Automatically Generated

Summary

Механическое испытание костей грызунов является ценным методом для получения информации о восприимчивости кости к переломам. При отсутствии должного практического понимания результаты могут быть неверно интерпретированы или лишены достоверности. Этот протокол будет служить руководством для обеспечения точного выполнения механических испытаний для получения достоверных и функциональных данных.

Abstract

Хрупкость скелета, приводящая к переломам, является кризисом общественного здравоохранения в США, приводящим к 1,5 миллионам переломов каждый год и прямым расходам на лечение в размере 18 миллиардов долларов. Способность понимать механизмы, лежащие в основе заболевания костей, и реакцию на лечение является не только желательной, но и критически важной. Механическое тестирование кости служит ценным методом для понимания и количественной оценки восприимчивости кости к переломам. Несмотря на то, что этот метод кажется простым в применении, могут быть сделаны неуместные и неточные выводы, если пользователь пренебрегает руководящими допущениями и ключевыми шагами. Это наблюдается во всех дисциплинах, поскольку исследования продолжают публиковаться с неправильным использованием методов и неправильной интерпретацией результатов. Этот протокол послужит основой для изложения принципов, связанных с механическими испытаниями, а также применения этих методов – от соображений размера образца через сбор и хранение тканей до анализа и интерпретации данных. Имея на руках это, можно получить ценную информацию о восприимчивости кости к переломам, что способствует пониманию как для академических исследований, так и для клинических решений.

Introduction

Механическое исследование кости является основным методом получения функциональной информации, связанной с восприимчивостью кости к переломам. В доклинических исследованиях может быть использовано несколько методов тестирования, но наиболее распространенным является сгибание длинных костей. Эти тесты просты в выполнении и могут быть использованы на костях размером от человека до мыши. Поскольку мыши являются одними из наиболее часто изучаемых животных в доклинических исследованиях, этот протокол будет сосредоточен на тестах на изгиб, выполняемых на бедренной и большеберцовой кости мышей.

Перед проведением испытаний на изгиб кости должны быть надлежащим образом собраны и сохранены. Наиболее распространенными методами хранения традиционно являются замораживание костей в марле, пропитанной физиологическим раствором, замораживание только физиологическим раствором или обезвоживание костей в этаноле ¹. Было показано, что кости, хранящиеся в этаноле, обладают повышенной жесткостью и модулем упругости, а также сниженными параметрами деформации по сравнению с теми, которые^{хранятся в} замороженном виде. Даже регидратация костей перед тестированием не восстанавливает эти свойства до нормального уровня ¹. Хранение в солевом растворе может привести к повреждению кости, так как при расширении солевого раствора возникает давление. Кроме того, потребуется полное оттаивание раствора для удаления костей для микрокомпьютерной томографии (мкКТ). Следовательно, замораживание свежесобранных костей в марле, пропитанной солевым раствором, стало стандартным методом хранения и рекомендуется на протяжении всего этого протокола.

Поскольку размер и форма кости влияют на ее объемную прочность, а многие модели заболеваний значительно изменяют размер и морфологию кости, инженерные принципы используются для нормализации влияния размера для получения свойств, которые оценивают поведение^ткани. Этот подход требует геометрии поперечного сечения места разрушения, которая чаще всего регистрируется с помощью микроКТ для создания сканов костей перед тестированием. Микрокомпьютерная томография широко используется благодаря своей доступности и высокому разрешению изображения. Кроме того, не учитываются вклады мягких тканей, а сканирование не требует химической фиксации или других модификаций кости ^3,4. Во всех видах компьютерной томографии источник рентгеновского излучения фокусируется на объекте, в то время как детектор на другой стороне объекта измеряет результирующую энергию рентгеновского излучения. При этом образуется рентгеновская тень образца, которая может быть преобразована в изображение ^3,5. Сканируемый объект вращается (или источник рентгеновского излучения и детектор вращаются вокруг образца), генерируя изображения, которые могут быть реконструированы в трехмерный набор данных, представляющий объект⁵.

