viskoelastiske effekter (0,025 mm / s bruges ofte) for at indlæse knoglen til svigt.
   3. En mindste prøvefrekvens på 25 Hz anbefales også, når der oprettes en testprofil, selvom en højere samplingfrekvens foretrækkes.
   4. Opret én mappe pr. studiegruppe, og gem hver prøve som en individuel fil i mappen.
4. Indlæsning og prøvning af prøver
   1. Vælg en korrekt optøet knogle (se trin 1.2). Mål og registrer dens fulde længde med kalibre.
   2. Læg prøven på armaturerne som vist i figur 2A, hvis en lårben testes i trepunktsbøjning, og figur 2B, hvis der testes et skinneben i firepunktsbøjning.
   3. Rediger filnavnet, så det afspejler det eksempel, der testes.
   4. Nulstil belastningen (ikke forskydningen). Tænd for systemets flyttefirma; Sørg for, at det ikke er i belastnings- eller forskydningskontrol.
   5. Brug forsigtighed til at anvende en minimal forbelastning på knoglen for at sikre dens position og hjælpe med at forhindre knoglen i at rulle, men sørg for, at den ikke kompromitterer prøven. Sigt efter en forspænding på ca. 0,25 N. Sørg for, at den ønskede knogleorientering opretholdes, før du fortsætter.
   6. Hydrat prøven ved generøst at overhælde den med saltvand.
   7. Start bøjningstesten ved at vælge Start eller Kør i softwaren. KRITISK: Hold nøje øje med prøven under hele testen, og noter dem, hvor der opstod problemer (f.eks. rulning, glidning).
      BEMÆRK: Disse problemer kan kompromittere data, og noter om disse tests vil være nyttige at konsultere under analysen.
   8. Hold øje med, at knoglen begynder at bryde (på træksiden). De fleste tests fortsætter, indtil der opstår fejl. På dette tidspunkt afsluttes testen via dens programmerede grænser. Hvis der opstår fejl, men testeren fortsætter med at forskyde, skal du manuelt stoppe testen for at forhindre beskadigelse af vejecellen.
   9. Når testen er afsluttet, måles længden fra den distale ende til brudpunktet ved hjælp af kalibre og registrerer den.
   10. Gentag trin 5.4.1 - 5.4.9 for hver prøve.

Figur 1: Opsætning af mekanisk tester. A) Trepunkts- og B-firepunktsbøjningsprøver. Vejecellen vises med gult, lastarmaturerne vises med blåt, og støttearmaturerne vises med grønt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Orientering af knogler mellem armaturer . (A) Korrekt orientering af et lårben i trepunkts bøjningsbelastningsarmaturer, der viser (fra top til bund) udsigt fra den mediale, forreste og bageste side af lårbenet, når den er korrekt placeret. Lastarmaturerne vises med orange, og støttearmaturerne vises med blåt. De nederste spænd skal justeres for at omfatte så meget af den mest lige del af diafysen som muligt, og den øverste armatur skal være centreret mellem disse spænd. (B) Korrekt orientering af skinnebenet til firepunktsbøjning, der viser (fra top til bund) udsigt fra skinnebenets forreste, laterale og mediale sider. Benet skal belastes, så den mediale overflade kommer i kontakt med bundarmaturet, og sidefladen kommer i kontakt med den øverste armatur. Tibia-fibula-krydset skal placeres lige uden for lastespændet. Spændvidderne skal justeres, så de bedst opfylder et forhold mellem belastning og understøtning på 1:3. Klik her for at se en større version af denne figur.

