Praktische Überlegungen für das Design, die Durchführung und die Interpretation von Studien mit Ganzknochenbiegetests an Nagetierknochen

Summary

Die mechanische Prüfung von Nagetierknochen ist eine wertvolle Methode, um Informationen über die Bruchanfälligkeit eines Knochens zu gewinnen. Mangels angemessenem praktischem Verständnis können die Ergebnisse überinterpretiert werden oder keine Gültigkeit haben. Dieses Protokoll dient als Leitfaden, um sicherzustellen, dass mechanische Tests genau durchgeführt werden, um gültige und funktionsfähige Daten zu liefern.

Abstract

Die Zerbrechlichkeit des Skeletts, die zu Frakturen führt, ist eine Krise der öffentlichen Gesundheit in den USA, die jedes Jahr zu 1,5 Millionen Frakturen und 18 Milliarden US-Dollar an direkten Pflegekosten führt. Die Fähigkeit, die Mechanismen, die Knochenerkrankungen zugrunde liegen, und das Ansprechen auf die Behandlung zu verstehen, ist nicht nur erwünscht, sondern entscheidend. Die mechanische Prüfung von Knochen ist eine wertvolle Technik, um die Bruchanfälligkeit eines Knochens zu verstehen und zu quantifizieren. Obwohl diese Methode einfach durchzuführen erscheint, können unangemessene und ungenaue Schlussfolgerungen gezogen werden, wenn maßgebliche Annahmen und wichtige Schritte vom Benutzer missachtet werden. Dies ist disziplinübergreifend zu beobachten, da weiterhin Studien mit Missbrauch von Methoden und falscher Interpretation der Ergebnisse veröffentlicht werden. Dieses Protokoll dient als Grundlage für die Prinzipien, die mit mechanischen Tests verbunden sind, sowie für die Anwendung dieser Techniken - von Überlegungen zur Probengröße über die Gewebeentnahme und -lagerung bis hin zur Datenanalyse und -interpretation. Auf diese Weise können wertvolle Informationen über die Frakturanfälligkeit eines Knochens gewonnen werden, die das Verständnis sowohl für die akademische Forschung als auch für klinische Lösungen fördern.

Introduction

Die mechanische Prüfung von Knochen ist die primäre Methode, um funktionelle Informationen über die Bruchanfälligkeit eines Knochens zu extrahieren. In präklinischen Studien können mehrere Testmodalitäten verwendet werden, aber die bei weitem häufigste ist das Biegen von Röhrenknochen. Diese Tests sind einfach durchzuführen und können an Knochen unterschiedlicher Größe von Mensch bis Maus angewendet werden. Da Mäuse zu den am häufigsten untersuchten Tieren in der präklinischen Forschung gehören, konzentriert sich dieses Protokoll auf Biegetests, die an den Oberschenkelknochen und Tibiae von Mäusen durchgeführt werden.

Vor der Durchführung von Biegeversuchen müssen die Knochen ordnungsgemäß entnommen und gelagert werden. Die gebräuchlichsten Lagerungsmethoden waren traditionell das Einfrieren von Knochen in salzgetränkter Gaze, das Einfrieren in Kochsalzlösung allein oder das Dehydrieren von Knochen in Ethanol ¹. Es hat sich gezeigt, dass in Ethanol gelagerte Knochen eine höhere Steifigkeit und einen höheren Elastizitätsmodul sowie geringere Verformungsparameter aufweisen als Knochen, die gefroren gelagert werden¹. Selbst wenn die Knochen vor dem Test rehydriert werden, werden diese Eigenschaften nicht wieder auf ein normales Niveau zurückgeführt ¹. Die Lagerung in Kochsalzlösung kann den Knochen schädigen, da Druck ausgeübt wird, wenn sich die Kochsalzlösung ausdehnt. Darüber hinaus wäre ein vollständiges Auftauen der Lösung erforderlich, um die Knochen für die Mikrocomputertomographie (μCT) zu entfernen. Folglich ist das Einfrieren frisch geernteter Knochen in salzgetränkter Gaze zur Standard-Lagerungsmethode geworden und wird in diesem Protokoll empfohlen.

