Практические соображения по разработке, выполнению и интерпретации исследований, включающих испытания костей грызунов на сгибание цельных костей

Summary

Механическое испытание костей грызунов является ценным методом для получения информации о восприимчивости кости к переломам. При отсутствии должного практического понимания результаты могут быть неверно интерпретированы или лишены достоверности. Этот протокол будет служить руководством для обеспечения точного выполнения механических испытаний для получения достоверных и функциональных данных.

Abstract

Хрупкость скелета, приводящая к переломам, является кризисом общественного здравоохранения в США, приводящим к 1,5 миллионам переломов каждый год и прямым расходам на лечение в размере 18 миллиардов долларов. Способность понимать механизмы, лежащие в основе заболевания костей, и реакцию на лечение является не только желательной, но и критически важной. Механическое тестирование кости служит ценным методом для понимания и количественной оценки восприимчивости кости к переломам. Несмотря на то, что этот метод кажется простым в применении, могут быть сделаны неуместные и неточные выводы, если пользователь пренебрегает руководящими допущениями и ключевыми шагами. Это наблюдается во всех дисциплинах, поскольку исследования продолжают публиковаться с неправильным использованием методов и неправильной интерпретацией результатов. Этот протокол послужит основой для изложения принципов, связанных с механическими испытаниями, а также применения этих методов - от соображений размера образца через сбор и хранение тканей до анализа и интерпретации данных. Имея на руках это, можно получить ценную информацию о восприимчивости кости к переломам, что способствует пониманию как для академических исследований, так и для клинических решений.

Introduction

Механическое исследование кости является основным методом получения функциональной информации, связанной с восприимчивостью кости к переломам. В доклинических исследованиях может быть использовано несколько методов тестирования, но наиболее распространенным является сгибание длинных костей. Эти тесты просты в выполнении и могут быть использованы на костях размером от человека до мыши. Поскольку мыши являются одними из наиболее часто изучаемых животных в доклинических исследованиях, этот протокол будет сосредоточен на тестах на изгиб, выполняемых на бедренной и большеберцовой кости мышей.

Перед проведением испытаний на изгиб кости должны быть надлежащим образом собраны и сохранены. Наиболее распространенными методами хранения традиционно являются замораживание костей в марле, пропитанной физиологическим раствором, замораживание только физиологическим раствором или обезвоживание костей в этаноле ¹. Было показано, что кости, хранящиеся в этаноле, обладают повышенной жесткостью и модулем упругости, а также сниженными параметрами деформации по сравнению с теми, которые^{хранятся в} замороженном виде. Даже регидратация костей перед тестированием не восстанавливает эти свойства до нормального уровня ¹. Хранение в солевом растворе может привести к повреждению кости, так как при расширении солевого раствора возникает давление. Кроме того, потребуется полное оттаивание раствора для удаления костей для микрокомпьютерной томографии (мкКТ). Следовательно, замораживание свежесобранных костей в марле, пропитанной солевым раствором, стало стандартным методом хранения и рекомендуется на протяжении всего этого протокола.

Поскольку размер и форма кости влияют на ее объемную прочность, а многие модели заболеваний значительно изменяют размер и морфологию кости, инженерные принципы используются для нормализации влияния размера для получения свойств, которые оценивают поведение^ткани. Этот подход требует геометрии поперечного сечения места разрушения, которая чаще всего регистрируется с помощью микроКТ для создания сканов костей перед тестированием. Микрокомпьютерная томография широко используется благодаря своей доступности и высокому разрешению изображения. Кроме того, не учитываются вклады мягких тканей, а сканирование не требует химической фиксации или других модификаций кости ^3,4. Во всех видах компьютерной томографии источник рентгеновского излучения фокусируется на объекте, в то время как детектор на другой стороне объекта измеряет результирующую энергию рентгеновского излучения. При этом образуется рентгеновская тень образца, которая может быть преобразована в изображение ^3,5. Сканируемый объект вращается (или источник рентгеновского излучения и детектор вращаются вокруг образца), генерируя изображения, которые могут быть реконструированы в трехмерный набор данных, представляющий объект⁵.

Разрешение сканирования, или то, насколько близко друг к другу могут быть разрешены два объекта по отдельности, контролируется изменением номинального размера воксела или размера пикселя в результирующем изображении. Принято считать, что объекты должны быть, по крайней мере, в два раза больше одного воксела, чтобы быть идентифицированными³, но более высокое соотношение позволит повысить точность. Кроме того, более крупные вокселы более склонны к эффектам частичного объема: когда один воксель содержит ткани различной плотности, ему присваивается среднее значение этих плотностей, а не удельная плотность одной ткани, что может привести к завышенной или заниженной оценке площадей тканей и минеральной плотности³. Хотя эти проблемы можно смягчить, выбирая вокселы меньшего размера, использование более высокого разрешения не гарантирует устранения эффектов частичного объема и может потребовать более^{длительного времени} сканирования. При сканировании костей ex vivo обычно рекомендуется использовать размер воксела 6-10 мкм для точной оценки трабекулярной архитектуры костей мыши. Больший размер воксела 10-17 мкм может быть использован для кортикальной кости, хотя следует использовать наименьший разумный размер воксела. В этом протоколе используется размер воксела 10 мкм, который достаточно мал, чтобы дифференцировать ключевые трабекулярные свойства и свести к минимуму эффекты частичного объема без длительного времени сканирования.

Кроме того, необходимо тщательно подбирать энергию рентгеновского излучения и настройки энергетического фильтра, так как высокая минеральная плотность и толщина костной ткани значительно ослабляют и изменяют спектр передаваемой рентгеновской энергии. Обычно предполагается, что, поскольку излучаемый рентгеновский спектр эквивалентен спектру, выходящему из объекта⁶, использование низкоэнергетических рентгеновских лучей на плотных объектах, таких как кость, может привести к артефакту, известному как упрочнение пучка⁷. При сканировании образцов костей рекомендуется использовать более высокое напряжение 50-70 кВ, чтобы уменьшить частоту появления этих артефактов⁵. Кроме того, установка алюминиевого или медного энергетического фильтра создает более концентрированный энергетический луч, что еще больше сводит к минимуму артефакты ^4,7. На протяжении всего протокола будет использоваться алюминиевый фильтр диаметром 0,5 мм.

Наконец, шаг поворота и длина поворота (например, 180°-360°) вместе управляют количеством получаемых изображений, что определяет количество шума в конечном сканировании⁴. Усреднение нескольких кадров на каждом шаге может уменьшить шум, но может увеличить время сканирования⁴. В этом протоколе используется шаг поворота 0,7 градуса и усреднение кадра 2.