6. Valg af ROI

1. Når pauselængderne er optaget, skal du indlæse de roterede billeder i brugerens valgte software. Når de roterede billeder er indlæst, skal du finde og registrere de øverste og nederste skiver af knoglen.
2. Beregn forskellen mellem de øverste og nederste skiver. Multiplicer denne værdi med scanningsvoxelstørrelsen for at bestemme knoglens samlede længde i mikrometer.
3. For at lokalisere brudstedet i CT-scanningen divideres den registrerede brudlængde (i mikrometer) med voxelstørrelse for at opnå antallet af μCT-skiver fra den distale ende af scanningen til brudpunktet.
4. Vælg et investeringsafkast, centreret på denne placering. Indstil først den samlede ønskede længde af ROI (mindst 100 μm). Find antallet af udsnit, som denne længde repræsenterer, ved at dividere længden i mikrometer med voxelstørrelsen for at bestemme det samlede antal udsnit i ROI.
5. Hvis du vil opnå den nedre grænse for investeringsafkastet, skal du dividere det samlede antal ROI-udsnit med 2 og trække denne værdi fra den tidligere beregnede pauseplacering, der findes i trin 6.4.
6. Føj den samlede længde af investeringsafkastet i udsnit til den tidligere beregnede værdi for at opnå den øvre grænse for investeringsafkastet.
7. Vælg det relevante investeringsafkast baseret på beregnede grænser, og gem det.

7. Normalisering af kraft- og forskydningsdata

BEMÆRK: Den mekaniske tester genererer kun punkter med x- og y-koordinater (forskydning, kraft). Disse punkter kan konverteres til spænding og belastning ved hjælp af Euler-Bernoulli bøjningsspændings- og belastningsligninger, men disse kræver geometriske egenskaber opnået fra μCT-scanninger. Kvantificeringen af disse egenskaber kan udføres med brugerens foretrukne software. Vi foretrækker en brugerdefineret kode, som giver fuld kontrol over alle input, beregninger og output. Som tidligere nævnt skal du kontakte den tilsvarende forfatter direkte for at få adgang til koden eller besøge laboratoriewebstedet på https://bbml.et.iupui.edu/ for mere information. Spændings- og belastningsligningerne samt de nødvendige geometriske egenskaber, der skal opnås fra μCT-scanninger, for at beregne disse diskuteres nedenfor.

1. Trepunkts bøjning normaliseringsligninger
   1. Ligningen, der bruges til at beregne spænding i trepunktsbøjning, er vist nedenfor i ligning 1. I denne ligning repræsenterer "F" kraft og "L" repræsenterer længden af støttespændet. Kraftværdier registreres af den mekaniske tester under testen. Sørg for, at længden af støttespændvidden registreres inden test. "c" og "I" er geometriske egenskaber, der beregnes ved hjælp af μCT-scanninger (afsnit 7.3).
      (1)
   2. Ligningen til beregning af belastning er vist nedenfor i ligning 2; "c" og "L" repræsenterer de samme egenskaber for både stress- og belastningsberegninger. "D" betyder forskydningsværdier registreret af den mekaniske tester under test.
      (2)
2. Firepunkts bøjningsnormaliseringsligninger
   1. Ligningen for spænding i firepunktsbøjning er vist nedenfor i ligning 3. "F" og "I" forbliver de samme variabler, der er beskrevet i trin 7.1.1. Beregn "a" ud fra målingerne af understøtnings- og belastningsspændvidden før prøvning. Hvis det anbefalede forhold på 3:1 for understøtning til lastespænd for firepunktsbøjning følges, vil "a" være en tredjedel af støttespændets længde.
      (3)
   2. Ligningen for belastning i firepunktsbøjning er vist nedenfor i ligning 4. "C" og "A" angiver de samme egenskaber for både stress- og belastningsberegninger. "d" betyder de forskydningsværdier, der registreres af den mekaniske tester under test.
      (4)
3. Beregning af geometriske egenskaber fra μCT-scanninger
   1. Variablen "c" repræsenterer afstanden fra den neutrale akse til overfladen af knoglen, der blev belastet i spænding. Bestem derfor centroiden for hvert tværsnit i μCT-scanningerne, da den neutrale akse passerer gennem centroiden.
      1. Hvis lårbenets prøvningsretning følges i trepunktsbøjning som beskrevet i trin 5.2.6, måles "c" i forhold til den forreste overflade.
      2. Hvis skinnebenets testretning som beskrevet i trin 5.2.7 måles, måles »c« i forhold til knoglens mediale overflade.
   2. Variablen "I" repræsenterer arealmomentet for inerti omkring bøjningsaksen (den mediale-laterale akse for en lårben; den forreste bageste akse for en skinneben). Beregn denne værdi ved hjælp af ligning 5. I denne ligning er "dA" arealet af hver pixel, der er fanget i μCT-scanningen, mens y er den beregnede afstand for hver pixel fra den neutrale akse.
      (5)