Da die Größe und Form eines Knochens seine Volumenfestigkeit beeinflussen und viele Krankheitsmodelle die Knochengröße und -morphologie erheblich verändern, werden technische Prinzipien verwendet, um die Auswirkungen der Größe zu normalisieren und Eigenschaften zu erzeugen, die das Verhalten des Gewebes abschätzen². Dieser Ansatz erfordert eine Querschnittsgeometrie der Versagensstelle, die am häufigsten mit μCT erfasst wird, um Scans der Knochen vor dem Test zu erstellen. μCT ist aufgrund seiner Verfügbarkeit und hohen Bildauflösung weit verbreitet. Darüber hinaus sind Beiträge von Weichgewebe nicht enthalten, und das Scannen erfordert keine chemische Fixierung oder andere Modifikationen des Knochens ^3,4. Bei allen Formen der CT wird eine Röntgenquelle auf ein Objekt fokussiert, während ein Detektor auf der anderen Seite des Objekts die resultierende Röntgenenergie misst. Dadurch entsteht ein Röntgenschatten der Probe, der in ein Bild^{umgewandelt werden kann 3,5}. Das zu scannende Objekt wird gedreht (oder die Röntgenquelle und der Detektor werden um die Probe gedreht), wodurch Bilder erzeugt werden, die in einen dreidimensionalen Datensatz rekonstruiert werden können, der das Objekt⁵ darstellt.

Die Scanauflösung, d. h. wie nahe zwei Objekte einzeln beieinander liegen und dennoch aufgelöst werden können, wird durch Ändern der nominalen Voxelgröße oder der Größe eines Pixels im resultierenden Bild gesteuert. Es ist allgemein anerkannt, dass Objekte mindestens doppelt so groß sein müssen wie ein einzelnes Voxel³, aber ein höheres Verhältnis ermöglicht eine verbesserte Präzision. Darüber hinaus sind größere Voxel anfälliger für Teilvolumeneffekte: Wenn ein einzelnes Voxel Gewebe unterschiedlicher Dichte enthält, wird ihm der Durchschnitt dieser Dichten und nicht die spezifische Dichte eines einzelnen Gewebes zugewiesen, was zu einer Über- oder Unterschätzung der Gewebebereiche und der Mineraldichte führen kann³. Diese Probleme können zwar durch die Wahl kleinerer Voxelgrößen gemildert werden, aber die Verwendung einer höheren Auflösung gewährleistet nicht die Eliminierung von Teilvolumeneffekten und erfordert möglicherweise längere Scanzeiten³. Beim Ex-vivo-Scan von Knochen wird im Allgemeinen eine Voxelgröße von 6-10 μm empfohlen, um die trabekuläre Architektur von Mausknochen genau beurteilen zu können. Für kortikalen Knochen kann eine größere Voxelgröße von 10-17 μm verwendet werden, obwohl die kleinste sinnvolle Voxelgröße verwendet werden sollte. Dieses Protokoll verwendet eine Voxelgröße von 10 μm, die klein genug ist, um wichtige trabekuläre Eigenschaften zu differenzieren und Teilvolumeneffekte ohne lange Scanzeit zu minimieren.

