设计、执行和解释涉及啮齿动物骨骼全骨弯曲试验的研究的实际考虑因素

Summary

啮齿动物骨骼的机械测试是提取有关骨骼对骨折的易感性信息的宝贵方法。由于缺乏适当的实践理解，结果可能会被过度解释或缺乏有效性。该协议将作为指南，以确保准确执行机械测试以提供有效和功能数据。

Abstract

导致骨折的骨骼脆性是美国的公共卫生危机，每年导致 150 万例骨折和 180 亿美元的直接护理费用。了解骨病的潜在机制和对治疗的反应的能力不仅是需要的，而且是至关重要的。骨骼的力学测试是了解和量化骨骼对骨折的易感性的宝贵技术。虽然这种方法看起来很容易执行，但如果用户忽略管理假设和关键步骤，可能会得出不适当和不准确的结论。随着研究继续发表，滥用方法和对结果的错误解释，跨学科都观察到了这一点。该协议将作为与机械测试相关的原理以及这些技术应用的入门书 - 从考虑样本量到组织收获和储存，再到数据分析和解释。有了这些，就可以获得有关骨骼骨折易感性的宝贵信息，从而进一步了解学术研究和临床解决方案。

Introduction

骨骼的机械测试是提取与骨骼骨折易感性相关的功能信息的主要方法。在临床前研究中，可以使用几种测试方式，但到目前为止，最常见的是长骨的弯曲。这些测试易于执行，可用于从人类到小鼠大小不等的骨骼。由于小鼠是临床前研究中最常研究的动物之一，因此该协议将侧重于对小鼠的股骨和胫骨进行的弯曲测试。

在进行弯曲测试之前，必须正确采集和储存骨头。传统上，最常见的储存方法是在盐水浸泡的纱布中冷冻骨头，单独在盐水中冷冻，或在乙醇中脱水骨头 ¹。与冷冻储存的骨头相比，储存在乙醇中的骨头已被证明具有更高的刚度和弹性模量，并降低了变形参数¹。即使在测试前对骨骼进行补水也无法将这些特性恢复到正常水平 ¹.浸没在盐水中储存可能会对骨骼造成损伤，因为随着盐水的膨胀而施加压力。此外，需要完全解冻溶液才能取出骨头进行显微计算机断层扫描 （μCT） 扫描。因此，将新鲜收获的骨头冷冻在盐水浸泡的纱布中已成为标准储存方法，并在整个协议中推荐。

由于骨骼的大小和形状会影响其体积强度，并且许多疾病模型会显着改变骨骼的大小和形态，因此使用工程原理来规范化大小的影响，以产生估计组织行为的属性².这种方法需要故障位置的横截面几何形状，最常使用μCT获取，以便在测试之前对骨骼进行扫描。μCT因其可用性和高图像分辨率而被广泛使用。此外，不包括软组织的贡献，扫描不需要对骨骼进行化学固定或其他修饰 ^3,4。在所有形式的 CT 中，X 射线源聚焦在物体上，而物体另一侧的探测器测量产生的 X 射线能量。这会产生样品的 X 射线阴影，可以转换为图像 ^3,5。被扫描的物体被旋转（或X射线源和探测器围绕样品旋转），产生图像，这些图像可以重建为代表该物体^的三维数据集5。

扫描分辨率，即两个物体可以单独分辨的距离，以及仍然单独分辨的距离，是通过更改标称体素大小或生成图像中像素的大小来控制的。人们普遍认为，物体的大小必须至少是单个体素的两倍才能被识别³，但更高的比率将允许提高精度。此外，较大的体素更容易产生部分体积效应：当单个体素包含不同密度的组织时，它被分配了这些密度的平均值，而不是单个组织的特定密度，这可能导致高估或低估组织面积和矿物质密度³.虽然这些问题可以通过选择较小的体素尺寸来缓解，但使用更高的分辨率并不能确保消除部分体积效应，并且可能需要更长的扫描时间³.当体外扫描骨骼时，通常建议使用6-10μm的 体素大小，以准确评估小鼠骨骼的小梁结构。皮质骨可以使用较大的 10-17 μm 体素尺寸，但应使用最小的合理体素尺寸。该协议使用 10 μm 体素尺寸，该尺寸足够小，可以区分关键的小梁特性，并在没有大量扫描时间的情况下最大限度地减少部分体积效应。

还必须仔细选择 X 射线能量和能量滤光片设置，因为骨组织的高矿物质密度和厚度会大大衰减和改变透射的 X 射线能量谱。通常认为，由于发射的X射线光谱等同于离开物体⁶的光谱，因此在致密物体（如骨骼）上使用低能X射线会导致称为光束硬化⁷的伪影。扫描骨骼样本时，建议使用 50-70 kVp 的更高电压，以减少这些伪影的发生率⁵.此外，插入铝或铜能量滤波器可产生更集中的能量束，进一步减少伪影 ^4,7。在整个协议中将使用 0.5 毫米铝过滤器。

