Considerazioni pratiche per la progettazione, l'esecuzione e l'interpretazione di studi che coinvolgono prove di flessione dell'osso intero di ossa di roditori

Summary

L'analisi meccanica delle ossa dei roditori è un metodo prezioso per estrarre informazioni sulla suscettibilità di un osso alla frattura. In mancanza di un'adeguata comprensione pratica, i risultati possono essere sovrainterpretati o non validi. Questo protocollo servirà come guida per garantire che i test meccanici vengano eseguiti in modo accurato per fornire dati validi e funzionali.

Abstract

La fragilità scheletrica che porta alla frattura è una crisi di salute pubblica americana che provoca 1,5 milioni di fratture ogni anno e 18 miliardi di dollari di costi diretti per l'assistenza. La capacità di comprendere i meccanismi alla base della malattia ossea e la risposta al trattamento non è solo auspicabile, ma fondamentale. I test meccanici dell'osso sono una tecnica preziosa per comprendere e quantificare la suscettibilità di un osso alla frattura. Sebbene questo metodo sembri semplice da eseguire, è possibile che si raggiunga conclusioni inappropriate e imprecise se le ipotesi e i passaggi chiave vengono ignorati dall'utente. Ciò è stato osservato in tutte le discipline, poiché gli studi continuano a essere pubblicati con un uso improprio dei metodi e un'interpretazione errata dei risultati. Questo protocollo servirà come base per i principi associati ai test meccanici insieme all'applicazione di queste tecniche, dalle considerazioni sulle dimensioni del campione attraverso la raccolta e la conservazione dei tessuti, all'analisi e all'interpretazione dei dati. Con questo in mano, è possibile ottenere preziose informazioni sulla suscettibilità di un osso alla frattura, favorendo la comprensione sia per la ricerca accademica che per le soluzioni cliniche.

Introduction

Il test meccanico dell'osso è il metodo principale per estrarre informazioni funzionali relative alla suscettibilità di un osso alla frattura. Negli studi preclinici, possono essere utilizzate diverse modalità di test, ma di gran lunga la più comune è la flessione delle ossa lunghe. Questi test sono facili da eseguire e possono essere utilizzati su ossa di dimensioni variabili dall'uomo al topo. Poiché i topi sono uno degli animali più comunemente studiati nella ricerca preclinica, questo protocollo si concentrerà sui test di flessione eseguiti sui femori e sulle tibie dei topi.

Prima di eseguire le prove di flessione, le ossa devono essere adeguatamente raccolte e conservate. I metodi di conservazione più comuni sono stati tradizionalmente il congelamento delle ossa in una garza imbevuta di soluzione salina, il congelamento in soluzione fisiologica da sola o la disidratazione delle ossa in etanolo ¹. È stato dimostrato che le ossa conservate in etanolo hanno una maggiore rigidità e modulo elastico e una diminuzione dei parametri di deformazione rispetto a quelle conservate congelate¹. Anche reidratare le ossa prima del test non ripristina queste proprietà ai livelli normali ¹. La conservazione immersa nella soluzione fisiologica potrebbe causare danni all'osso poiché la pressione viene esercitata mentre la soluzione salina si espande. Inoltre, sarebbe necessario uno scongelamento completo della soluzione per rimuovere le ossa per la scansione della tomografia microcomputerizzata (μCT). Di conseguenza, il congelamento delle ossa appena raccolte in garze imbevute di soluzione salina è diventato il metodo di conservazione standard ed è raccomandato in tutto questo protocollo.

Poiché le dimensioni e la forma di un osso influenzano la sua forza di massa e molti modelli di malattia alterano significativamente le dimensioni e la morfologia dell'osso, i principi ingegneristici vengono utilizzati per normalizzare gli effetti delle dimensioni per produrre proprietà che stimano il comportamento del tessuto². Questo approccio richiede la geometria della sezione trasversale della posizione del guasto, che viene più comunemente acquisita utilizzando μCT per creare scansioni delle ossa prima del test. μCT è ampiamente utilizzato grazie alla sua disponibilità e all'elevata risoluzione dell'immagine. Inoltre, i contributi dei tessuti molli non sono inclusi e la scansione non richiede fissazione chimica o altre modifiche all'osso ^3,4. In tutte le forme di TC, una sorgente di raggi X viene focalizzata su un oggetto mentre un rivelatore sull'altro lato dell'oggetto misura l'energia di raggi X risultante. Questo produce un'ombra a raggi X del campione che può essere convertita in un'immagine ^3,5. L'oggetto da scansionare viene ruotato (o la sorgente di raggi X e il rivelatore vengono ruotati attorno al campione), generando immagini che possono essere ricostruite in un set di dati tridimensionali che rappresenta l'oggetto⁵.

La risoluzione di scansione, ovvero la distanza tra due oggetti che possono essere risolti singolarmente, viene controllata modificando la dimensione nominale del voxel o la dimensione di un pixel nell'immagine risultante. È generalmente accettato che gli oggetti debbano essere almeno due volte le dimensioni di un singolo voxel per essere identificati³, ma un rapporto più alto consentirà una maggiore precisione. Inoltre, i voxel più grandi sono più inclini agli effetti di volume parziale: quando un singolo voxel contiene tessuti di densità variabile, gli viene assegnata la media di queste densità, piuttosto che la densità specifica di un singolo tessuto, il che può portare a una sovra- o sotto-stima delle aree tissutali e della densità minerale³. Sebbene questi problemi possano essere attenuati scegliendo voxel di dimensioni inferiori, l'utilizzo di una risoluzione più elevata non garantisce l'eliminazione degli effetti di volume parziale e potrebbe richiedere tempi di scansione più lunghi³. Quando si esegue la scansione delle ossa ex vivo, si raccomanda generalmente una dimensione del voxel di 6-10 μm per valutare con precisione l'architettura trabecolare delle ossa di topo. Per l'osso corticale può essere utilizzata una dimensione del voxel più grande di 10-17 μm, anche se dovrebbe essere utilizzata la dimensione del voxel più piccola e ragionevole. Questo protocollo utilizza una dimensione del voxel di 10 μm, che è abbastanza piccola da differenziare le proprietà trabecolari chiave e ridurre al minimo gli effetti del volume parziale senza lunghi tempi di scansione.

Anche le impostazioni dell'energia dei raggi X e del filtro energetico devono essere selezionate con attenzione, poiché l'elevata densità minerale e lo spessore del tessuto osseo attenuano e alterano notevolmente lo spettro di energia dei raggi X trasmessi. Si presume generalmente che, poiché lo spettro dei raggi X emessi è equivalente allo spettro che esce dall'oggetto⁶, l'uso di raggi X a bassa energia su oggetti densi come l'osso può portare a un artefatto noto come indurimento del fascio⁷. Si consiglia una tensione più elevata di 50-70 kVp durante la scansione di campioni ossei per ridurre l'incidenza di questi artefatti⁵. Inoltre, l'inserimento di un filtro energetico in alluminio o rame crea un fascio di energia più concentrato, riducendo ulteriormente gli artefatti ^4,7. In questo protocollo verrà utilizzato un filtro in alluminio da 0,5 mm.