И последнее замечание о сканировании: калибровочные фантомы гидроксиапатита следует сканировать с теми же настройками сканирования, что и экспериментальные кости, чтобы обеспечить преобразование коэффициентов затухания в минеральную плотность в г/^см35. В этом протоколе используются фантомы 0,25 г/см3 и 0,75 г/^см3 гидроксиапатита, хотя доступны и другие фантомы. Обратите внимание, что некоторые системы сканирования используют внутренние фантомы в рамках ежедневной калибровки системы.

После завершения сканирования угловые проекции реконструируются в изображения поперечного сечения объекта, как правило, с помощью прилагаемого программного обеспечения производителя. Независимо от того, какая система используется, важно убедиться в том, что при реконструкции захвачена вся кость целиком, и что пороговое значение установлено соответствующим образом, чтобы можно было распознать кость по сравнению с некостью. После реконструкции очень важно повернуть все сканы в трех измерениях, чтобы кости были ориентированы последовательно и правильно выровнены по поперечной оси, опять же с помощью программного обеспечения производителя.

После вращения области интереса (ROI) для анализа могут быть выбраны в зависимости от того, требуются ли свойства коры, трабекулярные свойства или геометрия трещины для механической нормализации. В последнем случае ROI следует выбирать после тестирования, измеряя расстояние от места перелома до одного конца кости и используя размер воксела для определения соответствующего местоположения среза в файле сканирования. Выбранная область должна быть не менее 100 мкм в длину, с точкой излома в приблизительном центре ROI, чтобы обеспечить адекватную оценку⁴.

При выбранных значениях ROI для механической нормализации (для расчета напряжения изгиба и деформации) необходимы два свойства: максимальное расстояние от нейтральной оси изгиба до поверхности, на которой возникло разрушение (предполагается, что это поверхность, нагруженная растяжением, определяемая испытательной установкой) и момент инерции площади вокруг нейтральной оси (также зависит от установки испытания). Этот протокол рекомендует использовать пользовательский код для определения этих значений. Чтобы получить доступ к коду, свяжитесь напрямую с автором, ответственным за переписку, или посетите веб-сайт лаборатории по адресу https://bbml.et.iupui.edu/ для получения дополнительной информации.

После завершения микроКТ-сканирования можно приступать к механическим испытаниям. Испытания на изгиб могут проводиться как в четырехточечной, так и в трехточечной конфигурации. Испытания на четырехточечный изгиб являются предпочтительными, так как они устраняют напряжение сдвига в кости между точками нагружения, что позволяет выполнять чистый изгиб в этой области³. Затем кость ломается из-за растяжения, создавая разрушение, которое более репрезентативно для истинных изгибающих свойств кости³. Тем не менее, кость должна быть нагружена таким образом, чтобы доставлять одинаковую нагрузку в обеих точках нагрузки (это может быть облегчено с помощью поворотной нагрузочной головки). При испытаниях на трехточечный изгиб наблюдается большое изменение напряжения сдвига в месте соприкосновения точки нагрузки с костью, что приводит к разрыву кости в этой точке из-за сдвига, а не растяжения³. Стандарты ASTM рекомендуют, чтобы материалы, подвергающиеся гибке, имели отношение длины к ширине 16:1, что означает, что длина опорного пролета должна быть в 16 раз больше, чем ширина кости, чтобы свести к минимуму удары сдвига ^8,9. Этого часто невозможно достичь при испытании небольших костей грызунов, поэтому нагруженный пролет просто делают как можно большим, но с минимальным изменением формы поперечного сечения. Более того, при выполнении четырехточечного сгибания соотношение между длинами нижнего и верхнего пролета должно быть ~3:1⁸, что обычно достигается в большеберцовой кости, но затруднительно в более короткой бедренной кости. Кроме того, более тонкие кортикальные стенки бедренных костей делают их восприимчивыми к кольцевой деформации, которая изменяет форму поперечного сечения кости во время теста (это может быть подчеркнуто в четырехточечных тестах, поскольку для индуцирования того же изгибающего момента требуется большая сила, чем при трехточечном изгибе). Таким образом, трехточечный сгиб будет использоваться для бедренной кости мыши, в то время как четырехточечный сгиб будет использоваться для большеберцовых костей на протяжении всего протокола.

Наконец, важно правильно подготовить исследование к статистическому анализу. Общая рекомендация для механических испытаний заключается в том, чтобы иметь размер выборки 10-12 костей на экспериментальную группу, чтобы иметь возможность обнаружить различия, так как некоторые механические свойства, особенно параметры после выхода из урожайности, могут сильно варьироваться. В некоторых случаях это может означать, что нужно начинать с большего размера выборки животных, учитывая отсев, который может произойти во время исследования. Анализ размера выборки с использованием существующих данных должен быть завершен до начала исследования.

Существует множество ограничений и допущений, но испытания на изгиб могут дать довольно точные результаты, особенно когда представляют интерес относительные различия между группами. Эти свойства, вместе с анализом трабекулярной архитектуры и морфологии коры головного мозга, могут дать лучшее представление о патологических состояниях и схемах лечения. Если мы внимательно относимся к тем аспектам эксперимента, которые находятся под нашим контролем (например, сбор, хранение, сканирование и тестирование), мы можем быть уверены в том, что были получены точные результаты.

Protocol

Все процедуры, описанные в этом протоколе с участием животных, были одобрены Институциональным комитетом по животным и использованию животных Школы наук Университета Индианы (IACUC) до начала процедуры. Животных, описанных в процедуре, усыпляли путем ингаляции_СО2с последующим вывихом шейки матки в качестве вторичного средства эвтаназии.