最后，扫描旋转步长和旋转长度（例如，180°-360°）共同控制捕获的图像数量，这决定了^{最终扫描中的}噪声量4。在每个步骤中对多个帧进行平均可以减少噪声，但可能会增加扫描时间⁴.该协议使用 0.7 度的旋转步长和 2 的帧平均值。

关于扫描的最后一点：羟基磷灰石校准模型应使用与实验骨骼相同的扫描设置进行扫描，以便将衰减系数转换为以 g/cm³⁵ 为单位的矿物密度。该协议使用0.25 g / cm 3和0.75g / cm³的羟基磷灰石的模型，尽管可以使用不同的模型。请注意，某些扫描系统使用内部模型作为日常系统校准的一部分。

扫描完成后，通常使用制造商随附的软件，将角度投影重建为物体的横截面图像。无论使用哪种系统，重要的是要确保在重建中捕获整个骨骼，并适当设置阈值以允许识别骨骼与非骨骼。重建后，必须再次使用制造商的软件，在三维空间中旋转所有扫描，以便骨骼的方向一致并与横轴正确对齐。

旋转后，可以根据是否需要皮质特性、小梁特性或断裂几何形状来选择用于分析的感兴趣区域 （ROI） 进行机械归一化。对于后者，应在测试后通过测量从骨折部位到骨骼一端的距离并使用体素大小来确定扫描文件中相应的切片位置来选择 ROI。所选区域的长度应至少为 100 μm，断裂点位于 ROI 的近似中心，以提供充分的估计⁴。

选择 ROI 后，机械归一化需要两个属性（用于计算弯曲应力和应变）：从中性弯曲轴到开始失效的表面的最大距离（假设是受拉加载的表面，由测试设置确定）和围绕中性轴的惯性矩（也取决于测试设置）。此协议建议使用自定义代码来确定这些值。如需访问代码，请直接联系通讯作者或访问实验室网站 https://bbml.et.iupui.edu/ 了解更多信息。

μCT扫描完成后，即可开始机械测试。弯曲测试可以在四点或三点配置中进行。四点弯曲测试是首选，因为它们消除了加载点之间骨骼中的剪切应力，允许在该区域发生纯弯曲³.然后，骨头会因张力而断裂，从而产生更能代表骨头真实弯曲特性的故障³.然而，骨头的加载方式必须能够在两个加载点提供相同的负载（这可以通过旋转加载头来促进）。在三点弯曲试验中，荷载点与骨骼相交处的剪切应力变化很大，这导致骨骼此时因剪切而不是张力而断裂³.ASTM标准建议进行弯曲的材料应具有16：1的长宽比，这意味着支撑跨度的长度应比骨的宽度大16倍，以尽量减少剪切的影响^8,9。在测试小型啮齿动物骨骼时，这通常是不可能的，因此只需将加载跨度做得尽可能大，但横截面形状的变化尽可能小。而且，在进行四点弯曲时，下跨和上跨长度的比例应为~3：1⁸，这在胫骨中通常可以达到，但在较短的股骨中则很难。此外，股骨皮质壁较薄，使其容易受到环形变形的影响，从而在测试过程中改变骨横截面的形状（这在四点测试中可以强调，因为与三点弯曲相比，需要更大的力来诱导相同的弯矩）。因此，在整个协议中，三点弯曲将用于小鼠股骨，而四点弯曲将用于胫骨。

最后，重要的是要为统计分析的研究提供适当的动力。机械测试的一般建议是每个实验组的样本量为 10-12 块骨头，以便能够检测差异，因为某些机械性能，尤其是后屈服参数，可能变化很大。在某些情况下，这可能意味着考虑到研究期间可能发生的损耗，从更高的动物样本量开始。在尝试研究之前，应使用现有数据完成样本量分析。

有许多限制和假设，但弯曲测试可以提供相当准确的结果，特别是当组之间的相对差异是感兴趣的时。这些特性，加上对小梁结构和皮质形态的分析，可以更好地了解疾病状态和治疗方案。如果仔细处理我们控制的实验方面（例如，收获、储存、扫描和测试），我们可以确信已经产生了准确的结果。

Protocol

本协议中描述的涉及动物的所有程序均已在程序之前获得印第安纳大学科学学院机构动物和使用委员会 （IACUC） 的批准。该程序中描述的动物通过吸入 CO₂进行安乐死，然后进行颈椎脱位作为安乐死的次要手段。