Infine, il passo di rotazione della scansione e la lunghezza di rotazione (ad esempio, 180°-360°), insieme controllano il numero di immagini acquisite, che determina la quantità di rumore nella scansione finale⁴. La media di più fotogrammi in ogni passaggio può ridurre il rumore ma può aumentare il tempo di scansione⁴. Questo protocollo utilizza un passo di rotazione di 0,7 gradi e una media dei frame di 2.

Un'ultima nota sulla scansione: i fantocci di calibrazione dell'idrossiapatite devono essere scansionati utilizzando le stesse impostazioni di scansione delle ossa sperimentali per consentire la conversione dei coefficienti di attenuazione in densità minerale in g/cm³⁵. Questo protocollo utilizza fantocci di 0,25 g/cm3 e 0,75 g/^cm3 di idrossiapatite, sebbene siano disponibili fantocci diversi. Si noti che alcuni sistemi di scansione utilizzano fantocci interni come parte della calibrazione giornaliera del sistema.

Una volta completata la scansione, le proiezioni angolari vengono ricostruite in immagini in sezione trasversale dell'oggetto, in genere utilizzando il software in dotazione del produttore. Qualunque sia il sistema utilizzato, è importante assicurarsi che l'intero osso venga catturato nella ricostruzione e che la soglia sia impostata in modo appropriato per consentire il riconoscimento dell'osso rispetto al non osso. Dopo la ricostruzione, è fondamentale ruotare tutte le scansioni in tre dimensioni in modo che le ossa siano orientate in modo coerente e correttamente allineate con l'asse trasversale, sempre utilizzando il software del produttore.

Dopo la rotazione, le regioni di interesse (ROI) per l'analisi possono essere selezionate in base al fatto che si desiderino proprietà corticali, proprietà trabecolari o geometria della frattura per la normalizzazione meccanica. Per quest'ultimo, le ROI devono essere selezionate dopo il test misurando la distanza dal sito di frattura a un'estremità dell'osso e utilizzando la dimensione del voxel per determinare la posizione della fetta corrispondente nel file di scansione. La regione selezionata deve essere lunga almeno 100 μm, con il punto di frattura al centro approssimativo del ROI, per fornire una stima adeguata⁴.

Con i ROI selezionati, sono necessarie due proprietà per la normalizzazione meccanica (per calcolare la sollecitazione e la deformazione di flessione): la distanza massima dall'asse di flessione neutro alla superficie in cui viene avviato il cedimento (si presume che sia la superficie caricata in tensione, determinata dalla configurazione di prova) e il momento di inerzia dell'area attorno all'asse neutro (anch'esso dipendente dalla configurazione di prova). Questo protocollo consiglia l'uso di un codice personalizzato per determinare questi valori. Per accedere al codice, contattare direttamente l'autore corrispondente o visitare il sito Web del laboratorio all'indirizzo https://bbml.et.iupui.edu/ per ulteriori informazioni.

Una volta completata la scansione μCT, è possibile iniziare i test meccanici. Le prove di flessione possono essere eseguite in configurazioni a quattro o tre punti. Le prove di flessione a quattro punti sono preferite in quanto eliminano lo sforzo di taglio nell'osso tra i punti di carico, consentendo la flessione pura in questa regione³. L'osso si fratturerà quindi a causa della tensione, creando un cedimento che è più rappresentativo delle vere proprietà di flessione dell'osso³. Tuttavia, l'osso deve essere caricato in modo tale da fornire lo stesso carico in entrambi i punti di carico (questo può essere facilitato con una testa di carico girevole). Nei test di flessione a tre punti, c'è un grande cambiamento nella sollecitazione di taglio dove il punto di carico incontra l'osso, che provoca la rottura dell'osso in questo punto a causa del taglio, non della tensione³. Gli standard ASTM raccomandano che i materiali sottoposti a flessione dovrebbero avere un rapporto lunghezza-larghezza di 16:1, il che significa che la lunghezza della campata di supporto dovrebbe essere 16 volte maggiore della larghezza dell'osso per ridurre al minimo gli impatti del taglio ^8,9. Questo è spesso impossibile da ottenere quando si testano piccole ossa di roditori, quindi la campata di carico viene semplicemente resa il più grande possibile ma con il più piccolo cambiamento possibile nella forma della sezione trasversale. Inoltre, quando si esegue la flessione a quattro punti, il rapporto tra le lunghezze della campata inferiore e superiore dovrebbe essere ~3:1⁸, che di solito può essere raggiunto nella tibia, ma è difficile nel femore più corto. Inoltre, le pareti corticali più sottili dei femori li rendono suscettibili alla deformazione ad anello che cambia la forma della sezione trasversale dell'osso durante il test (questo può essere accentuato nei test a quattro punti poiché è necessaria una forza maggiore per indurre lo stesso momento flettente rispetto alla flessione a tre punti). Pertanto, la flessione a tre punti verrà utilizzata per i femori di topo mentre la flessione a quattro punti verrà utilizzata per le tibie in tutto questo protocollo.

Infine, è importante alimentare adeguatamente lo studio per l'analisi statistica. Una raccomandazione generale per i test meccanici è quella di avere una dimensione del campione di 10-12 ossa per gruppo sperimentale per essere in grado di rilevare le differenze, poiché alcune proprietà meccaniche, in particolare i parametri post-rendimento, possono essere molto variabili. In alcuni casi, ciò può significare iniziare con un campione di animali di dimensioni più elevate, dato l'attrito che potrebbe verificarsi durante lo studio. L'analisi della dimensione del campione utilizzando i dati esistenti deve essere completata prima di tentare uno studio.

Ci sono numerose limitazioni e ipotesi, ma i test di flessione possono fornire risultati abbastanza accurati, soprattutto quando le differenze relative tra i gruppi sono di interesse. Queste proprietà, insieme all'analisi dell'architettura trabecolare e della morfologia corticale, possono fornire una migliore comprensione degli stati patologici e dei regimi di trattamento. Se si presta attenzione a quegli aspetti dell'esperimento che sono sotto il nostro controllo (ad esempio, la raccolta, la conservazione, la scansione e il test), possiamo essere sicuri che siano stati generati risultati accurati.

Protocol

Tutte le procedure descritte in questo protocollo che coinvolgono animali sono state approvate dall'Indiana University School of Science Institutional Animal and Use Committee (IACUC) prima della procedura. Gli animali descritti nella procedura sono stati soppressi tramite inalazione di CO₂seguita da lussazione cervicale come mezzo secondario di eutanasia.