1. Заготовка, хранение и размораживание костей

1. Сбор и хранение урожая
   1. Поместите мышь брюшной стороной вверх. С помощью скальпеля (или бритвенного лезвия, или ножниц) сделайте надрез примерно в месте соединения бедренной кости и таза с одной стороны.
   2. Продолжайте первоначальный разрез дорсально до тех пор, пока тазобедренный сустав не будет найден; Обратите внимание на головку бедренной кости, которая выглядит как маленькая белая сфера, прикрепленная к тазу.
   3. Надавливайте краем скальпеля на проксимальный край головки бедренной кости до тех пор, пока головка бедренной кости не выскочит из впадины. Иссеките лишнюю ткань, чтобы освободить заднюю конечность от остальной части туши.
   4. Изолировав заднюю конечность, разделите большеберцовую и бедренную кости, индуцируя сгибание в коленном суставе. Переместите скальпель в медиально-латеральном направлении на переднюю поверхность колена, чтобы разрезать все прилегающие ткани, включая связки между костями.
   5. Если это не разделяет кости, раздвиньте коленный сустав, чтобы обеспечить доступ к задней поверхности. Будьте осторожны, чтобы не порезать кость и не поцарапать суставной хрящ.
   6. После того, как бедренная и большеберцовая кости разделены, удалите заднюю часть стопы из большеберцовой кости, согнув сустав и используя медиально-латеральное пилящее движение на задней поверхности сустава. При необходимости раздвиньте сустав, чтобы обнажить переднюю поверхность. Будьте осторожны, чтобы не порезать кость.
   7. После изоляции очистите кости от всех прилипших мягких тканей. При выполнении тестов на четырехточечный изгиб большеберцовой кости также удалите малоберцовую кость. Малоберцовая кость соединена связками на проксимальном конце, но срастается с большеберцовой костью около дистального конца кости. Используйте острые ножницы рядом с местом соединения, чтобы отделить малоберцовую кость.
   8. Изолированные и очищенные кости заверните отдельно в марлю, пропитанную физиологическим раствором, и храните их при температуре -20 °C. Делайте это сразу после сбора урожая.
   9. Повторите шаги с 1.1.1 по 1.1.8 для другой стороны туши.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если при попытке разделить кости на шагах 1.1.4-1.1.6 возникает сопротивление, лучше повторить шаги, а не пытаться разъединить кости. Резкие движения могут привести к повреждению или перелому костей.
2. Таяние
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество циклов замораживания-оттаивания кости должно быть сведено к минимуму, так как чрезмерные циклы замораживания-оттаивания могут пагубно повлиять на механические свойства кости. Частичное размораживание для микроКТ-сканирования может быть достигнуто путем оставления кости при комнатной температуре на 5-10 минут. Полностью оттаивайте кость только при выполнении испытаний на изгиб, как описано ниже.
   1. Предпочтителен ночной оттепель
      1. Переместите кости из температуры хранения -20 °C в температуру 1-4 °C в холодильную камеру или холодильник. Перед тестированием убедитесь, что кости остаются там в течение 8-12 часов, чтобы полностью оттаять.
   2. Быстрое оттаивание
      1. Установите температуру ванны примерно на 37 °C. Как только эта температура нагреется, добавьте кости в ванну.
      2. Оставьте кости в ванне примерно на 1 час.

2. Сканирование микрокомпьютерной томографии

1. Перед сканированием оберните кости парапленкой, чтобы поддерживать гидратацию. Держите все остальные кости на льду в ожидании сканирования.
2. После того, как кость будет обернута в парапленку, поместите ее в держатель для взаимодействия со сканером. Убедитесь, что все отсканированные кости выровнены в одной и той же ориентации, так как последовательное выравнивание упростит поворот на более поздних этапах анализа.
3. Отрегулируйте параметры сканирования в соответствии с приложением сканирования. Для костей мыши рекомендуются следующие общие настройки сканирования: разрешение/размер воксела: 10 мкм; Размер пикселя: средний, 2000 x 1048; фильтр: алюминий 0,5 мм; шаг вращения: 0,7; Усреднение кадров: 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки могут отличаться в зависимости от системы, используемой для сканирования, поэтому при необходимости следует обращаться к руководству производителя и пользователя.
4. После включения источника рентгеновского излучения выполните коррекцию плоского поля, чтобы свести к минимуму артефакты. Для этого сначала убедитесь, что камера пуста и выключите ровное поле.
5. Измерьте среднюю интенсивность поля и отрегулируйте ее до 60%. При достижении 60% обновите плоское поле и снова включите его.
6. Убедитесь, что средняя интенсивность сейчас (86-88%).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс может варьироваться в зависимости от используемой системы μCT. Обратитесь к руководству пользователя, прежде чем приступать к процессу.
7. После успешного выполнения коррекции плоского поля поместите держатель в камеру. Убедитесь, что образцы отцентрированы и выровнены, прежде чем помещать пьедестал в камеру.
8. После того, как пьедестал будет закреплен, закройте камеру, убедитесь, что вся кость будет захвачена при сканировании (может потребоваться вид разведчика), и начните сканирование.
9. После сканирования повторно храните кости в марле, пропитанной физиологическим раствором, при температуре -20 °C.

3. Реконструкция микроКТ

1. Выберите ROI, который позволит охватить всю кость при реконструкции. Для этого просмотрите наибольшее поперечное сечение кости и определите ROI на основе этого сечения.
2. Установите пороговое значение программного обеспечения, чтобы обеспечить правильное распознавание кости по сравнению с некостью. Для этого используется гистограмма, в которой нижнее ограничение установлено равным 0, а верхнее ограничение установлено в конце данных пиковой гистограммы.
3. Установите дополнительные параметры, включая уменьшение кольцевых артефактов и упрочнение луча, на 5 и 20% соответственно. Убедитесь, что компенсация перекоса находится в диапазоне от -7 до 7. Эти значения могут варьироваться в зависимости от программного обеспечения. Перед началом реконструкции убедитесь, что они сверены с руководством пользователя и инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Артефакты могут быть сведены к минимуму во время реконструкции с помощью поправок на упрочнение балки, кольцевые артефакты и компенсацию несоосности. Компенсация несоосности может выступать в качестве индикатора качества сканирования, и если она выходит за пределы диапазона, указанного производителем, сканирование необходимо повторить. Однако настройки реконструкции будут зависеть от программного обеспечения, и следует обратиться к руководству пользователя.

4. Вращение мкКТ

ПРИМЕЧАНИЕ: После реконструкции сканы необходимо поворачивать, чтобы установить последовательную ориентацию по всем костям и гарантировать, что поперечные срезы полученной кости взяты перпендикулярно продольной оси с минимально возможным углом смещения. Это должно быть сделано с помощью программного обеспечения по выбору пользователя.

1. Ротация бедренной кости
   1. Поверните бедренную кость так, чтобы все кости имели одинаковую продольную ориентацию. Например, сориентируйте все кости так, чтобы проксимальный конец кости находился в верхней части снимка.
   2. Поверните кость так, чтобы ориентация поперечного сечения всех костей была одинаковой. Например, поверните кости так, чтобы передняя сторона всегда была справа от снимков.
   3. После того, как эти настройки будут выполнены, выпрямите скан, чтобы обеспечить симметрию относительно центральной оси.
   4. Сохраните повернутый набор данных.
2. Ротация большеберцовой кости
   1. Повторите шаги 4.1.1-4.1.4 для большеберцовой кости.