1. 骨头的收获、储存和解冻

1. 收获和储存
   1. 将鼠标腹侧朝上放置。使用手术刀（或剃须刀片或剪刀）在一侧股骨和骨盆的近似交界处切开一个切口。
   2. 继续向背侧进行初始切口，直到找到髋关节;寻找股骨头，它看起来像一个附着在骨盆上的白色小球体。
   3. 用手术刀的边缘对股骨头的近端边缘施加压力，直到股骨头从窝中弹出。切除额外的组织，将后肢从胴体的其余部分中解放出来。
   4. 在隔离后肢的情况下，通过诱导膝关节屈曲来分离胫骨和股骨。在膝盖前表面沿内侧-外侧方向移动手术刀，切开任何相邻组织，包括骨骼之间的韧带。
   5. 如果这不能分离骨骼，请伸展膝关节以允许进入后表面。注意避免割伤骨头或刮伤关节软骨。
   6. 股骨和胫骨分离后，通过弯曲关节并在关节后表面使用内侧-外侧锯切运动将后足从胫骨上移开。如有必要，伸展关节以暴露前表面。小心避免割伤骨头。
   7. 分离后，清洁所有粘附软组织的骨骼。如果对胫骨进行四点弯曲测试，也要切除腓骨。腓骨在近端由韧带连接，但在骨远端附近与胫骨融合。在连接点附近使用锋利的剪刀分离腓骨。
   8. 将分离和清洁的骨头分别包裹在盐水浸泡的纱布中，并储存在-20°C。 收获后立即执行此操作。
   9. 对胴体的另一侧重复步骤 1.1.1 到 1.1.8。
      注意：如果在步骤 1.1.4-1.1.6 中尝试分离骨头时有阻力，最好重复这些步骤，而不是试图将骨头拉开。用力运动可能导致骨骼损伤或骨折。
2. 解冻
   注意：应尽量减少骨骼经历的冻融循环次数，因为过度的冻融循环会对骨骼的机械性能产生不利影响。μCT扫描的部分解冻可以通过将骨在室温下放置5-10分钟来实现。仅在进行如下所述的弯曲测试时完全解冻骨头。
   1. 过夜解冻首选
      1. 将骨头从-20°C储存移至1-4°C，置于冷藏室或冰箱中。在测试之前，确保骨头在那里停留 8-12 小时以完全解冻。
   2. 快速解冻
      1. 将浴槽温度设置为约37°C。 达到这个温度后，将骨头加入浴中。
      2. 将骨头留在浴中约1小时。

2. μCT扫描

1. 扫描前将骨头包裹在封口膜中以保持水分。在等待扫描时将所有其他骨头放在冰上。
2. 用封口膜包裹后，将骨头放入支架中以与扫描仪连接。确保所有扫描的骨骼都以相同的方向对齐，因为一致的对齐将简化稍后分析的旋转。
3. 根据扫描的应用调整扫描设置。建议对小鼠骨骼进行以下常规扫描设置：分辨率/体素大小：10 μm;像素大小：中等，2000 x 1048;滤光片：0.5毫米铝制;旋转步长：0.7;平均帧数：2。
   注意： 这些设置可能因用于扫描的系统而异，应根据需要查阅制造商和用户手册。
4. X射线源打开后，执行平场校正以最大程度地减少伪影。为此，首先，确保腔室是空的并关闭平坦的场地。
5. 测量场的平均强度并将其调整为 60%。达到 60% 后，更新平坦区域并重新打开。
6. 确保现在的平均强度为 （86-88%）。
   注： 此过程可能因所使用的 μCT 系统而异。在尝试该过程之前，请查阅用户手册。
7. 成功进行平场校正后，将支架放入腔室中。在将底座放入腔室之前，确保样品居中且水平。
8. 固定基座后，关闭腔室，确保在扫描中捕获整个骨头（可能需要侦察视图），然后开始扫描。
9. 扫描后，将骨头重新储存在-20°C的盐水浸泡的纱布中。

3. μCT重建

1. 选择一个 ROI，以捕获重建中的整个骨骼。为此，请查看骨骼的最大横截面，并根据该横截面确定 ROI 的大小。
2. 设置软件的阈值，以便与非骨骼相比正确识别骨骼。为此，请使用直方图，其中下限约束设置为 0，上限约束设置在峰值直方图数据的末尾。
3. 将其他设置（包括环形伪影减少和光束硬化）分别调整为 5% 和 20%。检查错位补偿是否在 -7 到 7 的范围内。这些值可能因软件而异。在开始重建之前，请确保它们已通过用户手册和基于制造商的说明进行验证。
   注意：在重建过程中，使用光束硬化、环形伪影和错位补偿的校正，可以最大限度地减少伪影。错位补偿可以作为扫描质量的指标，如果超出制造商指定的范围，则必须重复扫描。但是，重建设置将取决于软件，应查阅用户手册。

4. μCT旋转

注意：重建后，必须旋转扫描以在所有骨骼上建立一致的方向，并确保所得骨骼的横截面垂直于纵轴，偏移角度尽可能小。这应该使用用户选择的软件来完成。

1. 股骨旋转
   1. 旋转股骨，使所有骨骼具有相同的纵向方向。例如，将所有骨骼定向，使骨骼的近端位于扫描顶部。
   2. 旋转骨骼，使所有骨骼的横截面方向相同。例如，旋转骨骼，使前侧始终位于扫描的右侧。
   3. 完成这些调整后，拉直扫描以确保围绕中心轴保持对称性。
   4. 保存旋转的数据集。
2. 胫骨旋转
   1. 对胫骨重复步骤 4.1.1-4.1.4。

