げっ歯類の骨の全骨曲げ試験を含む研究の設計、実施、および解釈に関する実践的な考慮事項
Summary
げっ歯類の骨の機械的試験は、骨の骨折しやすさに関する情報を抽出するための貴重な方法です。適切な実践的理解を欠いていると、結果が過剰に解釈されたり、妥当性に欠けたりする可能性があります。このプロトコルは、機械的試験が正確に実施され、有効で機能的なデータを提供するためのガイドとして機能します。
Abstract
骨折につながる骨格の脆弱性は、毎年150万人の骨折と180億ドルの直接的な医療費をもたらす米国の公衆衛生上の危機です。骨疾患の根底にあるメカニズムと治療への反応を理解する能力は、望まれるだけでなく、重要です。骨の機械的試験は、骨の骨折しやすさを理解し、定量化するための貴重な技術として役立ちます。この方法は簡単に実行できそうに見えますが、ユーザーがガバナンスの仮定と重要な手順を無視すると、不適切で不正確な結論に達する可能性があります。これは、方法の誤用や結果の誤った解釈を伴う研究が発表され続けているため、分野を超えて観察されています。このプロトコルは、サンプルサイズの考慮から組織の採取と保存、データ分析と解釈まで、これらの技術の適用とともに機械的試験に関連する原則の入門書として機能します。これにより、骨の骨折しやすさに関する貴重な情報が得られ、学術研究と臨床ソリューションの両方の理解が深まります。
Introduction
骨の機械的試験は、骨の骨折しやすさに関連する機能情報を抽出するための主要な方法です。前臨床試験では、いくつかの検査方法を使用できますが、最も一般的なのは長骨の曲げです。これらの検査は簡単に実施でき、ヒトからマウスまで、さまざまなサイズの骨に使用できます。マウスは前臨床研究で最も一般的に研究されている動物の1つであるため、このプロトコルはマウスの大腿骨と脛骨で実施される曲げ試験に焦点を当てます。
曲げ試験を行う前に、骨を適切に採取して保管する必要があります。最も一般的な保存方法は、伝統的に、生理食塩水に浸したガーゼで骨を凍結するか、生理食塩水のみで凍結するか、エ タノールで骨を脱水するかでした1。エタノールで保存された骨は、凍結保存されたものと比較して、剛性と弾性率が増加し、変形パラメータが減少することが示されています1。検査前に骨を水分補給しても、これらの特性は正常なレベル 1には回復しません。生理食塩水に浸して保管すると、生理食塩水が膨張すると圧力がかかるため、骨に損傷を与える可能性があります。さらに、マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)スキャンのために骨を取り除くには、溶液の完全な融解が必要になります。その結果、採取したばかりの骨を生理食塩水に浸したガーゼで冷凍することが標準的な保存方法となっており、このプロトコル全体で推奨されています。
骨の大きさと形状は骨のかさ強度に影響を与え、多くの疾患モデルは骨のサイズと形態を大きく変えるため、工学的原理を使用してサイズの影響を正規化し、組織の挙動を推定する特性を生成します2。このアプローチでは、破損箇所の断面形状が必要であり、これは試験前に骨のスキャンを作成するためにμCTを使用して取得されるのが最も一般的です。μCTは、その可用性と高い画像解像度により広く使用されています。さらに、軟部組織の寄与は含まれておらず、スキャンは骨への化学的固定やその他の修正を必要としません3,4。すべての形態のCTでは、X線源が物体に焦点を合わせ、物体の反対側にある検出器が結果として生じるX線エネルギーを測定します。これにより、画像3,5に変換できるサンプルのX線影が生成される。スキャンされる物体を回転させ(またはX線源と検出器を試料の周りを回転させ)、物体5を表す3次元データセットに再構成することができる画像を生成する。