5. Процедура механических испытаний

1. Подготовка
   1. Перед механическим испытанием убедитесь, что получен и реконструирован микроКТ-снимок с разрешением 6–10 мкм, чтобы убедиться в том, что для каждого образца получено качественное сканирование для расчета геометрии поперечного сечения в месте разрушения (разделы 2–3).
   2. После получения и проверки сканов разморозьте все кости перед исследованием (раздел 1). Протестируйте все кости из одного эксперимента в один и тот же день и рандомизируйте порядок тестирования, чтобы свести к минимуму систематическую ошибку пользователя и вариативность системы в разных выборках и экспериментальных группах. Следите за тем, чтобы кости оставались увлажненными на протяжении всего процесса тестирования.
2. Настройка аппарата
   1. Найдите тензодатчик с соответствующей чувствительностью и грузоподъемностью для образца. Рассмотрите ожидаемый диапазон разрушения образца и выберите тензодатчик с примерно на 50% большей грузоподъемностью при максимальной чувствительности (например, тензодатчик 10 фунтов-сил с грузоподъемностью 45 Н для мышиной кости в диапазоне отказа 0-25 Н).
   2. Найдите нагрузочные и опорные крепления пролетных строений.
   3. Установите тензодатчик и приспособления, как показано на рисунке 1, прикрутив тензодатчик к верхней или нижней опоре тестера, верхнее нагрузочное приспособление к тензодатчику, а нижнее приспособление к нижней опоре тестера. Обеспечьте надежную посадку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении испытаний на изгиб обычно рекомендуется прикреплять тензодатчик к верхнему приспособлению, чтобы избежать контакта жидкости с тензодатчиком, но при необходимости можно использовать нижнюю часть.
   4. После установки тензодатчика и приспособлений выберите длину опорного пролета и убедитесь, что она остается постоянной для всех испытуемых образцов. Чтобы выбрать расстояние между опорами, сначала найдите самую короткую кость в выборочном наборе.
   5. Сориентируйте кость между приспособлениями, как показано на рисунке 2.
   6. Для трехточечного сгибания бедренной кости следуйте рисунку 2А. Убедитесь, что передняя поверхность кости прилегает к опорному пролету, а область пролета находится в пределах диафиза образца. Избегайте включения третьего вертела на проксимальном конце и переходной точки, где кость расширяется в метафиз и мыщелки на дистальном конце.
   7. При четырехточечном изгибе убедитесь, что опорные и грузовые пролеты выровнены и отцентрированы друг относительно друга. Следуйте рисунку 2B , чтобы загрузить кость в приспособления.
      1. Установите длину опорного и погрузочного пролетов в соответствии с соотношением³:1 8 (например, пролет опоры 9 мм и погрузочный пролет 3 мм).
      2. Для большеберцовой кости нагружайте медиальную поверхность кости на опорный пролет одной опорой в месте соединения большеберцовой и малоберцовой костей. Другая опора, скорее всего, будет расположена сразу после большеберцового гребня. Убедитесь, что нагружающий пролет, расположенный по центру опорного пролета, содержит однородную область кости.
   8. Измерьте расстояние пролета опоры при выполнении трехточечной гибки и расстояния между нагрузкой и пролетом опоры при выполнении 4-точечного гибки и запишите эти расстояния. Убедитесь, что это значение записано от центра точек нагружения как для измерения нагрузки, так и для измерения пролета опоры.
   9. Поместите кость обратно в физиологический раствор или регидратируйте с помощью болюса физиологического раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе точек для нагруженного пролета рекомендуется использовать круглые точки (радиуса 0,75 мм достаточно, так как он распределяет нагрузку, а также контактирует с костью по касательной окружности). В то время как теория рекомендует использовать лезвие ножа для представления точечной нагрузки, это раздавит кость в точке приложения нагрузки, что приведет к переоценке деформации и недооценке модуля.
   10. Убедитесь, что все части приспособления плотно затянуты и свободны от движения.
3. Настройка программного обеспечения
   1. Убедитесь, что тестер правильно подключен к компьютеру через модульную коробку, каналы тензодатчика и любые другие требования в соответствии с руководством по эксплуатации системы.
   2. В программном обеспечении, связанном с механическим тестером, создайте профиль испытания на изгиб с рампой, которая имеет достаточно низкую скорость смещения , чтобы не вызвать вязкоупругие эффекты (часто используется 0,025 мм/с ) для нагружения кости до разрушения.
   3. При создании профиля тестирования также рекомендуется использовать минимальную частоту дискретизации 25 Гц, хотя предпочтительнее более высокая частота дискретизации.
   4. Создайте по одной папке для каждой учебной группы и сохраните каждый тест в виде отдельного файла в этой папке.
4. Загрузка и тестирование образцов
   1. Выберите правильно размороженную кость (см. шаг 1.2). Измерьте и запишите его полную длину штангенциркулем.
   2. Загрузите образец на приспособления, как показано на рисунке 2A при испытании бедренной кости при трехточечном сгибании и на рисунке 2B при испытании большеберцовой кости при четырехточечном сгибании.
   3. Измените имя файла в соответствии с тестируемым образцом.
   4. Обнулите нагрузку (не смещение). Включите движитель системы; Убедитесь, что он не находится под контролем нагрузки или смещения.
   5. Соблюдая осторожность, прикладывайте минимальную предварительную нагрузку к кости, чтобы зафиксировать ее положение и предотвратить скатывание кости, но убедиться, что она не скомпрометирует образец. Стремитесь к преднатягу примерно 0,25 Н. Прежде чем продолжить, убедитесь, что желаемая ориентация кости сохраняется.
   6. Увлажните образец, обильно облив его физиологическим раствором.
   7. Начните испытание на изгиб, выбрав в программном обеспечении « Пуск» или «Выполнить ». КРИТИЧЕСКИЙ: Внимательно следите за образцом на протяжении всего испытания и отмечайте тесты, в которых возникали какие-либо проблемы (например, качение, скольжение).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти проблемы могут скомпрометировать данные, и примечания об этих тестах будут полезны во время анализа.
   8. Следите за тем, чтобы кость не начала ломаться (со стороны растяжения). Большинство тестов будут продолжаться до тех пор, пока не произойдет сбой. На этом этапе тест завершится из-за запрограммированных пределов. Если произошел сбой, но тестер продолжает смещаться, остановите испытание вручную, чтобы предотвратить повреждение тензодатчика.
   9. После завершения тестирования измерьте длину от дистального конца до точки разрыва штангенциркулем и запишите ее.
   10. Повторите шаги 5.4.1 – 5.4.9 для каждого образца.