5.机械测试程序

1. 制备
   1. 在进行机械测试之前，请确保已获得 6-10 μm 分辨率的 μCT 扫描并重建，以验证已为每个样品获取质量扫描，以计算断裂部位的横截面几何形状（第 2-3 节）。
   2. 获得并验证扫描后，在测试前解冻所有骨头（第 1 部分）。在同一天测试一个实验的所有骨骼，并随机化测试顺序，以最大程度地减少样本和实验组之间的用户偏差和系统变异性。确保骨骼在整个测试过程中保持水分。
2. 设备设置
   1. 为试样找到具有适当灵敏度和容量的称重传感器。考虑试样的预期失效范围，并选择容量增加约 50% 的称重传感器，同时最大限度地提高灵敏度（例如，对于 0-25 N 失效范围内的小鼠骨骼，容量为 45 N 的 10 lbf 称重传感器）。
   2. 定位荷载和支护跨度夹具。
   3. 如 图 1 所示安装称重传感器和夹具，方法是将称重传感器拧到测试仪的顶部或底部支架上，将顶部加载夹具拧到称重传感器上，将底部夹具拧到测试仪的底部支架上。确保牢固贴合。
      注意： 在进行弯曲测试时，通常建议将称重传感器连接到顶部夹具上，以避免流体与称重传感器接触，但如有必要，可以使用底部。
   4. 安装称重传感器和夹具后，选择支撑跨度长度，并确保所有被测样品的跨度长度保持不变。要选择支撑跨度距离，首先，找到样品组中最短的骨骼。
   5. 如 图 2 所示，在固定装置之间定位骨骼。
   6. 对于股骨的三点弯曲，请参见 图2A。确保骨骼的前表面靠在支撑跨度上，并且跨度区域位于样品的骨干内。避免包括近端的第三转子和骨拓宽到干骺端和远端髁突的过渡点。
   7. 对于四点弯曲，请确保支座和荷载跨度彼此对齐并居中。按照 图 2B 将骨头装入固定装置中。
      1. 将支撑和加载跨度长度设置为遵循 3：1 的比例⁸（例如，9 mm 支撑跨度和 3 mm 加载跨度）。
      2. 对于胫骨，在胫骨/腓骨交界处用一个支撑将骨的内侧表面靠在支撑跨度上。另一个支撑可能位于胫骨嵴之后。确保加载跨度在支撑跨度内居中，然后包含骨骼的均匀区域。
   8. 如果执行三点折弯，则测量支座跨度距离，如果执行 4 点折弯，则测量荷载和支座跨度距离，并记录这些距离。确保从荷载点的中心记录此值，以进行荷载和支护跨度测量。
   9. 将骨头放回生理盐水中或用生理盐水补充水分。
      注意：在为荷载跨度选择点时，建议使用圆形点（0.75 毫米半径就足够了，因为它在分布荷载的同时也接触圆的切线处的骨骼）。虽然理论建议用刀刃来表示点载荷，但这会在施加载荷时压碎骨骼，导致高估应变和低估模量。
   10. 确保夹具的所有部件都紧密且无移动。
3. 软件设置
   1. 确保测试仪通过模块盒、称重传感器通道和系统手册中的任何其他要求正确连接到计算机。
   2. 在与机械测试仪相关的软件中，创建一个弯曲测试轮廓，其斜坡的 位移速率 足够慢，不会引起粘弹性效应（通常使用 0.025 mm/s ）来加载骨骼。
   3. 在创建测试配置文件时，还建议使用25 Hz的最小采样频率，但最好使用更高的采样率。
   4. 为每个学习组创建一个文件夹，并将每个测试另存为该文件夹中的单个文件。
4. 加载和测试样品
   1. 选择正确解冻的骨头（参见步骤 1.2）。用卡尺测量并记录其全长。
   2. 如果在三点弯曲中测试股骨，则将样品加载到固定装置上，如图 2A 所示，如果在四点弯曲中测试胫骨，则将样品加载到图 2B 上。
   3. 更改文件名以反映正在测试的样品。
   4. 将载荷归零（而不是位移）。打开系统的动子;确保它不在负载或位移控制中。
   5. 谨慎使用，对骨头施加最小的预紧力以确保其位置并帮助防止骨头滚动，但确保它不会损害样品。目标是大约 0.25 N 的预紧力。在继续之前，确保保持所需的骨骼方向。
   6. 用生理盐水大量浸泡样品，使样品水合。
   7. 通过在软件中选择“开始”或“运行”来开始弯曲测试。关键：在整个测试过程中仔细观察样品，并注意发生任何问题（例如滚动、打滑）的测试。
      注意：这些问题可能会损害数据，有关这些测试的注释将有助于在分析过程中查阅。
   8. 注意骨头是否开始断裂（在拉伸侧）。大多数测试将继续进行，直到发生故障。此时，测试将通过其编程限制终止。如果发生故障但测试仪继续位移，请手动停止测试以防止损坏称重传感器。
   9. 测试完成后，使用卡尺测量从远端到断点的长度并记录下来。
   10. 对每个样品重复步骤 5.4.1 – 5.4.9。