8. Mekaniske testegenskaber af interesse

1. Før du beregner mekaniske egenskaber, skal du generere en kraftforskydningskurve og spændingsbelastningskurve (ideelle kurver vist nedenfor i figur 3 sammen med signifikante egenskaber).
   BEMÆRK: Test af biologiske prøver genererer ikke altid kurver, der ligner disse idealiserede eksempler, men de forbliver en nyttig vejledning.
2. Undersøg disse kurver før analyse for at få øje på fejl i testen, såsom en knogle, der ruller eller glider. Disse fejl forårsager typisk bump eller flade områder i den indledende lineære del af kurven. Fjern overskydende data, herunder eventuelle data, der kan være blevet indsamlet, før testeren kontaktede knoglen eller data efter fejl, på dette tidspunkt.
3. Når du er sikret en kvalitetstest af de plottede kurver, skal du begynde at analysere signifikante egenskaber.
   1. Stivhed og elastisk modul
      1. Beregn stivhed ved kun at bruge det elastiske område af kraftforskydningskurven. Kurvens hældning i denne region er stivhed.
      2. Beregn elastisk modul ved kun at bruge hældningen af den elastiske del af spændingsbelastningskurven.
   2. Udbytte
      BEMÆRK: Der er to flydepunkter, et på kraftforskydningskurven og et på spændingsbelastningskurven. (x,y) værdierne for dette punkt fra kraftforskydningskurven er kendt som forskydning til udbytte og flydekraft, mens værdierne fra spændingsbelastningskurven er kendt som belastning til udbytte og flydespænding. Disse punkter repræsenterer slutningen af kurvens elastiske område og kan findes på nedenstående måder.
      1. Spændings-belastningskurvemetode: Beregn en linjeforskydning fra (0,0) med 0,2% belastning (2.000 mikrobelastning), men med samme hældning som det elastiske modul. Plot denne linje på stress-belastningsgrafen; Den position, hvor denne linje opfanger spændingsbelastningskurven, defineres som flydepunktet. Brug denne flydespænding og belastningskoordinat til at finde de analoge kraft- og forskydningsværdier; Disse værdier repræsenterer flydekraft og forskydning til udbytteværdier.
      2. Sekantmetode: Beregn stivhed ud fra kraftforskydningskurven og reducer stivheden med en valgt procentdel (5-10%). Der afbildes en linje, der starter ved (0,0) med hældningen af denne reducerede stivhed, og lad den krydse med kraftforskydningskurven. Skæringspunktet vil have koordinaterne (forskydning for at give, udbyttekraft).
         BEMÆRK: Sekantmetoden kan anvendes til at finde flydepunktet uden spændingsbelastningsdata.
   3. Ultimativ kraft og ultimativ stress
      1. Beregn ultimativ kraft og ultimativ spænding ved at finde den maksimale værdi i de respektive datasæt.
   4. Fortrængnings- og belastningsegenskaber
      1. Forskydning til udbytte og belastning til flydeværdier, der repræsenterer forskydningen eller belastningen til flydepunktet. Du kan finde dem ved at finde udbyttet som beskrevet i trin 8.3.2.
      2. Total forskydning og total belastning værdier repræsenterer den samlede forskydning eller samlede belastning en prøve oplevet under hele testen og svarer til fejlpunktet.
      3. Postyield forskydning og postyield stamme: Postyield forskydning rapporteres almindeligvis og kan beregnes ved at trække forskydning til udbytte fra total forskydning. Beregn postyield belastning ved at trække belastning til udbytte fra total belastning, men rapporter dette med forsigtighed, da belastning først udledes under antagelse af, at materialet er lineært elastisk (preyield). Dette gør en efterbehandlingsforanstaltning modtagelig for ugyldighed.
   5. Energiegenskaber
      1. Beregn energi som arealet under kraftforskydnings- eller spændingsbelastningskurven.
      2. Området under kraftforskydningskurven er kendt som arbejde. Arealet beregnet under præ-udbyttedelen af kurven eller det elastiske område kaldes elastisk arbejde eller energi. Det areal, der beregnes under kurven forbi udbyttepunktet eller plastområdet, er kendt som efterudbytte eller plastarbejde eller tabt energi.
      3. Det beregnede samlede areal under spændingsbelastningskurven er kendt som sejhed eller sejhedsmodul, mens arealet beregnet under spændingsbelastningskurven op til flydepunktet er kendt som modstandsdygtighed. Post-yield sejhed, ligesom post-yield stamme, rapporteres ofte ikke på grund af antagelserne i belastningsligningerne, som denne egenskab ikke falder ind under.