1. Raccolta, conservazione e scongelamento delle ossa

1. Raccolta e stoccaggio
   1. Posiziona il mouse con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Usa un bisturi (o una lama di rasoio o delle forbici) per praticare un'incisione all'incrocio approssimativo del femore e del bacino su un lato.
   2. Continuare l'incisione iniziale dorsalmente fino a localizzare l'articolazione dell'anca; Cerca la testa del femore che appare come una piccola sfera bianca attaccata al bacino.
   3. Applicare una pressione con il bordo di un bisturi sul bordo prossimale della testa del femore fino a quando la testa del femore non fuoriesce dall'alveolo. Asportare ulteriore tessuto per liberare l'arto posteriore dal resto della carcassa.
   4. Con l'arto posteriore isolato, separare la tibia e il femore inducendo la flessione dell'articolazione del ginocchio. Muovi il bisturi in direzione mediale-laterale sulla superficie anteriore del ginocchio per tagliare qualsiasi tessuto adiacente, compresi i legamenti tra le ossa.
   5. Se questo non separa le ossa, estendere l'articolazione del ginocchio per consentire l'accesso alla superficie posteriore. Fare attenzione a non tagliare l'osso o raschiare la cartilagine articolare.
   6. Una volta che il femore e la tibia sono separati, rimuovere il retropiede dalla tibia flettendo l'articolazione e utilizzando un movimento di segatura mediale-laterale sulla superficie posteriore dell'articolazione. Se necessario, estendere l'articolazione per esporre la superficie anteriore. Fare attenzione a non tagliare l'osso.
   7. Una volta isolato, pulire le ossa da tutti i tessuti molli aderenti. Se si eseguono prove di flessione a quattro punti sulla tibia, rimuovere anche il perone. Il perone è collegato da legamenti all'estremità prossimale, ma è fuso con la tibia vicino all'estremità distale dell'osso. Utilizzare forbici affilate vicino al punto di connessione per separare il perone.
   8. Avvolgere separatamente le ossa isolate e pulite in una garza imbevuta di soluzione fisiologica e conservarle a -20 °C. Fallo subito dopo la raccolta.
   9. Ripetere i passaggi da 1.1.1 a 1.1.8 per l'altro lato della carcassa.
      NOTA: Se c'è resistenza quando si tenta di separare le ossa nei passaggi 1.1.4-1.1.6, è meglio ripetere i passaggi piuttosto che cercare di separare le ossa. Movimenti energici possono causare danni o fratture delle ossa.
2. Scongelamento
   NOTA: Il numero di cicli di gelo-scongelamento a cui è sottoposto un osso deve essere ridotto al minimo poiché cicli eccessivi di gelo-scongelamento possono influire negativamente sulle proprietà meccaniche dell'osso. Lo scongelamento parziale per la scansione μCT può essere ottenuto lasciando l'osso a temperatura ambiente per 5-10 minuti. Scongelare completamente l'osso solo quando si eseguono prove di flessione come descritto di seguito.
   1. Preferibile per il disgelo notturno
      1. Spostare le ossa da -20 °C a 1-4 °C in una cella frigorifera o in frigorifero. Assicurarsi che le ossa rimangano lì per 8-12 ore per scongelarsi completamente prima del test.
   2. Scongelamento rapido
      1. Impostare la temperatura del bagno a circa 37 °C. Una volta a questa temperatura, aggiungere le ossa al bagno.
      2. Lasciare le ossa nella vasca da bagno per circa 1 ora.

2. Scansione μCT

1. Avvolgere le ossa in parafilm prima della scansione per mantenere l'idratazione. Tieni tutte le altre ossa sul ghiaccio mentre aspetti di essere scansionato.
2. Una volta avvolto nel parafilm, posizionare l'osso in un supporto per interfacciarsi con lo scanner. Assicurarsi che tutte le ossa scansionate siano allineate con lo stesso orientamento, poiché un allineamento coerente semplificherà la rotazione più avanti nell'analisi.
3. Regolare le impostazioni di scansione in base all'applicazione della scansione. Per le ossa di topo si consigliano le seguenti impostazioni generali di scansione: risoluzione/dimensione voxel: 10 μm; dimensione dei pixel: media, 2000 x 1048; filtro: alluminio da 0,5 mm; passo di rotazione: 0,7; Media dei fotogrammi: 2.
   NOTA: Queste impostazioni possono variare a seconda del sistema utilizzato per la scansione e, se necessario, consultare il manuale del produttore e dell'utente.
4. Una volta accesa la sorgente di raggi X, eseguire una correzione a campo piatto per ridurre al minimo gli artefatti. Per fare ciò, per prima cosa, assicurati che la camera sia vuota e spegni il campo piatto.
5. Misurare l'intensità media del campo e regolarla al 60%. Una volta raggiunto il 60%, aggiorna il campo piatto e riaccendilo.
6. Assicurati che l'intensità media sia ora (86-88%).
   NOTA: Questo processo può variare a seconda del sistema μCT utilizzato. Consultare il manuale dell'utente prima di tentare il processo.
7. Una volta eseguita con successo la correzione del campo piatto, posizionare il supporto nella camera. Assicurarsi che i campioni siano centrati e livellati prima di posizionare il piedistallo nella camera.
8. Una volta fissato il piedistallo, chiudere la camera, assicurarsi che l'intero osso venga catturato nella scansione (potrebbe essere necessaria una vista esplorativa) e avviare la scansione.
9. Dopo la scansione, conservare nuovamente le ossa in una garza imbevuta di soluzione salina a -20 °C.

3. Ricostruzione μCT

1. Seleziona un ROI che catturerà l'intero osso nella ricostruzione. Per fare ciò, visualizza la sezione trasversale più grande dell'osso e ridimensiona il ROI in base a questa sezione trasversale.
2. Impostare la soglia del software per consentire il corretto riconoscimento dell'osso rispetto a quello non osseo. A tale scopo, utilizzare un istogramma in cui un vincolo inferiore è impostato su 0 e il vincolo superiore è impostato alla fine dei dati dell'istogramma di picco.
3. Regola le impostazioni aggiuntive, tra cui la riduzione degli artefatti dell'anello e l'indurimento del raggio, rispettivamente al 5 e al 20%. Verificare che la compensazione del disallineamento sia compresa tra -7 e 7. Questi valori possono variare a seconda del software. Assicurarsi che siano verificati con il manuale dell'utente e le istruzioni del produttore prima di iniziare la ricostruzione.
   NOTA: Gli artefatti possono essere ridotti al minimo durante la ricostruzione utilizzando correzioni per l'indurimento della trave, gli artefatti ad anello e la compensazione del disallineamento. La compensazione del disallineamento può fungere da indicatore della qualità della scansione e, se al di fuori di un intervallo specificato dal produttore, la scansione deve essere ripetuta. Tuttavia, le impostazioni di ricostruzione dipenderanno dal software e consultare il manuale dell'utente.

4. Rotazione μCT

NOTA: Una volta ricostruite, le scansioni devono essere ruotate per stabilire un orientamento coerente su tutte le ossa e per garantire che le sezioni trasversali dell'osso risultante siano prese perpendicolarmente all'asse longitudinale con il minor angolo di offset possibile. Questo dovrebbe essere fatto con il software scelto dall'utente.