Auch die Einstellungen für Röntgenenergie und Energiefilter müssen sorgfältig gewählt werden, da die hohe Mineraldichte und Dicke des Knochengewebes das transmittierte Röntgenenergiespektrum stark abschwächt und verändert. Es wird allgemein angenommen, dass, da das emittierte Röntgenspektrum äquivalent zu dem Spektrum ist, das das Objekt⁶ verlässt, die Verwendung von niederenergetischer Röntgenstrahlung auf dichte Objekte wie Knochen zu einem Artefakt führen kann, das als Strahlhärtung⁷ bekannt ist. Beim Scannen von Knochenproben wird eine höhere Spannung von 50-70 kVp empfohlen, um das Auftreten dieser Artefakte zu reduzieren⁵. Darüber hinaus erzeugt das Einsetzen eines Aluminium- oder Kupfer-Energiefilters einen konzentrierteren Energiestrahl, wodurch Artefakte weiter minimiert^{werden 4,7}. Während dieses Protokolls wird ein 0,5-mm-Aluminiumfilter verwendet.

Schließlich steuern der Scan-Rotationsschritt und die Rotationslänge (z. B. 180°-360°) zusammen die Anzahl der aufgenommenen Bilder, die die Menge des Rauschens im endgültigen Scan⁴ bestimmt. Die Mittelung mehrerer Frames in jedem Schritt kann das Rauschen reduzieren, aber die Scanzeit verlängern⁴. Dieses Protokoll verwendet einen Rotationsschritt von 0,7 Grad und eine Frame-Mittelung von 2.

Eine letzte Anmerkung zum Scannen: Hydroxylapatit-Kalibrierphantome sollten mit den gleichen Scaneinstellungen wie die experimentellen Knochen gescannt werden, um die Umrechnung der Dämpfungskoeffizienten in die Mineraldichte in g/cm³⁵ zu ermöglichen. Dieses Protokoll verwendet Phantome von 0,25 g/cm3 und 0,75 g/^cm3 Hydroxylapatit, obwohl verschiedene Phantome verfügbar sind. Beachten Sie, dass einige Scansysteme interne Phantome als Teil der täglichen Systemkalibrierung verwenden.

Sobald der Scanvorgang abgeschlossen ist, werden die Winkelprojektionen zu Querschnittsbildern des Objekts rekonstruiert, in der Regel mit der begleitenden Software des Herstellers. Unabhängig davon, welches System verwendet wird, ist es wichtig sicherzustellen, dass der gesamte Knochen bei der Rekonstruktion erfasst wird und dass die Schwellenwerte angemessen festgelegt werden, um die Erkennung von Knochen und Nicht-Knochen zu ermöglichen. Nach der Rekonstruktion ist es wichtig, alle Scans dreidimensional zu drehen, damit die Knochen konsistent ausgerichtet und richtig mit der Querachse ausgerichtet sind, wiederum mit der Software des Herstellers.

Nach der Rotation können Regions of Interest (ROI) für die Analyse ausgewählt werden, je nachdem, ob kortikale Eigenschaften, trabekuläre Eigenschaften oder Bruchgeometrie für die mechanische Normalisierung gewünscht werden. Bei letzterem sollten ROIs nach dem Test ausgewählt werden, indem der Abstand von der Frakturstelle zu einem Ende des Knochens gemessen und die Voxelgröße verwendet wird, um die entsprechende Schichtposition in der Scandatei zu bestimmen. Die ausgewählte Region sollte mindestens 100 μm lang sein, wobei der Bruchpunkt ungefähr in der Mitte des ROI liegen sollte, um eine angemessene Schätzung zu ermöglichen⁴.

Wenn ROIs ausgewählt sind, werden zwei Eigenschaften für die mechanische Normalisierung (zur Berechnung der Biegespannung und -dehnung) benötigt: der maximale Abstand von der neutralen Biegeachse zur Oberfläche, an der das Versagen ausgelöst wird (angenommen wird die unter Spannung belastete Fläche, die durch den Versuchsaufbau bestimmt wird) und das Flächenträgheitsmoment um die neutrale Achse (ebenfalls abhängig vom Versuchsanordnung). Dieses Protokoll empfiehlt die Verwendung eines benutzerdefinierten Codes, um diese Werte zu bestimmen. Für den Zugriff auf den Code wenden Sie sich direkt an den korrespondierenden Autor oder besuchen Sie die Lab-Website unter https://bbml.et.iupui.edu/ für weitere Informationen.