图 1：机械测试仪设置。 （A） 三点和 （B） 四点弯曲试验。称重传感器以黄色显示，加载夹具以蓝色显示，支撑夹具以绿色显示。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2：固定装置之间的骨骼方向 。 （A） 在正确定位时，从股骨内侧、前侧和后侧显示（从上到下）股骨内侧、前侧和后侧的股骨的正确方向。装载夹具以橙色显示，支撑夹具以蓝色显示。应调整底部跨度，以尽可能多地包括骨干最直的部分，并且顶部夹具应在这些跨度之间居中。（B） 胫骨的正确方向，用于四点弯曲，从胫骨的前侧、侧侧和内侧显示（从上到下）视图。骨的加载应使内侧表面与底部夹具接触，外侧表面与顶部夹具接触。胫腓骨交界处应放置在负荷跨度的正外。应调整跨度，以最好地满足 1：3 的荷载与支撑跨度比。 请点击这里查看此图的较大版本.

6. ROI选择

1. 记录断裂长度后，将旋转的图像加载到用户选择的软件中。加载旋转图像后，找到并记录骨骼的顶部和底部切片。
2. 计算顶部和底部切片之间的差值。将此值乘以扫描体素大小，以确定骨骼的总长度（以微米为单位）。
3. 要在 CT 扫描中定位骨折位置，请将记录的断裂长度（以微米为单位）除以体素大小，以获得从扫描远端到断点的 μCT 切片数。
4. 选择以此位置为中心的 ROI。首先，设置所需的 ROI 总长度（至少 100 μm）。通过将长度（以微米为单位）除以体素大小来确定 ROI 中的切片总数，从而找到此长度所代表的切片数。
5. 要获得 ROI 的下限，请将 ROI 切片的总数除以 2，然后从步骤 6.4 中先前计算的中断位置中减去此值。
6. 将 ROI 的总长度（以切片为单位）与先前计算的值相加，得到 ROI 的上限。
7. 根据计算的边界选择适当的 ROI，然后保存。

7. 力和位移数据的归一化

注意： 机械测试仪只会生成具有 x 和 y 坐标（位移、力）的点。这些点可以使用欧拉-伯努利弯曲应力和应变方程转换为应力和应变，但这些需要从μCT扫描中获得的几何特性。这些特性的量化可以使用用户首选的软件进行。我们更喜欢自定义代码，它可以完全控制所有输入、计算和输出。如前所述，要访问代码，请直接联系通讯作者或访问实验室网站 https://bbml.et.iupui.edu/ 了解更多信息。下面将讨论应力和应变方程，以及必须从μCT扫描中获得的必要几何属性，以计算这些属性。

1. 三点弯曲归一化方程
   1. 用于计算三点弯曲应力的公式如下 式 1 所示。在这个方程中，“F”代表力，“L”代表支撑跨度的长度。力值由机械测试仪在测试过程中记录。确保在测试之前记录支撑跨度的长度。“c”和“I”是将使用 μCT 扫描计算的几何属性（第 7.3 节）。
      （1）
   2. 计算应变的公式如下 式 2 所示;“c”和“L”表示应力和应变计算的相同属性。“d”表示机械测试仪在测试过程中记录的位移值。
      （二）
2. 四点弯曲归一化方程
   1. 四点弯曲中的应力方程如下 式 3 所示。“F”和“I”仍然是步骤7.1.1中讨论的相同变量。在测试之前，根据支撑和载荷跨度的测量值计算“a”。如果遵循推荐的 3：1 的四点弯曲支座与荷载跨度的比例，则“a”将是支座跨度长度的三分之一。
      （3）
   2. 四点弯曲中的应变方程如下 式 4 所示。“c”和“a”表示应力和应变计算的相同属性。“d”表示机械测试仪在测试过程中记录的位移值。
      （4）
3. 从μCT扫描中计算几何属性
   1. 变量“c”表示从中性轴到受拉力加载的骨骼表面的距离。因此，在μCT扫描中确定每个横截面的质心，因为中性轴穿过质心。
      1. 如果遵循步骤 5.2.6 中描述的股骨三点弯曲的测试方向，则相对于前表面测量“c”。
      2. 如果按照步骤 5.2.7 中描述的胫骨测试方向，则相对于骨骼的内侧表面测量“c”。
   2. 变量“I”表示围绕弯曲轴（股骨的内外侧轴;胫骨的前后轴）的惯性矩面积。使用 公式 5 计算此值。在这个方程中，“dA”是μCT扫描中捕获的每个像素的面积，而y是计算出的每个像素到中性轴的距离。
      （5）