Figur 3: Force-displacement og stress-strain kurver. (A) Ideel kraft-forskydningskurve; (B) ideel spændingsbelastningskurve med linjen afledt af 0,2% offset-metoden, der anvendes til beregning af flydepunktet vist med rødt (bemærk, at denne linje har samme hældning som kurvens elastiske område). Nøgleegenskaber, der kan opnås fra kraftforskydningskurven, inkluderer flydekraft, ultimativ kraft, forskydning til udbytte, total forskydning og arbejde. Vævsniveauegenskaber, der kan opnås fra stress-belastningskurven, inkluderer flydespænding, ultimativ stress, belastning til udbytte, total belastning, modstandsdygtighed og sejhed. Klik her for at se en større version af denne figur.

Representative Results

Efter afslutning af CT-scanning kan de fleste utilstrækkelige scanninger fanges i rekonstruktion. Ofte vil dårlige scanninger have en høj forskydningskompensation, der er en klar indikator for en fejl under scanningen. Der kan dog opstå fejl i andre trin, og det kan også føre til unøjagtige data. Disse fejl kan ofte opdages, når de enkelte beregnede arkitektoniske egenskaber undersøges. Hvis værdier falder langt uden for intervallet for andre i en gruppe, skal scanningen, ROI og metoden til beregning af egenskaberne undersøges igen.

Når bøjningstestene er afsluttet, skal kraftforskydningsplottene fra hver test undersøges for at identificere dårlige test, der muligvis skal fjernes fra datasættet. Et eksempel på en problematisk test er vist i figur 4. Diagrammet i figur 4A viser resultaterne af en korrekt udført bøjningsprøve. Der er et klart lineært område, der mangler en tå med lav hældning, et flydepunkt, et ultimativt punkt (maksimal kraft), et fald i kraft, når forskydningen strækker sig forbi den maksimale kraft og et fejlpunkt. Kurven er jævn uden pludselige ændringer i belastningen, før det endelige punkt er nået. Derfor kan egenskaber fra denne test let identificeres og stole på. Diagrammet vist i figur 4B viser resultatet af en bøjningstest med flere bekymrende træk. De pludselige ændringer i indlæsning og udseendet af flere toppe i plottet er vigtige indikatorer for problemer med denne test. Mens mindre toppe kan forekomme i en ordentlig test nær den ultimative kraft, tyder størrelsen og antallet af toppe i dette plot på, at knoglen kan have rullet under testen. Uanset om prøvedataene observeres og konstateres under testen, eller når testene undersøges før analysen, bør de undersøges under analysen efter testen. Hvis dataene faktisk er defekte eller langt uden for rækkevidden af andre prøver i gruppen, ville det være ideelt ikke at medtage denne test i det endelige datasæt. Dette er en af grundene til korrekt at drive eksperimentet med forudgående effektberegninger. Det kan være muligt kun at rapportere visse egenskaber fra en prøve (i dette tilfælde kan egenskaber med præudbytte være acceptable), men dette er ikke ideelt og bør forklares tydeligt, når det rapporteres.

Figur 4: Force-displacement plots . (A) Ideel kraftforskydningsplot. (B) Force-displacement plot som følge af en dårlig bøjningstest. Klik her for at se en større version af denne figur.