1. Rotazione del femore
   1. Ruota il femore in modo che tutte le ossa abbiano lo stesso orientamento longitudinale. Ad esempio, orientare tutte le ossa con l'estremità prossimale dell'osso nella parte superiore della scansione.
   2. Ruotare l'osso in modo che l'orientamento della sezione trasversale di tutte le ossa sia lo stesso. Ad esempio, ruotare le ossa in modo che il lato anteriore sia sempre sul lato destro delle scansioni.
   3. Una volta effettuate queste regolazioni, raddrizzare la scansione per garantire che la simmetria venga mantenuta rispetto all'asse centrale.
   4. Salvare il set di dati ruotato.
2. Rotazione della tibia
   1. Ripetere i passaggi 4.1.1-4.1.4 per la tibia.

5. Procedura di prova meccanica

1. Preparazione
   1. Prima dei test meccanici, assicurarsi che sia stata ottenuta e ricostruita una scansione μCT con risoluzione di 6-10 μm per verificare che sia stata acquisita una scansione di qualità per ciascun campione per calcolare la geometria della sezione trasversale nel sito di frattura (sezioni 2-3).
   2. Con le scansioni ottenute e verificate, scongelare tutte le ossa prima del test (sezione 1) . Testare tutte le ossa di un esperimento lo stesso giorno e randomizzare l'ordine dei test per ridurre al minimo i pregiudizi dell'utente e la variabilità del sistema tra campioni e gruppi sperimentali. Assicurarsi che le ossa rimangano idratate durante tutto il processo di test.
2. Configurazione dell'apparato
   1. Individuare una cella di carico con sensibilità e capacità appropriate per il campione. Considerare l'intervallo di guasto previsto per il campione e scegliere una cella di carico con circa il 50% di capacità in più, massimizzando al contempo la sensibilità (ad esempio, una cella di carico da 10 lbf con una capacità di 45 N per un osso di topo nell'intervallo di guasto 0-25 N).
   2. Individuare i dispositivi di carico e di supporto della campata.
   3. Installare la cella di carico e i dispositivi come mostrato nella Figura 1, avvitando la cella di carico sul supporto superiore o inferiore del tester, il dispositivo di caricamento superiore sulla cella di carico e il dispositivo inferiore sul supporto inferiore del tester. Garantire una vestibilità sicura.
      NOTA: Il fissaggio della cella di carico al dispositivo superiore è generalmente consigliato quando si eseguono prove di flessione per evitare il contatto del fluido con la cella di carico, ma se necessario è possibile utilizzare la parte inferiore.
   4. Una volta installata la cella di carico e i dispositivi, selezionare una lunghezza della campata di supporto e assicurarsi che rimanga costante per tutti i campioni da testare. Per scegliere una distanza di campata di supporto, individuare prima l'osso più corto nel set di campioni.
   5. Orientare l'osso tra i dispositivi come mostrato nella Figura 2.
   6. Per la flessione a tre punti del femore, seguire la Figura 2A. Assicurarsi che la superficie anteriore dell'osso sia contro la campata di supporto e che la regione della campata sia all'interno della diafisi del campione. Evitare di includere il terzo trocantere all'estremità prossimale e il punto di transizione in cui l'osso si allarga nella metafisi e nei condili all'estremità distale.
   7. Per la piegatura a quattro punti, assicurarsi che le campate di supporto e di carico siano allineate e centrate l'una con l'altra. Seguire la Figura 2B per caricare l'osso nei dispositivi.
      1. Impostare le lunghezze delle campate di supporto e di carico in modo che seguano un rapporto 3:1⁸ (ad esempio, campata di supporto di 9 mm e campata di carico di 3 mm).
      2. Per una tibia, caricare la superficie mediale dell'osso contro l'intervallo di supporto con un supporto alla giunzione tibia/perone. L'altro supporto sarà probabilmente posizionato subito dopo la cresta tibiale. Assicurarsi che l'intervallo di carico, centrato all'interno dell'intervallo di supporto, contenga quindi una regione uniforme dell'osso.
   8. Misurare la distanza della campata di supporto se si esegue la piegatura a tre punti e le distanze di carico e di supporto se si esegue la piegatura a 4 punti e registrare queste distanze. Assicurarsi che questo valore venga registrato dal centro dei punti di carico sia per le misurazioni della campata di carico che per quelle di supporto.
   9. Rimetti l'osso in soluzione fisiologica o reidratalo con un bolo di soluzione fisiologica.
      NOTA: Quando si selezionano i punti per una campata di carico, si consiglia di utilizzare punti circolari (un raggio di 0,75 mm è sufficiente in quanto distribuisce il carico e allo stesso tempo entra in contatto con l'osso nella tangente del cerchio). Mentre la teoria raccomanda che un bordo a coltello rappresenti un carico puntuale, questo schiaccerà l'osso nel punto di applicazione del carico, portando a sovrastime della deformazione e sottostime del modulo.
   10. Assicurarsi che tutte le parti dell'apparecchiatura siano serrate e libere da movimenti.
3. Configurazione del software
   1. Assicurarsi che il tester sia collegato correttamente al computer tramite la scatola del modulo, i canali della cella di carico e qualsiasi altro requisito indicato nel manuale del sistema.
   2. Nel software associato al tester meccanico, creare un profilo di prova di flessione con una rampa che abbia una velocità di spostamento sufficientemente lenta da non indurre effetti viscoelastici (spesso si utilizzano 0,025 mm/s ) per caricare l'osso fino alla rottura.
   3. Si consiglia inoltre una frequenza di campionamento minima di 25 Hz quando si crea un profilo di test, sebbene sia preferibile una frequenza di campionamento più elevata.
   4. Creare una cartella per gruppo di studio e salvare ogni test come file individuale all'interno di tale cartella.
4. Caricamento e test dei campioni
   1. Selezionare un osso adeguatamente scongelato (vedere il passaggio 1.2). Misura e registra la sua intera lunghezza con i calibri.
   2. Caricare il campione sui dispositivi come mostrato nella Figura 2A se si esegue il test di un femore in flessione a tre punti e nella Figura 2B se si esegue il test di una tibia in flessione a quattro punti.
   3. Modificare il nome del file in modo che rifletta il campione sottoposto a test.
   4. Azzerare il carico (non lo spostamento). Accendere il motore del sistema; Assicurarsi che non sia in controllo del carico o dello spostamento.
   5. Usando cautela, applicare un precarico minimo all'osso per fissarne la posizione e aiutare a prevenire il rotolamento dell'osso, ma assicurarsi che non comprometta il campione. Puntare a un precarico di circa 0,25 N. Assicurarsi che l'orientamento osseo desiderato sia mantenuto prima di procedere.
   6. Idratare il campione bagnandolo generosamente con soluzione fisiologica.
   7. Iniziare la prova di flessione selezionando Avvia o Esegui nel software. CRITICO: Osservare attentamente il campione per l'intera durata del test e annotare i test in cui si sono verificati problemi (ad es. rotolamento, scivolamento).
      NOTA: Questi problemi potrebbero compromettere i dati e le note su questi test saranno utili da consultare durante l'analisi.
   8. Prestare attenzione all'osso che inizia a fratturarsi (sul lato di trazione). La maggior parte dei test procederà fino a quando non si verifica un guasto. A questo punto, il test terminerà tramite i limiti programmati. Se si verifica un guasto ma il tester continua a spostarsi, interrompere manualmente il test per evitare danni alla cella di carico.
   9. Una volta completato il test, misurare la lunghezza dall'estremità distale al punto di rottura utilizzando i calibri e registrarla.
   10. Ripetere i passaggi da 5.4.1 a 5.4.9 per ciascun campione.