8. 感兴趣的机械测试性能

1. 在计算任何机械性能之前，请生成力-位移曲线和应力-应变曲线（理想曲线如下 图 3 所示，以及重要性能）。
   注意：生物样品的测试并不总是产生看起来像这些理想化示例的曲线，但它们仍然是一个有用的指南。
2. 在分析之前检查这些曲线，以发现测试中的错误，例如骨头滚动或滑动。这些误差通常会导致曲线的初始线性部分出现凸起或平坦区域。此时，删除多余的数据，包括在测试人员接触骨骼之前可能收集的任何数据或故障后的数据。
3. 一旦通过绘制的曲线确保了质量测试，就开始分析重要特性。
   1. 刚度和弹性模量
      1. 仅使用力-位移曲线的弹性区域计算刚度。该区域曲线的斜率是刚度。
      2. 仅使用应力-应变曲线的弹性部分的斜率计算弹性模量。
   2. 屈服点
      注：有两个屈服点，一个在力-位移曲线上，一个在应力-应变曲线上。力-位移曲线中该点的 （x，y） 值称为屈服位移和屈服力，而应力-应变曲线中的值称为屈服应变和屈服应力。这些点表示曲线弹性区域的末端，可以通过下面列出的方式找到。
      1. 应力-应变曲线法：计算与 （0,0） 相差 0.2% 应变（2,000 微应变）但斜率与弹性模量相同的线偏移。在应力-应变图上绘制这条线;这条线截取应力-应变曲线的位置定义为屈服点。使用此屈服应力和应变坐标来求相似的力和位移值;这些值将表示屈服力和屈服值的位移。
      2. 正割法：根据力-位移曲线计算刚度，并将刚度降低选定的百分比 （5-10%）。绘制一条从 （0,0） 开始的线，其斜率为该刚度降低的斜率，并允许它与力-位移曲线相交。交点将具有坐标（屈服位移、屈服力）。
         注： 正割法可用于在没有应力-应变数据的情况下找到屈服点。
   3. 极限力和极限应力
      1. 通过在各自的数据集中找到最大值来计算极限力和极限应力。
   4. 位移和应变特性
      1. 屈服位移和屈服屈服的应变值表示屈服点的位移或应变。要找到它们，请按照步骤 8.3.2 中的说明找到产量。
      2. 总位移和总应变值表示样品在整个测试过程中经历的总位移或总应变，对应于失效点。
      3. 屈服后位移和屈服后应变：通常报告屈服后位移，可以通过从总位移中减去位移来计算屈服。通过从总应变中减去应变到屈服来计算屈服后应变，但要谨慎报告，因为应变最初是在材料具有线性弹性（预屈服）的假设下得出的。这使得后收益措施容易失效。
   5. 能量特性
      1. 将能量计算为力-位移或应力-应变曲线下的面积。
      2. 力-位移曲线下的面积称为功。在曲线的预屈服部分下计算的面积或弹性区域称为弹性功或能量。在曲线下计算出的超过屈服点或塑性区域的面积称为屈服后功或塑性功，或能量损失。
      3. 应力-应变曲线下计算的总面积称为韧性或韧性模量，而在应力-应变曲线下计算的直至屈服点的面积称为回弹性。屈服后韧性，如屈服后应变，由于应变方程的假设，通常不报告该特性不属于该属性。

图3：力-位移和应力-应变曲线。 （A）理想力-位移曲线;（B）理想应力-应变曲线，该线来自0.2%偏移法，用于计算屈服点，以红色显示（请注意，该线与曲线弹性区域的斜率相同）。从力-位移曲线可以获得的关键属性包括屈服力、极限力、屈服位移、总位移和功。从应力-应变曲线可以获得的组织水平特性包括屈服应力、极限应力、屈服应变、总应变、回弹性和韧性。请点击这里查看此图的较大版本.

Representative Results

完成 CT 扫描后，大多数不充分的扫描都可以在重建中被发现。通常，糟糕的扫描将具有较高的错位补偿，这是扫描过程中错误的明确指示。但是，其他步骤中可能会出现错误，也可能导致数据不准确。在检查各个计算的体系结构属性时，通常可以发现这些错误。如果值远远超出组中其他值的范围，则应重新检查扫描、ROI 和计算属性的方法。

弯曲测试完成后，应检查每个测试的力-位移图，以确定可能需要从数据集中删除的不良测试。 图 4 显示了一个有问题的测试示例。图 4A中的图 显示了正确执行的弯曲测试的结果。有一个清晰的线性区域，缺少低坡度前束、屈服点、极限点（最大力）、位移超过最大力时的力下降和失效点。曲线是平滑的，在到达最终点之前，载荷不会突然变化。因此，该测试的属性可以很容易地识别和信任。图 4B 所示的图显示了具有多个相关特征的弯曲测试结果。加载量的突然变化和图中多个峰值的出现是该测试存在问题的主要指标。虽然在接近极限力的适当测试中可能会出现小峰值，但该图中峰值的大小和数量表明骨骼可能在测试期间滚动。无论是在测试期间还是在分析前检查测试时观察和记录，都应在测试后分析期间调查样品数据。如果数据确实有问题或远远超出了组中其他样本的范围，则最好不要将此测试包含在最终数据集中。这是通过 先验 功效计算为实验提供正确动力的原因之一。也许可以只报告样品中的某些属性（在这种情况下，预产属性可能是可以接受的），但这并不理想，在报告时应清楚地解释。

图 4：力-位移图。 （A） 理想力-位移图。（B） 弯曲试验不良导致的力-位移图。请点击这里查看此图的较大版本.