Разрешение сканирования, или то, насколько близко друг к другу могут быть разрешены два объекта по отдельности, контролируется изменением номинального размера воксела или размера пикселя в результирующем изображении. Принято считать, что объекты должны быть, по крайней мере, в два раза больше одного воксела, чтобы быть идентифицированными³, но более высокое соотношение позволит повысить точность. Кроме того, более крупные вокселы более склонны к эффектам частичного объема: когда один воксель содержит ткани различной плотности, ему присваивается среднее значение этих плотностей, а не удельная плотность одной ткани, что может привести к завышенной или заниженной оценке площадей тканей и минеральной плотности³. Хотя эти проблемы можно смягчить, выбирая вокселы меньшего размера, использование более высокого разрешения не гарантирует устранения эффектов частичного объема и может потребовать более^{длительного времени} сканирования. При сканировании костей ex vivo обычно рекомендуется использовать размер воксела 6-10 мкм для точной оценки трабекулярной архитектуры костей мыши. Больший размер воксела 10-17 мкм может быть использован для кортикальной кости, хотя следует использовать наименьший разумный размер воксела. В этом протоколе используется размер воксела 10 мкм, который достаточно мал, чтобы дифференцировать ключевые трабекулярные свойства и свести к минимуму эффекты частичного объема без длительного времени сканирования.

Кроме того, необходимо тщательно подбирать энергию рентгеновского излучения и настройки энергетического фильтра, так как высокая минеральная плотность и толщина костной ткани значительно ослабляют и изменяют спектр передаваемой рентгеновской энергии. Обычно предполагается, что, поскольку излучаемый рентгеновский спектр эквивалентен спектру, выходящему из объекта⁶, использование низкоэнергетических рентгеновских лучей на плотных объектах, таких как кость, может привести к артефакту, известному как упрочнение пучка⁷. При сканировании образцов костей рекомендуется использовать более высокое напряжение 50-70 кВ, чтобы уменьшить частоту появления этих артефактов⁵. Кроме того, установка алюминиевого или медного энергетического фильтра создает более концентрированный энергетический луч, что еще больше сводит к минимуму артефакты ^4,7. На протяжении всего протокола будет использоваться алюминиевый фильтр диаметром 0,5 мм.

Наконец, шаг поворота и длина поворота (например, 180°-360°) вместе управляют количеством получаемых изображений, что определяет количество шума в конечном сканировании⁴. Усреднение нескольких кадров на каждом шаге может уменьшить шум, но может увеличить время сканирования⁴. В этом протоколе используется шаг поворота 0,7 градуса и усреднение кадра 2.

И последнее замечание о сканировании: калибровочные фантомы гидроксиапатита следует сканировать с теми же настройками сканирования, что и экспериментальные кости, чтобы обеспечить преобразование коэффициентов затухания в минеральную плотность в г/^см35. В этом протоколе используются фантомы 0,25 г/см3 и 0,75 г/^см3 гидроксиапатита, хотя доступны и другие фантомы. Обратите внимание, что некоторые системы сканирования используют внутренние фантомы в рамках ежедневной калибровки системы.

После завершения сканирования угловые проекции реконструируются в изображения поперечного сечения объекта, как правило, с помощью прилагаемого программного обеспечения производителя. Независимо от того, какая система используется, важно убедиться в том, что при реконструкции захвачена вся кость целиком, и что пороговое значение установлено соответствующим образом, чтобы можно было распознать кость по сравнению с некостью. После реконструкции очень важно повернуть все сканы в трех измерениях, чтобы кости были ориентированы последовательно и правильно выровнены по поперечной оси, опять же с помощью программного обеспечения производителя.

После вращения области интереса (ROI) для анализа могут быть выбраны в зависимости от того, требуются ли свойства коры, трабекулярные свойства или геометрия трещины для механической нормализации. В последнем случае ROI следует выбирать после тестирования, измеряя расстояние от места перелома до одного конца кости и используя размер воксела для определения соответствующего местоположения среза в файле сканирования. Выбранная область должна быть не менее 100 мкм в длину, с точкой излома в приблизительном центре ROI, чтобы обеспечить адекватную оценку⁴.

При выбранных значениях ROI для механической нормализации (для расчета напряжения изгиба и деформации) необходимы два свойства: максимальное расстояние от нейтральной оси изгиба до поверхности, на которой возникло разрушение (предполагается, что это поверхность, нагруженная растяжением, определяемая испытательной установкой) и момент инерции площади вокруг нейтральной оси (также зависит от установки испытания). Этот протокол рекомендует использовать пользовательский код для определения этих значений. Чтобы получить доступ к коду, свяжитесь напрямую с автором, ответственным за переписку, или посетите веб-сайт лаборатории по адресу https://bbml.et.iupui.edu/ для получения дополнительной информации.