Sobald der μCT-Scan abgeschlossen ist, kann mit der mechanischen Prüfung begonnen werden. Biegeversuche können entweder in Vierpunkt- oder Dreipunktkonfiguration durchgeführt werden. Vier-Punkt-Biegeversuche werden bevorzugt, da sie die Scherspannung im Knochen zwischen den Belastungspunkten eliminieren und eine reine Biegung in diesem Bereich ermöglichen³. Der Knochen bricht dann aufgrund der Spannung, wodurch ein Versagen entsteht, das repräsentativer für die wahren Biegeeigenschaften des Knochens^{ist 3}. Der Knochen muss jedoch so belastet werden, dass er an beiden Belastungspunkten die gleiche Last abgibt (dies kann mit einem schwenkbaren Ladekopf erleichtert werden). Bei Dreipunktbiegeversuchen gibt es eine große Änderung der Scherspannung an der Stelle, an der der Belastungspunkt auf den Knochen trifft, was dazu führt, dass der Knochen an dieser Stelle aufgrund von Scherung bricht, nicht aufgrund von Spannung³. Die ASTM-Normen empfehlen, dass Materialien, die gebogen werden, ein Verhältnis von Länge zu Breite von 16:1 haben sollten, was bedeutet, dass die Länge der Stützspannweite 16-mal größer sein sollte als die Breite des Knochens, um die Auswirkungen der Scherung^{zu minimieren 8,9}. Dies ist bei der Prüfung kleiner Nagetierknochen oft nicht zu erreichen, daher wird die Belastungsspanne einfach so groß wie möglich gemacht, aber mit einer möglichst geringen Veränderung der Querschnittsform. Darüber hinaus sollte bei der Durchführung der Vier-Punkt-Beugung das Verhältnis zwischen den Längen der unteren und oberen Spannweite ~3:1⁸ betragen, was normalerweise im Schienbein erreicht werden kann, aber im kürzeren Oberschenkelknochen schwierig ist. Darüber hinaus machen die dünneren kortikalen Wände der Oberschenkelknochen sie anfällig für ringförmige Verformungen, die die Form des Knochenquerschnitts während des Tests verändern (dies kann bei Vierpunkttests akzentuiert werden, da im Vergleich zur Dreipunktbiegung eine größere Kraft erforderlich ist, um das gleiche Biegemoment zu induzieren). Daher wird die Drei-Punkt-Beugung für den Oberschenkelknochen der Maus verwendet, während die Vier-Punkt-Beugung für die Tibiae während des gesamten Protokolls verwendet wird.

Schließlich ist es wichtig, die Studie für die statistische Analyse richtig mit Strom zu versorgen. Eine allgemeine Empfehlung für mechanische Tests ist eine Stichprobengröße von 10-12 Knochen pro Versuchsgruppe, um Unterschiede erkennen zu können, da einige mechanische Eigenschaften, insbesondere Nachstreckungsparameter, sehr variabel sein können. In einigen Fällen kann dies bedeuten, dass mit einer höheren Stichprobengröße begonnen wird, da es während der Studie zu einer Abnutzung kommen könnte. Die Analyse der Stichprobengröße anhand vorhandener Daten sollte vor dem Versuch einer Studie abgeschlossen werden.

Es gibt zahlreiche Einschränkungen und Annahmen, aber Biegeversuche können recht genaue Ergebnisse liefern, insbesondere wenn relative Unterschiede zwischen Gruppen von Interesse sind. Diese Eigenschaften, zusammen mit der Analyse der trabekulären Architektur und der kortikalen Morphologie, können einen besseren Einblick in Krankheitszustände und Behandlungsschemata ermöglichen. Wenn die Aspekte des Experiments, die in unserer Kontrolle liegen (z. B. Ernte, Lagerung, Scannen und Testen), sorgfältig behandelt werden, können wir sicher sein, dass genaue Ergebnisse erzielt wurden.