Figura 1: Configurazione del tester meccanico. (A) Prove di flessione a tre punti e (B) a quattro punti. La cella di carico è mostrata in giallo, i dispositivi di carico sono mostrati in blu e i dispositivi di supporto sono mostrati in verde. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Orientamento delle ossa tra i dispositivi . (A) Orientamento corretto di un femore nei dispositivi di carico di flessione a tre punti che mostrano (dall'alto verso il basso) le viste dal lato mediale, anteriore e posteriore del femore quando posizionato correttamente. I dispositivi di carico sono mostrati in arancione e i dispositivi di supporto sono mostrati in blu. Le campate inferiori devono essere regolate in modo da includere il più possibile la parte più diritta della diafisi e l'apparecchio superiore deve essere centrato tra queste campate. (B) Orientamento corretto di una tibia per la flessione a quattro punti che mostra (dall'alto verso il basso) le viste dai lati anteriore, laterale e mediale della tibia. L'osso deve essere caricato in modo che la superficie mediale entri in contatto con il dispositivo inferiore e la superficie laterale entri in contatto con il dispositivo superiore. La giunzione tibia-perone deve essere posizionata appena fuori dalla campata di carico. Le campate devono essere regolate per soddisfare al meglio un rapporto carico-supporto di 1:3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Selezione del ROI

1. Una volta registrate le lunghezze di interruzione, caricare le immagini ruotate nel software scelto dall'utente. Una volta caricate le immagini ruotate, individua e registra le fette superiore e inferiore dell'osso.
2. Calcola la differenza tra le fette superiore e inferiore. Moltiplicare questo valore per la dimensione del voxel di scansione per determinare la lunghezza complessiva dell'osso in micrometri.
3. Per individuare la posizione della frattura nella scansione TC, dividere la lunghezza di rottura registrata (in micrometri) per la dimensione del voxel per ottenere il numero di fette μCT dall'estremità distale della scansione al punto di rottura.
4. Seleziona un ROI, centrato in questa posizione. Innanzitutto, imposta la lunghezza totale desiderata del ROI (almeno 100 μm). Trova il numero di fette rappresentate da questa lunghezza dividendo la lunghezza in micrometri per la dimensione del voxel per determinare il numero totale di fette nel ROI.
5. Per ottenere il limite inferiore del ROI, dividere il numero totale di sezioni di ROI per 2 e sottrarre questo valore dalla posizione di interruzione calcolata in precedenza trovata nel passaggio 6.4.
6. Aggiungere la lunghezza totale del ROI in sezioni al valore calcolato in precedenza per ottenere il limite superiore del ROI.
7. Selezionare il ROI appropriato, in base ai limiti calcolati, e salvarlo.

7. Normalizzazione dei dati di forza e spostamento

NOTA: Il tester meccanico genererà solo punti con coordinate x e y (spostamento, forza). Questi punti possono essere convertiti in sollecitazione e deformazione utilizzando le equazioni di sollecitazione e deformazione di flessione di Eulero-Bernoulli, ma richiedono proprietà geometriche ottenute da scansioni μCT. La quantificazione di queste proprietà può essere eseguita con il software preferito dall'utente. Preferiamo un codice personalizzato, che offre il controllo completo su tutti gli input, i calcoli e gli output. Come accennato in precedenza, per accedere al codice, contattare direttamente l'autore corrispondente o visitare il sito Web del laboratorio all'indirizzo https://bbml.et.iupui.edu/ per ulteriori informazioni. Le equazioni di sollecitazione e deformazione, nonché le proprietà geometriche necessarie che devono essere ottenute dalle scansioni μCT, per calcolarle sono discusse di seguito.

1. Equazioni di normalizzazione della flessione a tre punti
   1. L'equazione utilizzata per calcolare la sollecitazione nella piegatura a tre punti è mostrata di seguito nell'equazione 1. In questa equazione, "F" rappresenta la forza e "L" rappresenta la lunghezza della campata di supporto. I valori di forza vengono registrati dal tester meccanico durante la prova. Assicurarsi che la lunghezza dell'intervallo di supporto sia registrata prima del test. "c" e "I" sono proprietà geometriche che verranno calcolate utilizzando scansioni μCT (sezione 7.3).
      (1)
   2. L'equazione per calcolare la deformazione è mostrata di seguito nell'equazione 2; "c" e "L" rappresentano le stesse proprietà sia per il calcolo della sollecitazione che per quello della deformazione. "d" indica i valori di spostamento registrati dal tester meccanico durante le prove.
      (2)
2. Equazioni di normalizzazione della flessione a quattro punti
   1. L'equazione per la sollecitazione nella flessione a quattro punti è mostrata di seguito nell'equazione 3. "F" e "I" rimangono le stesse variabili discusse nel passaggio 7.1.1. Calcolare "a" dalle misurazioni del supporto e della campata di carico prima del test. Se si segue il rapporto consigliato di 3:1 per il supporto rispetto alla campata di carico per la flessione a quattro punti, "a" sarà un terzo della lunghezza della campata di supporto.
      (3)
   2. L'equazione per la deformazione nella flessione a quattro punti è mostrata di seguito nell'equazione 4. "c" e "a" indicano le stesse proprietà sia per i calcoli di sollecitazione che di deformazione. "d" indica i valori di spostamento registrati dal collaudatore meccanico durante le prove.
      (4)
3. Calcolo delle proprietà geometriche dalle scansioni μCT
   1. La variabile "c" rappresenta la distanza dall'asse neutro alla superficie dell'osso che è stato caricato in tensione. Di conseguenza, determinare il baricentro di ciascuna sezione trasversale nelle scansioni μCT poiché l'asse neutro passa attraverso il centroide.
      1. Se si segue l'orientamento di prova di un femore nella flessione a tre punti descritto al punto 5.2.6, misurare "c" rispetto alla superficie anteriore.
      2. Se si segue l'orientamento di prova di una tibia descritto al punto 5.2.7, misurare "c" rispetto alla superficie mediale dell'osso.
   2. La variabile "I" rappresenta l'area del momento d'inerzia attorno all'asse di flessione (l'asse mediale-laterale per un femore; l'asse antero-posteriore per una tibia). Calcola questo valore usando l'equazione 5. In questa equazione, "dA" è l'area di ogni pixel catturato nella scansione μCT mentre y è la distanza calcolata di ogni pixel dall'asse neutro.
      (5)