После завершения микроКТ-сканирования можно приступать к механическим испытаниям. Испытания на изгиб могут проводиться как в четырехточечной, так и в трехточечной конфигурации. Испытания на четырехточечный изгиб являются предпочтительными, так как они устраняют напряжение сдвига в кости между точками нагружения, что позволяет выполнять чистый изгиб в этой области³. Затем кость ломается из-за растяжения, создавая разрушение, которое более репрезентативно для истинных изгибающих свойств кости³. Тем не менее, кость должна быть нагружена таким образом, чтобы доставлять одинаковую нагрузку в обеих точках нагрузки (это может быть облегчено с помощью поворотной нагрузочной головки). При испытаниях на трехточечный изгиб наблюдается большое изменение напряжения сдвига в месте соприкосновения точки нагрузки с костью, что приводит к разрыву кости в этой точке из-за сдвига, а не растяжения³. Стандарты ASTM рекомендуют, чтобы материалы, подвергающиеся гибке, имели отношение длины к ширине 16:1, что означает, что длина опорного пролета должна быть в 16 раз больше, чем ширина кости, чтобы свести к минимуму удары сдвига ^8,9. Этого часто невозможно достичь при испытании небольших костей грызунов, поэтому нагруженный пролет просто делают как можно большим, но с минимальным изменением формы поперечного сечения. Более того, при выполнении четырехточечного сгибания соотношение между длинами нижнего и верхнего пролета должно быть ~3:1⁸, что обычно достигается в большеберцовой кости, но затруднительно в более короткой бедренной кости. Кроме того, более тонкие кортикальные стенки бедренных костей делают их восприимчивыми к кольцевой деформации, которая изменяет форму поперечного сечения кости во время теста (это может быть подчеркнуто в четырехточечных тестах, поскольку для индуцирования того же изгибающего момента требуется большая сила, чем при трехточечном изгибе). Таким образом, трехточечный сгиб будет использоваться для бедренной кости мыши, в то время как четырехточечный сгиб будет использоваться для большеберцовых костей на протяжении всего протокола.

Наконец, важно правильно подготовить исследование к статистическому анализу. Общая рекомендация для механических испытаний заключается в том, чтобы иметь размер выборки 10-12 костей на экспериментальную группу, чтобы иметь возможность обнаружить различия, так как некоторые механические свойства, особенно параметры после выхода из урожайности, могут сильно варьироваться. В некоторых случаях это может означать, что нужно начинать с большего размера выборки животных, учитывая отсев, который может произойти во время исследования. Анализ размера выборки с использованием существующих данных должен быть завершен до начала исследования.

Существует множество ограничений и допущений, но испытания на изгиб могут дать довольно точные результаты, особенно когда представляют интерес относительные различия между группами. Эти свойства, вместе с анализом трабекулярной архитектуры и морфологии коры головного мозга, могут дать лучшее представление о патологических состояниях и схемах лечения. Если мы внимательно относимся к тем аспектам эксперимента, которые находятся под нашим контролем (например, сбор, хранение, сканирование и тестирование), мы можем быть уверены в том, что были получены точные результаты.

Protocol

Все процедуры, описанные в этом протоколе с участием животных, были одобрены Институциональным комитетом по животным и использованию животных Школы наук Университета Индианы (IACUC) до начала процедуры. Животных, описанных в процедуре, усыпляли путем ингаляцииСО2с последующим выви…

Representative Results

По завершении компьютерной томографии большинство неадекватных снимков могут быть обнаружены при реконструкции. Часто плохие сканы имеют высокую компенсацию несоосности, которая является явным признаком ошибки во время сканирования. Однако на других этапах могут возникать ошибки, к…

Discussion

На протяжении всего процесса сканирования и тестирования бывают моменты, когда устранение неполадок и оптимизация уместны. Первый из них возникает при сканировании костей с помощью микроКТ. В то время как многие системы поставляются с держателем, в котором можно удерживать и сканиров?…

Materials

CTAn	Bruker	NA	CT Scan Analysis Software
DataViewer	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Coding platform used for data analysis
NRecon	Bruker	NA	CT Scan Reconstruction software
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software	Micro Photonics Inc	SKY-016814	Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object