通过检查所有力-位移图并将值归一化为应力-应变，可以通过多种方式识别和展示感兴趣的属性。 在图 5 中，显示了整个研究的结果力-位移和应力-应变图。这些是示意图表示，其中确定每个骨骼的起点 （0,0）、屈服、最终点和失效处的力和位移，然后对力/应力和位移/应变进行平均，以提供每组的平均图。这些图不用于统计分析，但它们可用于展示整体行为如何因治疗或疾病状态等因素而变化。图 5 中显示的 图来自一项研究，该研究将对照小鼠与诱导为 2 型糖尿病和慢性肾脏病 （T2D-CKD） 状态的小鼠进行比较。使用四点弯曲测试这些动物的右胫骨是否失效，并进行分析以获得协议第 8 节中讨论的特性。从 图5中可以清楚地看出，T2D-CKD组在结构和组织水平上的机械性能（包括强度和刚度）都降低了。这些小鼠似乎还具有降低的后屈服特性，这是脆性的指标。这些图不应用于从研究中得出明确的结论。相反，它们充当视觉表示，应通过对所有感兴趣的属性进行统计分析来验证。

图 5：整个研究的力-位移和应力-应变图。 （A） 对照动物和 2 型糖尿病和慢性肾病诱导动物的力-位移图。该图的结果是将每组的屈服力、屈服位移、极限力、极限位移、破坏力和总位移平均值，并将这些均值与标准偏差一起绘制。（B） 对照动物和 T2D-CKD 动物的应激应变。该图由平均屈服应力、应变屈服比、极限应力、极限应变、破坏应力和总应变得出，并绘制了结果均值和标准偏差。缩写：T2D-CKD = 2 型糖尿病和慢性肾病诱发的动物。请点击这里查看此图的较大版本.

双尾 t检验的力学数据和结果如 表I所示。数据以平均值±标准差表示。一般检查建议数据在适当的范围内，并具有预期的变异水平。请注意，后产量特性往往具有最大的变化，因此通常需要最大的样本量来检测有意义的差异。如 图5所示，几乎所有结构和组织水平的机械性能都显著降低。从这些数据中可以得出结论，诱发的疾病状态导致骨骼更弱、更不硬，并且由于变形性和韧性降低而更容易骨折。具有更细致比较的研究可能不那么容易解释。例如，如果观察到结构水平的机械性能显着改善，但没有观察到组织水平的机械性能。在这种情况下，观察到的影响可能是由骨骼结构的变化（例如，面积增加、皮质厚度增加）驱动的，而不是组织水平骨质量的改善。例如，由于编织骨的增加，骨面积增加，但组织质量下降，因为现在存在无组织的编织骨而不是有组织的层状骨。这可以通过μCT分析来支持，在μCT分析中可以观察到结构的统计学显着改进。相比之下，组织水平的机械性能可能会有显着改善，而结构水平的机械性能改善很小/没有改善。这种高组织质量可以掩盖较小骨骼的缺陷。如果在产量前属性中观察到变化，但在产量后属性中没有观察到变化， 反之亦然，则数据解释可能会变得更加复杂。在前一种情况下，骨骼抵抗变形的能力可能会发生变化，而其耐受损伤的能力则不会。在每一种情况下，从μCT分析中引用结构属性的能力都是非常有益的，应该加以利用（尽管描述该方法超出了本文的范围）。由于这些属性的解释很复杂，以表格或图形形式呈现所有属性（而不仅仅是那些最容易解释的属性，例如极限力，或者讲述人们想要讲述的故事）可以更完整地表示机械冲击。