8. Proprietà di prova meccanica di interesse

1. Prima di calcolare qualsiasi proprietà meccanica, generare una curva forza-spostamento e una curva sforzo-deformazione (curve ideali mostrate di seguito nella Figura 3, insieme alle proprietà significative).
   NOTA: L'analisi dei campioni biologici non sempre genera curve che assomigliano a questi esempi idealizzati, ma rimangono una guida utile.
2. Esamina queste curve prima dell'analisi per individuare gli errori nei test, come il rotolamento o lo scivolamento di un osso. Questi errori causano in genere protuberanze o regioni piatte nella parte lineare iniziale della curva. A questo punto, rimuovere i dati in eccesso, inclusi i dati che potrebbero essere stati raccolti prima che il tester entrasse in contatto con l'osso o i dati successivi al guasto.
3. Una volta assicurato un test di qualità dalle curve tracciate, iniziare l'analisi delle proprietà significative.
   1. Rigidità e modulo elastico
      1. Calcolare la rigidezza utilizzando solo la regione elastica della curva forza-spostamento. La pendenza della curva in questa regione è la rigidità.
      2. Calcolare il modulo elastico utilizzando la pendenza della sola parte elastica della curva sforzo-deformazione.
   2. Punto di snervamento
      NOTA: Sono presenti due punti di snervamento, uno sulla curva forza-spostamento e uno sulla curva sforzo-deformazione. I valori (x,y) per questo punto della curva forza-spostamento sono noti come spostamento rispetto allo snervamento e forza di snervamento, mentre quelli della curva sforzo-deformazione sono noti come deformazione allo snervamento e sollecitazione allo snervamento. Questi punti rappresentano la fine della regione elastica della curva e possono essere trovati nei modi elencati di seguito.
      1. Metodo della curva sforzo-deformazione: calcolare un offset di linea da (0,0) di 0,2% di deformazione (2.000 microdeformazione) ma con la stessa pendenza del modulo elastico. Tracciare questa linea sul grafico sforzo-deformazione; La posizione in cui questa linea intercetta la curva sforzo-deformazione è definita come punto di snervamento. Utilizzare questa coordinata di tensione e deformazione per trovare i valori di forza e spostamento analoghi; Questi valori rappresenteranno la forza di snervamento e lo spostamento rispetto ai valori di snervamento.
      2. Metodo secante: calcola la rigidezza dalla curva forza-spostamento e riduci la rigidità di una percentuale scelta (5-10%). Tracciate una linea a partire da (0,0) con la pendenza di questa rigidezza ridotta e lasciatela intersecare con la curva forza-spostamento. Il punto di intersezione avrà le coordinate (spostamento rispetto allo snervamento, forza di snervamento).
         NOTA: Il metodo secante può essere utilizzato per trovare il punto di snervamento senza dati di sollecitazione-deformazione.
   3. Forza massima e stress finale
      1. Calcola la forza massima e la sollecitazione ultima trovando il valore massimo nei rispettivi set di dati.
   4. Proprietà di spostamento e deformazione
      1. Valori di spostamento rispetto allo snervamento e deformazione a snervamento che rappresentano lo spostamento o la deformazione rispetto al punto di snervamento. Per trovarli, individuare la resa come descritto al punto 8.3.2.
      2. I valori di spostamento totale e deformazione totale rappresentano lo spostamento totale o la deformazione totale che un campione ha subito durante il test e corrispondono al punto di rottura.
      3. Spostamento post-cedimento e deformazione post-cedimento: lo spostamento post-cedimento è comunemente riportato e può essere calcolato sottraendo lo spostamento allo snervamento dallo spostamento totale. Calcolare la deformazione post-cedimento sottraendo la deformazione per snervamento dalla deformazione totale, ma riportalo con cautela, poiché la deformazione viene prima derivata assumendo che il materiale sia linearmente elastico (presnervamento). Ciò rende una misura successiva al cedimento suscettibile di invalidità.
   5. Proprietà energetiche
      1. Calcola l'energia come l'area sotto la curva forza-spostamento o la curva sforzo-deformazione.
      2. L'area sotto la curva forza-spostamento è nota come lavoro. L'area calcolata sotto la parte di pre-snervamento della curva, o regione elastica, è nota come lavoro elastico o energia. L'area calcolata sotto la curva oltre il punto di snervamento, o regione plastica, è nota come post-snervamento o lavoro plastico, o perdita di energia.
      3. L'area totale calcolata sotto la curva sforzo-deformazione è nota come tenacità o modulo di tenacità, mentre l'area calcolata sotto la curva sforzo-deformazione fino al punto di snervamento è nota come resilienza. La tenacità post-snervamento, come la deformazione post-snervamento, spesso non viene riportata a causa delle ipotesi delle equazioni di deformazione in cui questa proprietà non rientra.

Figura 3: Curve forza-spostamento e sforzo-deformazione. (A) Curva ideale forza-spostamento; (B) curva sforzo-deformazione ideale con la linea derivata dal metodo di offset dello 0,2% utilizzato per calcolare il punto di snervamento mostrato in rosso (si noti che questa linea ha la stessa pendenza di quella della regione elastica della curva). Le proprietà chiave che possono essere ottenute dalla curva forza-spostamento includono la forza di snervamento, la forza ultima, lo spostamento rispetto allo snervamento, lo spostamento totale e il lavoro. Le proprietà a livello tissutale che possono essere ottenute dalla curva sforzo-deformazione includono lo sforzo di snervamento, lo sforzo ultimo, la deformazione allo snervamento, la deformazione totale, la resilienza e la tenacità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Representative Results

Al termine della scansione TC, la maggior parte delle scansioni inadeguate può essere rilevata nella ricostruzione. Spesso, le scansioni scadenti avranno un'elevata compensazione del disallineamento che è un chiaro indicatore di un errore durante la scansione. Tuttavia, possono verificarsi errori in altri passaggi e potrebbero anche portare a dati imprecisi. Questi errori possono spesso essere individuati durante l'esame delle singole proprietà architettoniche calcolate. Se i valori sono molto al di fuori dell'intervallo degli altri in un gruppo, la scansione, il ROI e il metodo di calcolo delle proprietà devono essere riesaminati.

Una volta completate le prove di flessione, è necessario esaminare i grafici forza-spostamento di ciascun test per identificare i test scadenti che potrebbero dover essere rimossi dal set di dati. Un esempio di test problematico è mostrato nella Figura 4. Il grafico in Figura 4A mostra i risultati di una prova di flessione eseguita correttamente. C'è una regione lineare chiara priva di una convergenza a bassa pendenza, di un punto di snervamento, di un punto ultimo (forza massima), di un calo di forza quando lo spostamento si estende oltre la forza massima e di un punto di rottura. La curva è regolare, senza bruschi cambiamenti di carico fino a quando non è stato raggiunto il punto finale. Di conseguenza, le proprietà di questo test possono essere facilmente identificate e considerate attendibili. Il grafico mostrato in Figura 4B mostra il risultato di una prova di flessione con più caratteristiche preoccupanti. I bruschi cambiamenti nel carico e la comparsa di picchi multipli nel grafico sono i principali indicatori dei problemi con questo test. Mentre piccoli picchi possono verificarsi in un test appropriato vicino alla forza finale, l'entità e il numero di picchi in questo grafico suggeriscono che l'osso potrebbe essere rotolato durante il test. Indipendentemente dal fatto che siano osservati e annotati durante la prova o durante l'esame delle prove prima dell'analisi, i dati del campione devono essere esaminati durante l'analisi post-prova. Se i dati sono effettivamente errati o molto al di fuori dell'intervallo di altri campioni del gruppo, sarebbe ideale non includere questo test nel set di dati finale. Questo è uno dei motivi per alimentare correttamente l'esperimento con i calcoli di potenza a priori . Potrebbe essere possibile riportare solo alcune proprietà di un campione (in questo caso, le proprietà di pre-rendimento potrebbero essere accettabili), ma questo non è l'ideale e dovrebbe essere spiegato chiaramente quando viene riportato.