Med alle kraftforskydningsplots undersøgt og værdier normaliseret til stressbelastning, kan egenskaberne af interesse identificeres og fremvises på flere måder. I figur 5 vises resulterende kraftforskydning og stressbelastningsplots for en hel undersøgelse. Disse er skematiske repræsentationer, hvorved kraften og forskydningen ved startpunktet (0,0), udbytte, slutpunkt og svigt for hver knogle bestemmes, og derefter beregnes kraften/spændingen og forskydningen/belastningen i gennemsnit for at give et gennemsnitligt plot for hver gruppe. Plottene bruges ikke til statistisk analyse, men de kan bruges til at vise, hvordan den samlede adfærd varierer på grund af faktorer som en behandling eller sygdomstilstand. Plottene vist i figur 5 er fra en undersøgelse, der sammenligner kontrolmus med dem, der induceres med en tilstand af type 2-diabetes og kronisk nyresygdom (T2D-CKD). De rigtige skinneben af disse dyr blev testet til svigt ved hjælp af firepunktsbøjning og analyseret for at opnå de egenskaber, der er diskuteret i protokolafsnit 8. Fra figur 5 er det klart, at T2D-CKD-gruppen havde reducerede mekaniske egenskaber, herunder styrke og stivhed, på både struktur- og vævsniveau. Disse mus ser også ud til at have reducerede postyield-egenskaber, en indikator for skørhed. Disse observationsområder bør ikke bruges til at drage endelige konklusioner af en undersøgelse. De fungerer snarere som en visuel repræsentation og bør verificeres ved at udføre en statistisk analyse af alle egenskaber af interesse.

Figur 5: Force-displacement og stress-strain plots for en hel undersøgelse . (A) Force-displacement plot for kontroldyr og type 2 diabetes- og kroniske nyresygdomsinducerede dyr. Dette plot resulterede i gennemsnit af flydekraften, forskydning til udbytte, ultimativ kraft, ultimativ forskydning, fejlkraft og total forskydning for hver gruppe og plotning af disse midler sammen med standardafvigelse. B) Belastningsbelastning for kontroldyr og T2D-CKD-dyr. Dette plot var resultatet af gennemsnitlig flydespænding, belastning til udbytte, ultimativ spænding, ultimativ belastning, fejlspænding og total belastning og plotning af de resulterende midler sammen med standardafvigelse. Forkortelse: T2D-CKD = type 2 diabetes- og kronisk nyresygdom-induceret dyr. Klik her for at se en større version af denne figur.

De mekaniske data og resultaterne fra en tosidet t-test er vist i tabel I. Data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse. En generel undersøgelse foreslår data inden for de korrekte intervaller og med forventede variationsniveauer. Bemærk, at egenskaber efter udbytte har tendens til at have den største variation og derfor ofte kræver de største stikprøvestørrelser for at detektere meningsfulde forskelle. Som de skematiske kurver i figur 5 antydede, er der signifikante fald i næsten alle strukturelle og vævsniveau mekaniske egenskaber. Fra disse data kan det konkluderes, at den inducerede sygdomstilstand førte til knogler, der er svagere, mindre stive og mere modtagelige for brud på grund af tab af deformerbarhed og reduceret sejhed. Undersøgelser med mere nuancerede sammenligninger er måske ikke så enkle at fortolke. Et eksempel på dette kan være, hvis der observeres signifikante forbedringer på tværs af mekaniske egenskaber på strukturelt niveau, men ikke mekaniske egenskaber på vævsniveau. I dette tilfælde er de observerede virkninger sandsynligvis drevet af ændringer i knoglens arkitektur (f.eks. øget areal, øget kortikal tykkelse) snarere end forbedringer i knoglekvaliteten på vævsniveau. For eksempel steg knoglearealet på grund af gevinsten af vævet knogle, men vævskvaliteten er faldet, da en uorganiseret vævet knogle nu er til stede snarere end en organiseret lamellær knogle. Dette kan understøttes af μCT-analyse, hvor statistisk signifikante forbedringer i arkitekturen kan observeres. I modsætning hertil kan der være betydelige forbedringer i mekaniske egenskaber på vævsniveau med minimale/ingen forbedringer i mekaniske egenskaber på strukturelt niveau. Denne høje vævskvalitet kan maskere faldgruberne i mindre knogler. Datafortolkning kan blive yderligere indviklet, hvis der observeres ændringer i præudbytteegenskaber, men ikke i postyieldegenskaber eller omvendt. I førstnævnte tilfælde kan en ændring i knoglens evne til at modstå deformation forbedres, mens dens evne til at tolerere skader ikke er det. I hvert af disse tilfælde er evnen til at referere arkitektoniske egenskaber fra μCT-analyse yderst gavnlig og bør udnyttes (selvom beskrivelsen af denne metode ligger uden for rammerne af dette papir). På grund af kompleksiteten af fortolkningen af disse egenskaber giver præsentation af alle egenskaber i tabel- eller figurform (ikke kun de egenskaber, der har tendens til at være de nemmeste at fortolke, såsom ultimativ kraft, eller som fortæller den historie, man søger at fortælle) mulighed for en mere komplet repræsentation af de mekaniske påvirkninger.