Рисунок 1: Настройка механического тестера. (A) Испытания на трехточечный и (B) четырехточечный изгиб. Тензодатчик показан желтым цветом, нагрузочные приспособления - синим, а опорные приспособления - зеленым. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Ориентация костей между приспособлениями . (A) Правильная ориентация бедренной кости в трехточечных изгибающих нагрузочных приспособлениях, показывающих (сверху вниз) виды с медиальной, передней и задней сторон бедренной кости при правильном положении. Загрузочные приспособления показаны оранжевым цветом, а опорные приспособления - синим. Нижние пролеты должны быть отрегулированы таким образом, чтобы охватить как можно большую часть самой прямой части диафиза, а верхнее приспособление должно быть расположено по центру между этими пролетами. (B) Правильная ориентация большеберцовой кости для четырехточечного сгибания, показывающая (сверху вниз) виды с передней, боковой и медиальной сторон большеберцовой кости. Кость должна быть нагружена таким образом, чтобы медиальная поверхность соприкасалась с нижним приспособлением, а боковая поверхность соприкасалась с верхним приспособлением. Соединение большеберцовой и малоберцовой костей должно быть расположено непосредственно за пределами нагружающего пролета. Пролеты должны быть отрегулированы таким образом, чтобы наилучшим образом соответствовать соотношению нагрузки к опорному пролету 1:3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

6. Выбор ROI

1. Записав длину перерыва, загрузите повернутые изображения в выбранное пользователем программное обеспечение. После загрузки повернутых изображений найдите и запишите верхний и нижний срезы кости.
2. Вычислите разницу между верхним и нижним срезами. Умножьте это значение на размер сканирующего воксела, чтобы определить общую длину кости в микрометрах.
3. Чтобы определить местоположение перелома на КТ-снимке, разделите записанную длину разрыва (в микрометрах) на размер воксела, чтобы получить количество срезов мкКТ от дистального конца снимка до точки разрыва.
4. Выберите рентабельность инвестиций с центром в этом месте. Сначала установите общую желаемую длину ROI (не менее 100 мкм). Найдите количество срезов, представляемых этой длиной, разделив длину в микрометрах на размер воксела, чтобы определить общее количество срезов в ROI.
5. Чтобы получить нижнюю границу ROI, разделите общее количество срезов ROI на 2 и вычтите это значение из ранее рассчитанного местоположения границы, найденного на шаге 6.4.
6. Прибавьте общую длину ROI в срезах к ранее рассчитанному значению, чтобы получить верхнюю границу ROI.
7. Выберите подходящую рентабельность инвестиций на основе рассчитанных границ и сохраните ее.

7. Нормализация данных о силе и перемещении

ПРИМЕЧАНИЕ: Механический тестер генерирует только точки с координатами x и y (смещение, сила). Эти точки могут быть преобразованы в напряжение и деформацию с помощью уравнений напряжения и деформации изгиба Эйлера-Бернулли, но для этого требуются геометрические свойства, полученные с помощью мкКТ-сканирования. Количественная оценка этих свойств может быть выполнена с помощью предпочитаемого пользователем программного обеспечения. Мы предпочитаем пользовательский код, который дает полный контроль над всеми входами, вычислениями и выходами. Как упоминалось ранее, для получения доступа к коду свяжитесь напрямую с автором, ответственным за переписку, или посетите веб-сайт лаборатории по адресу https://bbml.et.iupui.edu/ для получения дополнительной информации. Уравнения напряжения и деформации, а также необходимые геометрические свойства, которые должны быть получены с помощью микроКТ-сканирования для их расчета, обсуждаются ниже.

1. Уравнения нормализации трехточечного изгиба
   1. Уравнение, используемое для расчета напряжений при трехточечном изгибе, показано ниже в уравнении 1. В этом уравнении «F» представляет силу, а «L» — длину опорного пролета. Значения силы регистрируются механическим тестером во время испытания. Перед тестированием убедитесь, что длина пролета опоры записана. «c» и «I» — геометрические свойства, которые будут рассчитаны с помощью микрокомпьютерной томографии (раздел 7.3).
      (1)
   2. Уравнение для расчета деформации показано ниже в уравнении 2; "c" и "L" представляют одни и те же свойства как для расчета напряжений, так и для расчетов деформации. "d" означает значения перемещения, регистрируемые механическим тестером во время испытаний.
      (2) См.
2. Уравнения нормализации четырехточечного изгиба
   1. Уравнение напряжения при четырехточечном изгибе показано ниже в уравнении 3. "F" и "I" остаются теми же переменными, которые обсуждались в шаге 7.1.1. Вычислите «а» на основе измерений опоры и нагруженного пролета перед испытанием. При соблюдении рекомендуемого соотношения 3:1 для опоры к нагруженному пролету для четырехточечного изгиба, «a» будет составлять одну треть длины пролета опоры.
      (3) См.
   2. Уравнение для деформации при четырехточечном изгибе показано ниже в уравнении 4. «c» и «a» означают одни и те же свойства как для расчета напряжений, так и для расчетов деформации. "d" означает значения перемещения, зарегистрированные механическим тестером во время испытаний.
      (4) См.
3. Расчет геометрических свойств по микроКТ-сканам
   1. Переменная "c" представляет собой расстояние от нейтральной оси до поверхности кости, которая была нагружена при растяжении. Следовательно, определите центроид каждого поперечного сечения при сканировании μCT, так как нейтральная ось проходит через центроид.
      1. При соблюдении испытательной ориентации бедренной кости при трехточечном изгибе, описанной в шаге 5.2.6, измерьте «c» по отношению к передней поверхности.
      2. Если вы следуете ориентации большеберцовой кости, описанной в шаге 5.2.7, измерьте «c» по отношению к медиальной поверхности кости.
   2. Переменная "I" представляет собой момент инерции площади вокруг оси сгибания (медиально-латеральная ось для бедренной кости; передне-задняя ось для большеберцовой кости). Рассчитайте это значение, используя уравнение 5. В этом уравнении «dA» — это площадь каждого пикселя, захваченного при сканировании μCT, а y — вычисленное расстояние каждого пикселя от нейтральной оси.
      (5) См.