Protocol

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren, an denen Tiere beteiligt waren, wurden vor dem Verfahren vom Indiana University School of Science Institutional Animal and Use Committee (IACUC) genehmigt. Die in dem Verfahren beschriebenen Tiere wurden durch CO_{2 -}Inhalation euthanasiert, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation als sekundäres Mittel der Euthanasie.

1. Ernte, Lagerung und Auftauen der Knochen

1. Ernte und Lagerung
   1. Legen Sie die Maus mit der Bauchseite nach oben. Verwende ein Skalpell (oder eine Rasierklinge oder Schere), um einen Schnitt an der ungefähren Verbindung von Oberschenkelknochen und Becken auf einer Seite zu machen.
   2. Setzen Sie den ersten Schnitt dorsal fort, bis das Hüftgelenk lokalisiert ist. Achte auf den Hüftkopf, der als kleine weiße Kugel am Becken befestigt erscheint.
   3. Üben Sie mit der Kante eines Skalpells Druck auf den proximalen Rand des Hüftkopfes aus, bis der Hüftkopf aus der Pfanne springt. Entfernen Sie zusätzliches Gewebe, um die Hintergliedmaße vom Rest des Schlachtkörpers zu befreien.
   4. Wenn die Hintergliedmaße isoliert ist, trennen Sie Schienbein und Oberschenkelknochen, indem Sie eine Beugung am Kniegelenk induzieren. Bewegen Sie das Skalpell in medial-lateraler Richtung an der vorderen Oberfläche des Knies, um angrenzendes Gewebe zu durchtrennen, einschließlich der Bänder zwischen den Knochen.
   5. Wenn dies die Knochen nicht trennt, strecken Sie das Kniegelenk, um den Zugang zur Seitenzahnfläche zu ermöglichen. Achten Sie darauf, den Knochen nicht zu schneiden oder den Gelenkknorpel zu kratzen.
   6. Sobald Oberschenkelknochen und Schienbein getrennt sind, entfernen Sie den Rückfuß aus dem Schienbein, indem Sie das Gelenk beugen und eine medial-laterale Sägebewegung auf der hinteren Gelenkfläche ausführen. Verlängern Sie bei Bedarf das Gelenk, um die Frontfläche freizulegen. Achte darauf, dass du den Knochen nicht durchtrennst.
   7. Reinigen Sie die Knochen nach der Isolierung von allen anhaftenden Weichteilen. Wenn Sie Vier-Punkt-Beugetests am Schienbein durchführen, entfernen Sie auch das Wadenbein. Das Wadenbein ist am proximalen Ende durch Bänder verbunden, ist aber in der Nähe des distalen Endes des Knochens mit der Tibia verschmolzen. Verwenden Sie eine scharfe Schere in der Nähe des Verbindungspunkts, um das Wadenbein zu trennen.
   8. Die isolierten und gereinigten Knochen separat in salzgetränkte Gaze einwickeln und bei -20 °C lagern. Tun Sie dies unmittelbar nach der Ernte.
   9. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.1 bis 1.1.8 für die andere Seite des Schlachtkörpers.
      HINWEIS: Wenn es beim Versuch, die Knochen in den Schritten 1.1.4-1.1.6 zu trennen, zu Widerstand kommt, ist es am besten, die Schritte zu wiederholen, anstatt zu versuchen, die Knochen auseinander zu ziehen. Kräftige Bewegungen können zu Schäden oder Knochenbrüchen führen.
2. Auftauen
   HINWEIS: Die Anzahl der Gefrier-Auftau-Zyklen, die ein Knochen durchläuft, sollte minimiert werden, da übermäßige Gefrier-Auftau-Zyklen die mechanischen Eigenschaften des Knochens beeinträchtigen können. Ein partielles Auftauen für die μCT-Untersuchung kann erreicht werden, indem der Knochen 5-10 Minuten lang bei Raumtemperatur belassen wird. Tauen Sie den Knochen nur vollständig auf, wenn Sie Biegeversuche wie unten beschrieben durchführen.
   1. Über Nacht auftauen bevorzugt
      1. Bringen Sie die Knochen von -20 °C Lagerung auf 1-4 °C in einem Kühlraum oder Kühlschrank. Stellen Sie sicher, dass die Knochen 8-12 Stunden lang dort bleiben, um vollständig aufzutauen, bevor Sie sie testen.
   2. Schnelles Auftauen
      1. Stellen Sie die Temperatur des Bades auf ca. 37 °C ein. Sobald diese Temperatur erreicht ist, geben Sie die Knochen in das Bad.
      2. Lassen Sie die Knochen ca. 1 Stunde im Bad.