			Kontrol	T2D-CKD	P-værdi
Flydespænding (N)			19.7 ± 2.9	15.2 ± 2.6	0.0032**
Ultimativ kraft (N)			22,8 ± 3	17.6 ± 3.4	0.0031**
Forskydning til udbytte (μm)			205 ± 17	190 ± 21	0.1039
Forskydning efter udbytte (μm)			246 ± 235	60 ± 51	0.0435*
Samlet forskydning (μm)			451 ± 230	249 ± 53	0.0278*
Stivhed (N/mm)			110 ± 10	91 ± 13	0.0037**
Arbejde for at give efter (mJ)			2.16 ± 0.45	1,54 ± 0,36	0.0055**
Arbejde efter udbytte (mJ)			4.24 ± 3.01	1.04 ± 0.9	0.0109*
Samlet arbejde (mJ)			6.4 ± 2.88	2,58 ± 0,97	0.0025**
Flydespænding (MPa)			180 ± 20	157 ± 25	0.0504
Ultimativ stress (MPa)			209 ± 26	181 ± 27	0.0434*
Stamme til udbytte (mɛ)			16.8 ± 2	16.4 ± 1.5	0.5771
Samlet belastning (mɛ)			36,6 ± 17,2	21,5 ± 4,3	0.0277*
Modul (GPa)			12.2 ± 1.1	10.9 ± 1.1	0.0171*
Modstandsdygtighed (MPa)			1,62 ± 0,33	1,38 ± 0,33	0.1377
Sejhed (MPa)			4,85 ± 2,29	2,26 ± 0,73	0.0076**

Tabel 1: Resultater af mekanisk prøvning og statistisk analyse. Værdier vist som middelværdi ± standardafvigelse. P-værdier er resultatet af en tosidet uparret t-test. * P < 0,05 og ** P < 0,01. Forkortelse: T2D-CKD = type 2 diabetes- og kronisk nyresygdom-induceret dyr.

Discussion

Gennem hele scannings- og testprocessen er der øjeblikke, hvor fejlfinding og optimering er passende. Den første af disse sker ved scanning af knogler ved hjælp af μCT. Mens mange systemer leveres med en holder, hvor et objekt kan holdes og scannes, kan brugerdefinerede holdere fremstilles til at scanne flere knogler på samme tid. Scanning af flere knogler kan være et glimrende punkt for optimering, men der skal udvises forsigtighed under hele scannings- og analyseprocessen for at sikre, at artefakter ikke induceres. Da røntgenstråler passerer gennem (og svækkes af) varierende mængder knoglevæv ved hvert vinkeltrin, kan dette føre til unøjagtighed i de resulterende data.