8. Интересующие свойства механических испытаний

1. Прежде чем рассчитывать какие-либо механические свойства, постройте кривую силы-перемещения и кривую напряжения-деформации (идеальные кривые, показанные ниже на рисунке 3, вместе со значимыми свойствами).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тестирование биологических образцов не всегда приводит к получению кривых, похожих на эти идеализированные примеры, но они остаются полезным руководством.
2. Изучите эти кривые перед анализом, чтобы выявить ошибки при тестировании, такие как перекатывание или скольжение кости. Эти ошибки обычно приводят к появлению неровностей или плоских областей в начальной линейной части кривой. На этом этапе удалите лишние данные, включая любые данные, которые могли быть собраны до того, как тестер контактировал с костью, или данные после отказа.
3. Убедившись в проверке качества с помощью построенных кривых, приступайте к анализу значимых свойств.
   1. Жесткость и модуль упругости
      1. Рассчитайте жесткость, используя только упругую область кривой сила-перемещение. Наклон кривой в этой области является жесткостью.
      2. Рассчитайте модуль упругости, используя наклон только упругой части кривой зависимости напряжения от деформации.
   2. Предел текучести
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует две точки текучести, одна на кривой силы-перемещения, а другая на кривой напряжения-деформации. Значения (x,y) для этой точки кривой сила-смещение известны как смещение к текучести и сила текучести, в то время как значения кривой напряжения-деформации известны как деформация к текучести и предел текучести. Эти точки представляют собой конец упругой области кривой и могут быть найдены способами, перечисленными ниже.
      1. Метод кривой зависимости напряжения от деформации: Вычислите смещение линии от (0,0) на 0,2% деформации (2 000 микродеформаций), но с тем же наклоном, что и модуль упругости. Постройте эту линию на графике зависимости напряжения от деформации; Положение, в котором эта линия пересекает кривую зависимости напряжения от деформации, определяется как предел текучести. Используйте эту координату предела текучести и деформации, чтобы найти аналогичные значения силы и перемещения; Эти значения будут представлять силу текучести и смещение для значений текучести.
      2. Секущий метод: Рассчитайте жесткость по кривой сила-перемещение и уменьшите жесткость на выбранный процент (5-10%). Постройте линию, начинающуюся в точке (0,0) с наклоном этой уменьшенной жесткости, и дайте ей пересечься с кривой силы-перемещения. Точка пересечения будет иметь координаты (смещение к текучести, сила текучести).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Секущий метод может быть использован для определения предела текучести без данных о напряжении и деформации.
   3. Предельная сила и предельное напряжение
      1. Рассчитайте предельную силу и предельное напряжение, найдя максимальное значение в соответствующих наборах данных.
   4. Свойства смещения и деформации
      1. Значения смещения для текучести и деформации для предела текучести, представляющие смещение или деформацию до предела текучести. Чтобы найти их, найдите доходность, как описано в шаге 8.3.2.
      2. Значения полного смещения и полной деформации представляют собой общее смещение или общую деформацию, испытываемую образцом на протяжении всего испытания, и соответствуют точке разрушения.
      3. Вытеснение после выемки и деформация после выемки: Обычно сообщается о смещении после выхода урожая, которое может быть рассчитано путем вычитания смещения в текучесть из общего смещения. Рассчитайте деформацию после предела текучести путем вычитания деформации для текучести из общей деформации, но сообщайте об этом с осторожностью, так как деформация сначала определяется в предположении, что материал является линейно упругим (предварительная текучесть). Это делает меру postyield недействительной.
   5. Энергетические свойства
      1. Рассчитайте энергию как площадь под кривой силы-перемещения или кривой напряжения-деформации.
      2. Площадь под кривой сила-перемещение известна как работа. Площадь, рассчитанная под предварительным участком кривой, или упругой областью, известна как упругая работа или энергия. Площадь, вычисленная по кривой за пределом текучести, или пластической областью, известна как послетекучая или пластическая работа, или потерянная энергия.
      3. Вычисленная общая площадь под кривой зависимости напряжения от деформации известна как ударная вязкость или модуль ударной вязкости, а площадь, рассчитанная по кривой напряжения-деформации до предела текучести, известна как упругость. Ударная вязкость после текучести, как и деформация после текучести, часто не сообщается из-за допущений уравнений деформации, которым это свойство не подпадает.

Рисунок 3: Кривые сила-перемещение и напряжение-деформация. (А) Идеальная кривая сила-перемещение; (B) идеальная кривая зависимости напряжения от деформации с линией, полученной из метода смещения 0,2%, используемого для расчета предела текучести, показанного красным цветом (обратите внимание, что эта линия имеет тот же наклон, что и упругая область кривой). Ключевые свойства, которые могут быть получены из кривой сила-перемещение, включают силу текучести, предельную силу, смещение до предела текучести, полное смещение и работу. Свойства на тканевом уровне, которые могут быть получены из кривой зависимости напряжения от деформации, включают предел текучести, предельное напряжение, деформацию до предела текучести, общую деформацию, упругость и ударную вязкость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Representative Results

По завершении компьютерной томографии большинство неадекватных снимков могут быть обнаружены при реконструкции. Часто плохие сканы имеют высокую компенсацию несоосности, которая является явным признаком ошибки во время сканирования. Однако на других этапах могут возникать ошибки, которые также могут привести к неточным данным. Эти ошибки часто можно заметить при изучении отдельных рассчитанных архитектурных свойств. Если значения сильно выходят за пределы диапазона других значений в группе, следует пересмотреть сканирование, окупаемость инвестиций и метод расчета свойств.