			控制	T2D-CKD型	P值
屈服力 （N）			19.7 ± 2.9	15.2 ± 2.6	0.0032**
极限力 （N）			22.8 ± 3	17.6 ± 3.4	0.0031**
屈服位移 （μm）			205 ± 17	190 ± 21	0.1039
屈服后位移 （μm）			246 ± 235	60 ± 51	0.0435*
总位移 （μm）			451 ± 230	249 ± 53	0.0278*
刚度 （N/mm）			110 ± 10	91 ± 13	0.0037**
产量工作 （mJ）			2.16 ± 0.45	1.54 ± 0.36	0.0055**
后产功 （mJ）			4.24 ± 3.01	1.04 ± 0.9	0.0109*
总功 （mJ）			6.4 ± 2.88	2.58 ± 0.97	0.0025**
屈服应力 （MPa）			180 ± 20	157 ± 25	0.0504
极限应力 （MPa）			209 ± 26	181 ± 27	0.0434*
应变屈服 （mɛ）			16.8 ± 2	16.4 ± 1.5	0.5771
总应变 （mɛ）			36.6 ± 17.2	21.5 ± 4.3	0.0277*
模量 （GPa）			12.2 ± 1.1	10.9 ± 1.1	0.0171*
弹性 （MPa）			1.62 ± 0.33	1.38 ± 0.33	0.1377
韧性 （MPa）			4.85 ± 2.29	2.26 ± 0.73	0.0076**

表1：机械测试和统计分析的结果。 值显示为平均值±标准差。P 值由双尾不配对 t 检验得出。* P < 0.05 和 ** P < 0.01。缩写：T2D-CKD = 2 型糖尿病和慢性肾病诱发的动物。

Discussion

在整个扫描和测试过程中，有时需要进行故障排除和优化。第一种发生在使用μCT扫描骨骼时。虽然许多系统都带有一个支架，可以在其中固定和扫描一个物体，但可以制造定制支架来同时扫描多个骨骼。扫描多块骨骼可能是一个很好的优化点，但在整个扫描和分析过程中应谨慎行事，以确保不会诱发伪影。当 X 射线以每个角度增量穿过（并被衰减）不同数量的骨组织时，这可能导致结果数据不准确。

故障排除的第二点发生在扫描的重建中。根据所使用的程序，用户可以定义重建的密度窗口，该窗口由扫描的衰减系数值计算得出。这是一个线性系数，用于表示物体⁵ 对 X 射线束的衰减程度。一些程序获取这些密度，并将它们转换为直方图中从 0 到 255 的灰度值。两个值将显示在直方图中，称为对比度极限¹⁰，必须适当设置该值以允许识别骨体素与非骨体素。较低的值通常设置为零的灰度值，而较高的对比度值建议设置为目标材料（骨骼）最大衰减的 10-20%¹⁰。如果未正确设置此值，则分析中可能会发生错误，因为部分数据可能会被截断。因此，该值需要根据扫描的样品进行调整。最佳做法是在对数刻度上查看直方图，并选择上限为略大于对数尾端的数字，以确保包括所有骨骼数据¹⁰。

在机械测试和分析期间会出现其他故障排除点。在测试和测试后查看力-位移曲线期间，可能会发现滚动的样品，并应从数据集中删除，如代表性结果中所述。此外，应谨慎对待骨骼的方向，因为存在控制被测骨形状的假设。当使用欧拉-伯努利弯曲方程计算应力和应变时，假设样品沿其长度³ 具有均匀的横截面。鉴于大多数骨骼没有均匀的横截面，最好选择骨骼中最均匀的区域进行测试（三点弯曲在整个支撑跨度上或四点弯曲的加载点之间）。

在股骨中，最好在中轴处进行三点弯曲测试。由于骨骼的弯曲度较轻，因此应在弯曲方向上进行测试，以防止局部表面屈曲（即，在前表面张力的情况下测试股骨）。胫骨的横截面形状变化更大，因此理想的测试区域从胫骨和腓骨交界处的近端开始。如果骨骼的内侧表面处于张力状态，则被测骨骼区域是平坦的，并且在弯曲方向上的半径和转动惯量变化最小。在解释弯曲测试结果时也应谨慎，因为假设材料是各向同性的、均匀的和线性弹性的——在测试骨骼³ 时，这些假设中的每一个都在某种程度上被违反。Bone无法满足这些假设，导致弯曲测试的结果必须谨慎解释。必须最仔细解释的特性是从超过屈服点的应力-应变曲线得出的特性，因为根据定义，传递屈服违反了线弹性假设。虽然可以对骨骼形状进行归一化，但除非各组之间存在严重差异，否则不建议尝试归一化为动物体重。在这种情况下，可以进行协方差分析以补偿这些差异，但在大多数情况下应避免对体重进行一般归一化。

尽管在此过程中可能会出现故障排除问题，但弯曲测试产生的机械性能可以描述骨骼对断裂的敏感性。这些测试也相对简单且快速执行。尽管这些测试的绝对值可能并不总是完全有效，但对于各种大小和形状的样品，能够检测组之间的相对差异可能非常准确。所获得的机械性能在可能预期骨骼差异的研究中具有功能相关性。虽然单调失效测试是最常见和最容易获得的机械测试，但其他方法，包括疲劳寿命和断裂韧性，可能会揭示其他感兴趣的机械性能，可以考虑。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAn	Bruker	NA	CT Scan Analysis Software
DataViewer	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Coding platform used for data analysis
NRecon	Bruker	NA	CT Scan Reconstruction software
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software	Micro Photonics Inc	SKY-016814	Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object