2. μCT-Abtastung

1. Wickeln Sie die Knochen vor dem Scannen in Parafilm ein, um die Flüssigkeitszufuhr aufrechtzuerhalten. Halten Sie alle anderen Knochen auf Eis, während Sie darauf warten, gescannt zu werden.
2. Sobald der Knochen in Parafilm eingewickelt ist, legen Sie ihn in eine Halterung, um ihn mit dem Scanner zu verbinden. Stellen Sie sicher, dass alle gescannten Bones in der gleichen Ausrichtung ausgerichtet sind, da eine konsistente Ausrichtung die Rotation später in der Analyse vereinfacht.
3. Passen Sie die Scaneinstellungen entsprechend der Anwendung des Scans an. Die folgenden allgemeinen Scaneinstellungen werden für Mausknochen empfohlen: Auflösung/Voxelgröße: 10 μm; Pixelgröße: mittel, 2000 x 1048; Filter: 0,5 mm Aluminium; Rotationsschritt: 0,7; Frame-Mittelung: 2.
   HINWEIS: Diese Einstellungen können je nach zum Scannen verwendetes System unterschiedlich sein, und das Hersteller- und Benutzerhandbuch sollten bei Bedarf konsultiert werden.
4. Sobald die Röntgenquelle eingeschaltet ist, führen Sie eine Flat-Field-Korrektur durch, um Artefakte zu minimieren. Stellen Sie dazu zunächst sicher, dass die Kammer leer ist, und schalten Sie das flache Feld aus.
5. Messen Sie die durchschnittliche Intensität des Feldes und stellen Sie sie auf 60 % ein. Sobald Sie 60 % erreicht haben, aktualisieren Sie das flache Feld und schalten Sie es wieder ein.
6. Stellen Sie sicher, dass die durchschnittliche Intensität jetzt (86-88 %) beträgt.
   HINWEIS: Dieser Vorgang kann je nach verwendetem μCT-System variieren. Konsultieren Sie das Benutzerhandbuch, bevor Sie den Vorgang durchführen.
7. Sobald die Flat-Field-Korrektur erfolgreich durchgeführt wurde, setzen Sie den Halter in die Kammer ein. Stellen Sie sicher, dass die Proben zentriert und waagerecht sind, bevor Sie den Sockel in die Kammer stellen.
8. Sobald der Sockel befestigt ist, schließen Sie die Kammer, stellen Sie sicher, dass der gesamte Knochen im Scan erfasst wird (möglicherweise ist eine Scout-Ansicht erforderlich), und starten Sie den Scan.
9. Nach dem Scannen werden die Knochen erneut in salzgetränkter Gaze bei -20 °C gelagert.