После завершения испытаний на изгиб следует изучить графики «сила-перемещение» из каждого испытания, чтобы выявить неудовлетворительные испытания, которые, возможно, потребуется удалить из набора данных. Пример проблемного теста показан на рисунке 4. На графике на рисунке 4А показаны результаты правильно проведенного испытания на изгиб. Существует четкая линейная область, в которой отсутствует схождение с малым уклоном, предел текучести, предельная точка (максимальная сила), падение силы по мере того, как смещение выходит за пределы максимальной силы, и точка разрушения. Кривая плавная, без резких изменений нагрузки до тех пор, пока не будет достигнута конечная точка. Следовательно, свойства, полученные в результате этого теста, могут быть легко идентифицированы и им можно доверять. На графике, показанном на рисунке 4B , показан результат испытания на изгиб с несколькими подозрительными элементами. Резкие изменения нагрузки и появление нескольких пиков на графике являются основными индикаторами проблем с этим тестом. В то время как незначительные пики могут возникать при правильном испытании вблизи предельной силы, величина и количество пиков на этом графике позволяют предположить, что кость могла скатиться во время испытания. Независимо от того, наблюдаются ли и отмечаются во время испытания или при изучении тестов перед анализом, данные образца должны быть исследованы во время посттестового анализа. Если данные действительно ошибочны или выходят далеко за пределы диапазона других выборок в группе, было бы идеально не включать этот тест в окончательный набор данных. Это одна из причин, по которой эксперимент должен быть правильно дополнен априорными степенными вычислениями. Возможно, можно сообщить только об определенных свойствах из образца (в этом случае допустимыми могут быть свойства preyield), но это не идеальный вариант и должно быть четко объяснено при сообщении.

Рисунок 4: Графики «сила-перемещение». (A) График идеальной силы-перемещения. (B) График зависимости силы от смещения, полученный в результате плохого испытания на изгиб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Изучив все графики «сила-перемещение» и нормализовав значения по напряжению-деформации, можно идентифицировать и продемонстрировать интересующие свойства несколькими способами. На рисунке 5 показаны результирующие графики «сила-перемещение» и «напряжение-деформация» для всего исследования. Это схематические изображения, с помощью которых определяются сила и смещение в начальной точке (0,0), предел текучести, конечная точка и разрушение для каждой кости, а затем сила/напряжение и смещение/деформация усредняются, чтобы получить средний график для каждой группы. Графики не используются для статистического анализа, но они могут быть использованы для демонстрации того, как меняется общее поведение в зависимости от таких факторов, как лечение или состояние болезни. Графики, показанные на рисунке 5, взяты из исследования, в котором сравнивали контрольных мышей с мышами с диабетом 2 типа и хронической болезнью почек (СД2-ХБП). Правые голени этих животных были испытаны до отказа с использованием четырехточечного изгиба и проанализированы для получения свойств, обсуждаемых в разделе 8 протокола. Из рисунка 5 видно, что группа СД2-ХБП имела сниженные механические свойства, включая прочность и жесткость, как на структурном, так и на тканевом уровнях. Эти мыши также, по-видимому, имеют сниженные послеурожайные свойства, что является показателем хрупкости. Эти графики не должны использоваться для того, чтобы сделать окончательные выводы из исследования. Скорее, они действуют как визуальное представление и должны быть проверены путем выполнения статистического анализа всех интересующих свойств.

Рисунок 5: Графики «сила-смещение» и «напряжение-деформация» для всего исследования . (A) График силового смещения для контрольных животных и животных с диабетом 2 типа и хронической болезнью почек. Этот график был получен путем усреднения силы текучести, смещения к пределу текучести, предельной силы, предельного смещения, силы разрушения и полного смещения для каждой группы и построения графика этих средних значений вместе со стандартным отклонением. (Б) Стресс-деформация у контрольных животных и животных с СД2-ХБП. Этот график получен путем усреднения предела текучести, деформации до предела текучести, предельного напряжения, предельной деформации, напряжения разрушения и общей деформации и построения графика результирующих средних значений вместе со стандартным отклонением. Аббревиатура: СД2-ХБП = животные, страдающие диабетом 2 типа и хронической болезнью почек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Механические данные и результаты двустороннего t-критерия приведены в таблице I. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартного отклонения. Общее обследование позволяет получить данные в надлежащих пределах и с ожидаемыми уровнями вариабельности. Обратите внимание, что свойства после получения дохода, как правило, имеют наибольшую вариативность и, следовательно, часто требуют наибольшего размера выборки для обнаружения значимых различий. Как видно из схематических кривых на рисунке 5, наблюдается значительное снижение почти всех структурных и тканевых механических свойств. Из этих данных можно сделать вывод, что индуцированное болезненное состояние привело к тому, что кости стали более слабыми, менее жесткими и более восприимчивыми к переломам из-за потери деформируемости и снижения ударной вязкости. Исследования с более тонкими сравнениями могут быть не так просты для интерпретации. В качестве примера можно привести ситуацию, когда наблюдаются значительные улучшения механических свойств на структурном уровне, но не на уровне тканей. В этом случае наблюдаемые эффекты, скорее всего, обусловлены изменениями в архитектуре кости (например, увеличение площади, увеличение толщины кортикального слоя), а не улучшением качества кости на тканевом уровне. Например, площадь кости увеличилась из-за увеличения тканой кости, но качество ткани ухудшилось, так как теперь присутствует неорганизованная тканая кость, а не организованная пластинчатая кость. Это может быть подтверждено анализом μCT, в котором могут наблюдаться статистически значимые улучшения в архитектуре. В противоположность этому, могут наблюдаться значительные улучшения механических свойств на тканевом уровне при минимальных улучшениях механических свойств на структурном уровне или без них. Такое высокое качество тканей может маскировать подводные камни небольших костей. Интерпретация данных может стать еще более запутанной, если изменения наблюдаются в свойствах до выхода урожая, но не наблюдаются в свойствах после получения урожая, или наоборот. В первом случае способность кости сопротивляться деформации может быть улучшена, в то время как ее способность переносить повреждения – нет. В каждом из этих случаев возможность ссылаться на архитектурные свойства на основе анализа μCT очень полезна и должна быть использована (хотя описание этого метода выходит за рамки данной статьи). Из-за сложности интерпретации этих свойств представление всех свойств в виде таблицы или рисунка (а не только тех свойств, которые легче всего интерпретировать, таких как предельная сила или которые рассказывают историю, которую вы хотите рассказать), позволяет получить более полное представление о механических воздействиях.