スキャン解像度、つまり 2 つのオブジェクトがどれだけ接近していても個別に解決できるかは、公称ボクセル サイズまたは結果の画像のピクセル サイズを変更することによって制御されます。一般的には、オブジェクトが識別されるためには、1つのボクセルの少なくとも2倍のサイズでなければならないとされていますが3、比率を高くすると精度が向上します。さらに、ボクセルが大きいほど、部分的な体積効果が生じやすくなり、1つのボクセルにさまざまな密度の組織が含まれる場合、単一の組織の比密度ではなく、これらの密度の平均が割り当てられるため、組織面積と鉱物密度が過大または過小評価される可能性があります3。これらの問題は、より小さなボクセル サイズを選択することで軽減できますが、より高い解像度を使用しても、部分的なボリューム効果が排除されるわけではなく、スキャン時間が長くなる可能性があります3。 ex vivoで骨をスキャンする場合、マウスの骨の小柱構造を正確に評価するために、一般的に6〜10μmのボクセルサイズが推奨されます。皮質骨には10〜17μmのより大きなボクセルサイズを使用できますが、最小の妥当なボクセルサイズを使用する必要があります。このプロトコルは10 μmのボクセルサイズを使用しており、これは主要な小柱特性を区別し、長時間のスキャン時間なしで部分的な体積の影響を最小限に抑えるのに十分な大きさです。
骨組織のミネラル密度と厚さが高いと、透過X線エネルギースペクトルが大幅に減衰および変化するため、X線エネルギーとエネルギーフィルターの設定も慎重に選択する必要があります。一般に、放射されたX線スペクトルは物体6から出るスペクトルと同等であるため、骨などの高密度の物体に低エネルギーX線を使用すると、ビーム硬化7として知られるアーチファクトが発生する可能性があります。これらのアーチファクトの発生率を減らすために、骨サンプルをスキャンするときは、50〜70 kVpのより高い電圧が推奨されます5。さらに、アルミニウムまたは銅のエネルギーフィルタを挿入すると、より集中したエネルギービームが作成され、アーチファクトがさらに最小限に抑えられます4,7。このプロトコルでは、0.5mmのアルミニウムフィルターが使用されます。
最後に、スキャン回転ステップおよび回転長(例えば、180°〜360°)が一緒になって、キャプチャされる画像の数を制御し、これが最終スキャン4におけるノイズの量を決定する。各ステップで複数のフレームを平均化すると、ノイズは低減できますが、スキャン時間が長くなる可能性があります4。このプロトコルでは、0.7 度の回転ステップと 2 のフレーム平均を使用します。
スキャンに関する最後の注意点:ハイドロキシアパタイトキャリブレーションファントムは、減衰係数を鉱物密度(g/cm35)に変換できるように、実験骨と同じスキャン設定を使用してスキャンする必要があります。このプロトコルでは、0.25 g/cm 3 および 0.75 g/cm3 のハイドロキシアパタイトのファントムを使用しますが、異なるファントムが利用可能です。一部のスキャンシステムは、毎日のシステムキャリブレーションの一部として内部ファントムを使用することに注意してください。
スキャンが完了すると、角度投影は、通常、メーカーの付属ソフトウェアを使用して、オブジェクトの断面画像に再構築されます。どのシステムを使用する場合でも、骨全体が再建に取り込まれ、骨と非骨の認識を可能にするために閾値が適切に設定されていることを確認することが重要です。再建後、すべてのスキャンを3次元で回転させて、骨の向きが一貫して横軸と適切に揃うようにすることが重要です。
回転後、分析のための関心領域(ROI)は、皮質特性、小柱特性、または機械的正規化のための骨折形状のいずれが望ましいかに基づいて選択され得る。後者の場合、ROIは、骨折部位から骨の一端までの距離を測定し、ボクセルサイズを使用してスキャンファイル内の対応するスライス位置を決定することにより、テスト後に選択する必要があります。選択された領域は、適切な推定を提供するために、ROIのほぼ中心に破砕点がある長さが少なくとも100μmである必要があります4。
ROI が選択されている場合、機械的な正規化 (曲げ応力とひずみを計算するため) には、中立曲げ軸から破損が始まる表面までの最大距離 (試験セットアップによって決定される引張荷重を受ける表面と仮定) と、中立軸周辺の面積慣性モーメント (これも試験セットアップに依存) の 2 つのプロパティが必要です。このプロトコルでは、カスタムコードを使用してこれらの値を決定することを推奨しています。コードへのアクセスについては、対応する作成者に直接お問い合わせいただくか、https://bbml.et.iupui.edu/ のラボのWebサイトにアクセスして詳細を確認してください。