Et andet punkt til fejlfinding opstår i genopbygningen af scanninger. Afhængigt af det anvendte program kan brugeren definere densitetsvinduet til genopbygning beregnet ud fra scanningens dæmpningskoefficientværdier. Dette er en lineær koefficient, der bruges til at repræsentere, hvor meget røntgenstrålen dæmpes af et objekt⁵. Nogle programmer opnår disse tætheder og konverterer dem til gråtoneværdier fra 0 til 255 i et histogram. To værdier vil blive vist i et histogram og er kendt som kontrastgrænser¹⁰, som skal indstilles korrekt for at muliggøre genkendelse af knogle versus ikke-knoglevoxels. Den laveste værdi vil normalt blive sat til en gråskalaværdi på nul, mens den højeste kontrastværdi anbefales at blive indstillet til 10-20% af den maksimale dæmpning af det pågældende materiale (knogle)¹⁰. Der kan opstå fejl i analysen, hvis denne værdi ikke er indstillet korrekt, da dele af data kan blive afskåret. Derfor skal denne værdi justeres afhængigt af den prøve, der blev scannet. Den bedste praksis er at se histogrammet på en logaritmisk skala og vælge den øvre grænse som et tal, der er lidt større end enden af den logaritmiske hale for at sikre, at alle knogledata er inkluderet¹⁰.

Yderligere punkter til fejlfinding opstår under mekanisk test og analyse. Under test og visning af kraftforskydningskurver efter testen kan prøver, der rulles, ses og bør fjernes fra datasættet som beskrevet i de repræsentative resultater. Desuden bør der udvises forsigtighed med hensyn til knoglens orientering, da der er antagelser, der styrer formen på den knogle, der testes. Ved anvendelse af Euler-Bernoulli bøjningsligninger til beregning af spænding og belastning antages det, at prøven har et ensartet tværsnit langs længden³. I betragtning af at de fleste knogler ikke har et ensartet tværsnit, er det bedst at vælge det mest ensartede område af knoglen, der skal testes (over hele støttespændet til trepunktsbøjning eller mellem belastningspunkterne til firepunktsbøjning).

I et lårben foretrækkes test i trepunktsbøjning ved mellemakslen. På grund af knoglens blide krumning bør man teste i krumningens retning for at forhindre lokal overfladebøjning (dvs. test af lårbenet med den forreste overflade i spænding). Tibia har en mere variabel tværsnitsform, så den ideelle region til test begynder lige proksimal til krydset mellem tibia og fibula. Hvis knoglen placeres med den mediale overflade i spænding, er det knogleområde, der testes, fladt og har den mindste variation i radius og inertimoment i bøjningsretningen. Der skal også udvises forsigtighed ved fortolkning af resultaterne af bøjningstestene på grund af antagelsen om, at materialet er isotropt, homogent og lineært elastisk - hver af disse antagelser overtrædes til en vis grad ved test af knogle³. Bone's manglende evne til at passe til disse antagelser fører til resultater fra bøjningstest, der skal fortolkes med forsigtighed. De egenskaber, der skal fortolkes mest omhyggeligt, er dem, der stammer fra spændingsbelastningskurven forbi flydepunktet, da passerende udbytte pr. definition overtræder den lineære elastiske antagelse. Mens normalisering til knoglens form kan gøres, anbefales det ikke at forsøge at normalisere til dyrs kropsvægt, medmindre der er store forskelle på tværs af grupper. I dette tilfælde kan en analyse af kovarians udføres for at kompensere for disse forskelle, men generel normalisering til kropsvægt bør undgås i de fleste tilfælde.

På trods af de fejlfindingsproblemer, der kan opstå under hele denne proces, giver bøjningstest mekaniske egenskaber, der kan beskrive en knogles modtagelighed for brud. Disse tests er også relativt enkle og hurtige at udføre. Selvom absolutte værdier fra disse tests måske ikke altid er helt gyldige, kan det være ret nøjagtigt at kunne detektere relative forskelle mellem grupper for prøver af forskellige størrelser og former. De opnåede mekaniske egenskaber giver funktionel relevans i undersøgelser, hvor forskelle i knogle kan forventes. Selvom monotone fejltest er den mest almindelige og let tilgængelige mekaniske test, kan andre metoder, herunder træthedslevetid og brudsejhed, afsløre yderligere mekaniske egenskaber af interesse og kunne overvejes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAn	Bruker	NA	CT Scan Analysis Software
DataViewer	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Coding platform used for data analysis
NRecon	Bruker	NA	CT Scan Reconstruction software
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software	Micro Photonics Inc	SKY-016814	Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object