			Контроль	Т2Д-ХБП	Значение P
Сила текучести (Н)			19,7 ± 2,9	15.2 ± 2.6	0.0032**
Абсолютная сила (N)			22.8 ± 3	17,6 ± 3,4	0.0031**
Смещение к текучести (мкм)			205 ± 17	190 ± 21	0.1039
Вытеснение после текучести (мкм)			246 ± 235	60 ± 51	0.0435*
Общее смещение (мкм)			451 ± 230	249 ± 53	0.0278*
Жесткость (Н/мм)			110 ± 10	91 ±13	0.0037**
Производительность работы (мДж)			2,16 ± 0,45	1,54 ± 0,36	0.0055**
Последоходная работа (мДж)			4.24 ± 3.01	1,04 ± 0,9	0.0109*
Общая работа (мДж)			6.4 ± 2.88	2,58 ± 0,97	0.0025**
Предел текучести (МПа)			180 ± 20	157 ± 25	0.0504
Предельное напряжение (МПа)			209 ±26	181 ±27	0.0434*
Деформация до текучести (mɛ)			16.8 ± 2	16.4 ± 1.5	0.5771
Общая деформация (мɛ)			36,6 ± 17,2	21,5 ± 4,3	0.0277*
Модуль упругости (ГПа)			12.2 ± 1.1	10.9 ± 1.1	0.0171*
Упругость (МПа)			1,62 ± 0,33	1,38 ± 0,33	0.1377
Ударная вязкость (МПа)			4,85 ± 2,29	2,26 ± 0,73	0.0076**

Таблица 1: Результаты механических испытаний и статистического анализа. Значения отображаются в виде среднего ± стандартного отклонения. Значения P являются результатом двустороннего непарного t-критерия. * P < 0,05 и ** P < 0,01. Аббревиатура: СД2-ХБП = животные, страдающие диабетом 2 типа и хронической болезнью почек.

Discussion

На протяжении всего процесса сканирования и тестирования бывают моменты, когда устранение неполадок и оптимизация уместны. Первый из них возникает при сканировании костей с помощью микроКТ. В то время как многие системы поставляются с держателем, в котором можно удерживать и сканировать один объект, пользовательские держатели могут быть изготовлены для одновременного сканирования нескольких костей. Сканирование нескольких костей может быть отличной точкой для оптимизации, но следует соблюдать осторожность на протяжении всего процесса сканирования и анализа, чтобы убедиться, что артефакты не вызываются. Поскольку рентгеновские лучи проходят через различное количество костной ткани (и ослабляются ею) при каждом угловом приращении, это может привести к неточности в результирующих данных.

Второй момент для поиска и устранения неисправностей связан с реконструкцией сканов. В зависимости от используемой программы, пользователь может определить окно плотности для реконструкции, рассчитанное по значениям коэффициента затухания скана. Это линейный коэффициент, используемый для представления того, насколько рентгеновский луч ослаблен объектом⁵. Некоторые программы получают эти плотности и преобразуют их в значения оттенков серого в диапазоне от 0 до 255 на гистограмме. Два значения будут показаны на гистограмме и известны как пределы контрастности¹⁰, которые должны быть установлены соответствующим образом, чтобы обеспечить распознавание костных и некостных вокселей. Более низкое значение, как правило, устанавливается равным нулю по шкале серого, в то время как более высокое значение контрастности рекомендуется устанавливать на уровне 10-20% от максимального затухания интересующего материала (кости)¹⁰. Если это значение установлено неправильно, в анализе могут возникнуть ошибки, так как части данных могут быть обрезаны. Следовательно, это значение необходимо корректировать в зависимости от образца, который был отсканирован. Рекомендуется просмотреть гистограмму в логарифмической шкале и выбрать верхний предел в виде числа, которое немного больше, чем конец логарифмического хвоста, чтобы убедиться, что все данные о костях включены¹⁰.

Дополнительные моменты для поиска и устранения неисправностей возникают во время механических испытаний и анализа. Во время тестирования и просмотра кривых «сила-перемещение» после испытания могут быть обнаружены примеры, которые прокатились, и их следует удалить из набора данных, как описано в репрезентативных результатах. Кроме того, следует проявлять осторожность в отношении ориентации кости, так как существуют предположения, регулирующие форму тестируемой кости. При использовании уравнений изгиба Эйлера-Бернулли для расчета напряжений и деформаций предполагается, что образец имеет однородное поперечное сечение по длине³. Учитывая, что большинство костей не имеют равномерного поперечного сечения, лучше всего выбрать наиболее однородную область кости для испытания (по всему пролету опоры для трехточечного изгиба или между точками нагружения для четырехточечного сгибания).

В бедренной кости предпочтительны испытания на трехточечный изгиб в средней части вала. Из-за мягкого искривления кости следует проводить испытания в направлении искривления, чтобы предотвратить локальное изгиб поверхности (т.е. испытание бедренной кости с натяжением передней поверхности). Большеберцовая кость имеет более изменчивую форму поперечного сечения, поэтому идеальная область для исследования начинается проксимальнее места соединения большеберцовой и малоберцовой костей. Если кость располагается с медиальной поверхностью в натяжении, то испытуемая область кости плоская и имеет наименьшую вариабельность по радиусу и моменту инерции в направлении изгиба. Следует также проявлять осторожность при интерпретации результатов испытаний на изгиб из-за предположения, что материал изотропен, однороден и линейно упруг – каждое из этих предположений в той или иной степени нарушается при испытании кости³. Неспособность Боуна соответствовать этим предположениям приводит к результатам испытаний на изгиб, которые следует интерпретировать с осторожностью. Свойства, которые должны интерпретироваться наиболее тщательно, - это свойства, полученные из кривой зависимости напряжения от деформации после предела текучести, поскольку по определению переходящий предел текучести нарушает предположение о линейной упругости. Несмотря на то, что нормализация формы кости может быть выполнена, не рекомендуется пытаться нормализовать массу тела животного, если нет серьезных различий между группами. В этом случае для компенсации этих различий может быть проведен ковариационный анализ, но в большинстве случаев следует избегать общей нормализации массы тела.

Несмотря на проблемы с поиском и устранением неисправностей, которые могут возникнуть в ходе этого процесса, испытания на изгиб позволяют получить механические свойства, которые могут описать восприимчивость кости к разрушению. Эти тесты также относительно просты и быстры в выполнении. Несмотря на то, что абсолютные значения этих тестов не всегда могут быть полностью достоверными, возможность обнаружить относительные различия между группами может быть довольно точной для выборок различных размеров и форм. Полученные механические свойства обеспечивают функциональную значимость в исследованиях, где можно было бы ожидать различий в костях. Несмотря на то, что монотонные испытания на разрушение являются наиболее распространенными и легкодоступными механическими испытаниями, другие методы, включая усталостную долговечность и вязкость разрушения, могут выявить дополнительные механические свойства, представляющие интерес, и могут быть рассмотрены.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAn	Bruker	NA	CT Scan Analysis Software
DataViewer	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Coding platform used for data analysis
NRecon	Bruker	NA	CT Scan Reconstruction software
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software	Micro Photonics Inc	SKY-016814	Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object