Figura 4: Grafici forza-spostamento. (A) Grafico ideale forza-spostamento. (B) Grafico forza-spostamento risultante da una prova di flessione scadente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Con tutti i grafici forza-spostamento esaminati e i valori normalizzati alla sollecitazione-deformazione, le proprietà di interesse possono essere identificate e mostrate in diversi modi. Nella Figura 5 sono mostrati i grafici forza-spostamento e sforzo-deformazione risultanti per un intero studio. Si tratta di rappresentazioni schematiche in cui vengono determinate la forza e lo spostamento nel punto di partenza (0,0), lo snervamento, il punto ultimo e il cedimento per ciascun osso e quindi vengono calcolate la media della forza/sollecitazione e dello spostamento/deformazione per fornire un grafico medio per ciascun gruppo. I grafici non vengono utilizzati per l'analisi statistica, ma possono essere utilizzati per mostrare come il comportamento complessivo varia a causa di fattori come un trattamento o uno stato di malattia. I grafici mostrati nella Figura 5 provengono da uno studio che confronta i topi di controllo con quelli indotti con uno stato di diabete di tipo 2 e malattia renale cronica (T2D-CKD). Le tibie destre di questi animali sono state testate fino al cedimento utilizzando la flessione a quattro punti e analizzate per ottenere le proprietà discusse nella sezione 8 del protocollo. Dalla Figura 5, è chiaro che il gruppo T2D-CKD aveva proprietà meccaniche ridotte, tra cui resistenza e rigidità, sia a livello strutturale che tissutale. Questi topi sembrano anche avere ridotte proprietà post-rendimento, un indicatore di fragilità. Questi grafici non devono essere utilizzati per trarre conclusioni definitive da uno studio. Piuttosto, fungono da rappresentazione visiva e dovrebbero essere verificati eseguendo un'analisi statistica su tutte le proprietà di interesse.

Figura 5: Grafici forza-spostamento e stress-deformazione per un intero studio. (A) Grafico forza-spostamento per animali di controllo e animali indotti da diabete di tipo 2 e malattia renale cronica. Questo grafico è risultato facendo la media della forza di snervamento, dello spostamento rispetto allo snervamento, della forza ultima, dello spostamento finale, della forza di rottura e dello spostamento totale per ciascun gruppo e tracciando queste medie insieme alla deviazione standard. (B) Stress-strain per animali di controllo e animali con T2D-CKD. Questo grafico è il risultato della media della tensione di snervamento, della deformazione a snervamento, della sollecitazione ultima, della deformazione ultima, della sollecitazione di rottura e della deformazione totale e tracciando le medie risultanti insieme alla deviazione standard. Abbreviazione: T2D-CKD = animali indotti dal diabete di tipo 2 e dalla malattia renale cronica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I dati meccanici e i risultati di un test t a due code sono riportati nella Tabella I. I dati sono presentati come media ± deviazione standard. Un esame generale suggerisce dati all'interno di intervalli appropriati e con livelli di variabilità attesi. Si noti che le proprietà post-rendimento tendono ad avere la maggiore variazione e, pertanto, spesso richiedono le dimensioni del campione più grandi per rilevare differenze significative. Come suggerito dalle curve schematiche nella Figura 5, ci sono diminuzioni significative in quasi tutte le proprietà meccaniche strutturali e a livello tissutale. Da questi dati, si può concludere che lo stato patologico indotto ha portato a ossa più deboli, meno rigide e più suscettibili alla frattura a causa della perdita di deformabilità e della ridotta tenacità. Gli studi con confronti più sfumati potrebbero non essere così semplici da interpretare. Un esempio di ciò può essere se si osservano miglioramenti significativi nelle proprietà meccaniche a livello strutturale, ma non nelle proprietà meccaniche a livello tissutale. In questo caso, gli effetti osservati sono probabilmente guidati da cambiamenti nell'architettura dell'osso (ad esempio, aumento dell'area, aumento dello spessore corticale) piuttosto che da miglioramenti nella qualità dell'osso a livello tissutale. Ad esempio, l'area ossea è aumentata a causa dell'aumento dell'osso intrecciato, ma la qualità del tessuto è diminuita poiché ora è presente un osso intrecciato non organizzato piuttosto che un osso lamellare organizzato. Ciò potrebbe essere supportato dall'analisi μCT in cui si possono osservare miglioramenti statisticamente significativi nell'architettura. Al contrario, ci possono essere miglioramenti significativi nelle proprietà meccaniche a livello tissutale con miglioramenti minimi o nulli nelle proprietà meccaniche a livello strutturale. Questa elevata qualità dei tessuti potrebbe mascherare le insidie delle ossa più piccole. L'interpretazione dei dati può diventare ulteriormente complicata se si osservano cambiamenti nelle proprietà di pre-snervamento ma non in quelle di post-rendimento o viceversa. Nel primo caso, un cambiamento nella capacità dell'osso di resistere alla deformazione può essere migliorato, mentre la sua capacità di tollerare i danni non lo è. In ognuno di questi casi, la capacità di fare riferimento alle proprietà architettoniche dall'analisi μCT è molto vantaggiosa e dovrebbe essere utilizzata (anche se la descrizione di tale metodo esula dallo scopo di questo articolo). A causa della complessità dell'interpretazione di queste proprietà, presentare tutte le proprietà in forma di tabella o figura (non solo quelle proprietà che tendono ad essere le più facili da interpretare, come la forza ultima, o che raccontano la storia che si sta cercando di raccontare) consente una rappresentazione più completa degli impatti meccanici.