μCTスキャンが完了すると、機械的試験を開始できます。曲げ試験は、4点または3点構成のいずれかで実行できます。4点曲げ試験は、荷重点間の骨のせん断応力を排除し、この領域で純粋な曲げを発生させることができるため、好まれます3。その後、骨は張力によって骨折し、骨の真の曲げ特性をより代表する破損を引き起こします3。ただし、両方の荷重点で同じ荷重がかかるように骨に荷重をかける必要があります(これは、ピボット式ローディングヘッドで容易に行うことができます)。3点曲げ試験では、荷重点と骨が接する部分でせん断応力が大きく変化し、張力3ではなくせん断によってこの時点で骨が折れます。ASTM規格では、曲げ加工を受ける材料の長さと幅の比率を16:1にすることを推奨しており、これは、せん断の影響を最小限に抑えるために、支持スパンの長さを骨の幅の16倍にする必要があることを意味します8,9。これは、小さなげっ歯類の骨を試験する場合、達成できないことが多いため、荷重スパンは、断面形状の変化をできるだけ小さくして、できるだけ大きくします。さらに、4点曲げを行う場合、下部スパンと上部スパンの長さの比率は~3:18である必要があり、これは通常、脛骨で達成できますが、短い大腿骨では困難です。さらに、大腿骨の皮質壁が薄いため、試験中に骨断面の形状が変化するリング型の変形の影響を受けやすくなります(これは、3点曲げと比較して同じ曲げモーメントを誘発するためにより大きな力が必要になるため、4点試験で強調できます)。したがって、マウス大腿骨には 3 点曲げが利用され、このプロトコル全体で脛骨には 4 点曲げが使用されます。
最後に、統計分析のために研究に適切な電力を供給することが重要です。機械的試験の一般的な推奨事項は、一部の機械的特性、特に降伏後のパラメータが非常に変動する可能性があるため、違いを検出できるように、実験グループごとに10〜12個の骨のサンプルサイズを持つことです。場合によっては、これは、研究中に発生する可能性のある減少を考慮して、より大きな動物サンプルサイズから始めることを意味する場合があります。既存のデータを使用したサンプルサイズ分析は、研究を試みる前に完了する必要があります。
多くの制限と仮定がありますが、曲げ試験は、特にグループ間の相対的な差が重要な場合に、非常に正確な結果を提供できます。これらの特性は、小柱構造と皮質形態の分析とともに、病態と治療計画に関するより良い洞察を提供することができます。私たちが管理できる実験の側面(収穫、保管、スキャン、テストなど)に注意を払えば、正確な結果が得られていると確信できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
スキャンとテストのプロセス全体を通して、トラブルシューティングと最適化が適切な瞬間があります。1つ目は、μCTで骨をスキャンするときに発生します。多くのシステムには、1つのオブジェクトを保持してスキャンできるホルダーが付属していますが、カスタムホルダーを作成して複数のボーンを同時にスキャンすることができます。複数のボーンをスキャンすることは、最適化のため?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルを開発するために行われた作業は、米国国立衛生研究所(NIH)の支援を受けています[AR072609]。
Materials
| CTAn | Bruker | NA | CT Scan Analysis Software |
| DataViewer | Bruker | NA | CT Scan Rotation Software |
| Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a | MathWorks | NA | Coding platform used for data analysis |
| NRecon | Bruker | NA | CT Scan Reconstruction software |
| SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software | Micro Photonics Inc | SKY-016814 | Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object |
References
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