			Controllo	T2D-CKD	Valore P
Forza di snervamento (N)			19,7 ± 2,9	15.2 ± 2.6	0.0032**
Forza Suprema (N)			22.8 ± 3	17,6 ± 3,4	0.0031**
Cilindrata allo snervamento (μm)			205 ± 17	190 ± 21	0.1039
Spostamento post-snervamento (μm)			246 ± 235	60 ± 51	0.0435*
Spostamento totale (μm)			451 ± 230	249 ± 53	0.0278*
Rigidità (N/mm)			110 ± 10	91 ± 13	0.0037**
Lavoro da rendere (mJ)			2.16 ± 0.45	1.54 ± 0.36	0.0055**
Lavoro post-rendimento (mJ)			4.24 ± 3.01	1,04 ± 0,9	0.0109*
Lavoro totale (mJ)			6.4 ± 2.88	2.58 ± 0.97	0.0025**
Tensione di snervamento (MPa)			180 ± 20	157 ± 25	0.0504
Stress finale (MPa)			209 ± 26	181 ± 27	0.0434*
Ceppo a resa (mɛ)			16,8 ± 2	16,4 ± 1,5	0.5771
Deformazione totale (mɛ)			36,6 ± 17,2	21,5 ± 4,3	0.0277*
Modulo (GPa)			12.2 ± 1.1	10.9 ± 1.1	0.0171*
Resilienza (MPa)			1.62 ± 0.33	1.38 ± 0.33	0.1377
Tenacità (MPa)			4.85 ± 2.29	2.26 ± 0.73	0.0076**

Tabella 1: Risultati delle prove meccaniche e dell'analisi statistica. Valori indicati come media ± deviazione standard. I valori di P derivano da un test t spaiato a due code. * P < 0,05 e ** P < 0,01. Abbreviazione: T2D-CKD = animali indotti dal diabete di tipo 2 e dalla malattia renale cronica.

Discussion

Durante il processo di scansione e test, ci sono momenti in cui la risoluzione dei problemi e l'ottimizzazione sono appropriate. Il primo di questi si verifica quando si esegue la scansione delle ossa utilizzando μCT. Mentre molti sistemi sono dotati di un supporto in cui un oggetto può essere tenuto e scansionato, i supporti personalizzati possono essere fabbricati per scansionare più ossa contemporaneamente. La scansione di più ossa può essere un ottimo punto per l'ottimizzazione, ma è necessario prestare attenzione durante tutto il processo di scansione e analisi per garantire che non vengano indotti artefatti. Poiché i raggi X attraversano (e sono attenuati da) quantità variabili di tessuto osseo ad ogni incremento angolare, ciò può portare a imprecisioni nei dati risultanti.

Un secondo punto per la risoluzione dei problemi si verifica nella ricostruzione delle scansioni. A seconda del programma utilizzato, l'utente può definire la finestra di densità per la ricostruzione, calcolata dai valori del coefficiente di attenuazione della scansione. Si tratta di un coefficiente lineare utilizzato per rappresentare quanto il fascio di raggi X viene attenuato da un oggetto⁵. Alcuni programmi ottengono queste densità e le convertono in valori in scala di grigi che vanno da 0 a 255 in un istogramma. Due valori verranno mostrati in un istogramma e sono noti come limiti di contrasto¹⁰, che devono essere impostati in modo appropriato per consentire il riconoscimento dei voxel ossei rispetto a quelli non ossei. Il valore più basso sarà normalmente impostato su un valore della scala di grigi pari a zero, mentre il valore di contrasto più alto si consiglia di impostare al 10-20% dell'attenuazione massima del materiale di interesse (osso)¹⁰. Se questo valore non è impostato in modo appropriato, possono verificarsi errori durante l'analisi, in quanto parti dei dati potrebbero essere tagliate. Di conseguenza, questo valore deve essere regolato in base al campione scansionato. La procedura consigliata consiste nel visualizzare l'istogramma su una scala logaritmica e selezionare il limite superiore come un numero leggermente più grande della fine della coda logaritmica per assicurarsi che tutti i dati ossei siano inclusi¹⁰.

Ulteriori punti per la risoluzione dei problemi si verificano durante i test e le analisi meccaniche. Durante il test e la visualizzazione delle curve forza-spostamento dopo il test, i campioni che rotolano possono essere individuati e devono essere rimossi dal set di dati, come discusso nei risultati rappresentativi. Inoltre, è necessario prestare attenzione per quanto riguarda l'orientamento dell'osso in quanto ci sono ipotesi che regolano la forma dell'osso in esame. Quando si utilizzano le equazioni di flessione di Eulero-Bernoulli per calcolare la sollecitazione e la deformazione, si presume che il campione abbia una sezione trasversale uniforme lungo la sua lunghezza³. Dato che la maggior parte delle ossa non ha una sezione trasversale uniforme, è meglio selezionare la regione più uniforme dell'osso da testare (sull'intera campata di supporto per la flessione a tre punti o tra i punti di carico per la flessione a quattro punti).

In un femore, è preferibile la prova di flessione a tre punti nell'albero centrale. A causa della delicata curvatura dell'osso, si dovrebbe eseguire il test nella direzione della curvatura per prevenire l'instabilità locale della superficie (cioè, testare il femore con la superficie anteriore in tensione). La tibia ha una forma della sezione trasversale più variabile, quindi la regione ideale da testare inizia appena prossimale alla giunzione della tibia e del perone. Se l'osso è posto con la superficie mediale in tensione, la regione dell'osso da testare è piatta e ha la minore variabilità nel raggio e nel momento d'inerzia nella direzione di flessione. È inoltre necessario prestare attenzione quando si interpretano i risultati delle prove di flessione a causa dell'ipotesi che il materiale sia isotropo, omogeneo e linearmente elastico: ciascuna di queste ipotesi viene violata in una certa misura quando si esegue il test dell'osso³. L'incapacità di Bone di adattarsi a questi presupposti porta a risultati da test di flessione che devono essere interpretati con cautela. Le proprietà che devono essere interpretate con maggiore attenzione sono quelle derivate dalla curva sforzo-deformazione oltre il punto di snervamento, poiché per definizione, il passaggio di snervamento viola l'ipotesi elastica lineare. Sebbene sia possibile normalizzare la forma dell'osso, non è consigliabile tentare di normalizzare il peso corporeo dell'animale, a meno che non vi siano differenze grossolane tra i gruppi. In questo caso, un'analisi della covarianza può essere eseguita per compensare queste differenze, ma nella maggior parte dei casi dovrebbe essere evitata la normalizzazione generale del peso corporeo.

Nonostante i problemi di risoluzione dei problemi che possono verificarsi durante questo processo, i test di flessione forniscono proprietà meccaniche che possono descrivere la suscettibilità di un osso alla frattura. Questi test sono anche relativamente semplici e veloci da eseguire. Sebbene i valori assoluti di questi test potrebbero non essere sempre completamente validi, essere in grado di rilevare le differenze relative tra i gruppi può essere abbastanza accurato per campioni di varie dimensioni e forme. Le proprietà meccaniche ottenute forniscono rilevanza funzionale negli studi in cui ci si potrebbe aspettare differenze nell'osso. Sebbene i test di rottura monotoni siano i test meccanici più comuni e facilmente accessibili, altri metodi, tra cui la durata a fatica e la tenacità alla frattura, possono rivelare ulteriori proprietà meccaniche di interesse e potrebbero essere presi in considerazione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAn	Bruker	NA	CT Scan Analysis Software
DataViewer	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Coding platform used for data analysis
NRecon	Bruker	NA	CT Scan Reconstruction software
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software	Micro Photonics Inc	SKY-016814	Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object