3. μCT-Rekonstruktion

1. Wählen Sie einen ROI, der den gesamten Knochen bei der Rekonstruktion erfasst. Zeigen Sie dazu den größten Querschnitt des Knochens an und dimensionieren Sie den ROI basierend auf diesem Querschnitt.
2. Legen Sie die Schwellenwerte der Software fest, um eine korrekte Erkennung von Knochen im Vergleich zu Nicht-Knochen zu ermöglichen. Verwenden Sie dazu ein Histogramm, in dem eine untere Einschränkung auf 0 und die obere Einschränkung am Ende der Spitzenhistogrammdaten festgelegt ist.
3. Passen Sie zusätzliche Einstellungen an, einschließlich der Reduzierung von Ringartefakten und der Strahlhärtung auf 5 bzw. 20 %. Vergewissern Sie sich, dass die Ausrichtungskorrektur im Bereich von -7 bis 7 liegt. Diese Werte können je nach Software variieren. Stellen Sie sicher, dass sie mit dem Benutzerhandbuch und den Anweisungen des Herstellers überprüft werden, bevor Sie mit der Rekonstruktion beginnen.
   ANMERKUNG: Artefakte können während der Rekonstruktion minimiert werden, indem Korrekturen für die Strahlhärtung, Ringartefakte und die Kompensation von Fehlausrichtungen vorgenommen werden. Die Kompensation von Fehlausrichtungen kann als Indikator für die Qualität des Scans dienen, und wenn der Scan außerhalb eines vom Hersteller angegebenen Bereichs liegt, muss der Scan wiederholt werden. Die Rekonstruktionseinstellungen sind jedoch softwareabhängig und sollten im Benutzerhandbuch konsultiert werden.

4. μCT-Rotation

HINWEIS: Nach der Rekonstruktion müssen die Scans gedreht werden, um eine konsistente Ausrichtung über alle Knochen hinweg herzustellen und sicherzustellen, dass Querschnitte des resultierenden Knochens senkrecht zur Längsachse mit so wenig Versatzwinkel wie möglich aufgenommen werden. Dies sollte mit der Software der Wahl des Benutzers erfolgen.

1. Rotation des Oberschenkelknochens
   1. Drehen Sie den Oberschenkelknochen, so dass alle Knochen die gleiche Längsausrichtung haben. Richten Sie beispielsweise alle Knochen so aus, dass sich das proximale Ende des Knochens am oberen Rand des Scans befindet.
   2. Drehen Sie den Knochen so, dass die Querschnittsorientierung aller Knochen gleich ist. Drehen Sie zum Beispiel die Knochen so, dass sich die vordere Seite immer auf der rechten Seite der Scans befindet.
   3. Sobald diese Anpassungen vorgenommen wurden, richten Sie den Scan aus, um sicherzustellen, dass die Symmetrie um die Mittelachse erhalten bleibt.
   4. Speichern Sie das gedrehte Dataset.
2. Rotation des Schienbeins
   1. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.1-4.1.4 für das Schienbein.

5. Mechanisches Prüfverfahren

1. Präparat
   1. Stellen Sie vor der mechanischen Prüfung sicher, dass ein μCT-Scan mit einer Auflösung von 6-10 μm erstellt und rekonstruiert wurde, um zu überprüfen, ob für jede Probe ein Qualitätsscan erstellt wurde, um die Querschnittsgeometrie an der Bruchstelle zu berechnen (Abschnitte 2-3).
   2. Anhand der erhaltenen und verifizierten Scans sind alle Knochen vor der Untersuchung aufzutauen (Abschnitt 1). Testen Sie alle Knochen aus einem Experiment am selben Tag und randomisieren Sie die Reihenfolge der Tests, um Benutzerverzerrungen und Systemvariabilität zwischen Proben und Versuchsgruppen zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass die Knochen während des gesamten Testvorgangs hydratisiert bleiben.
2. Aufbau der Apparatur
   1. Suchen Sie eine Wägezelle mit der entsprechenden Empfindlichkeit und Kapazität für die Probe. Berücksichtigen Sie den erwarteten Versagensbereich für die Probe und wählen Sie eine Wägezelle mit etwa 50 % mehr Kapazität bei maximaler Empfindlichkeit (z. B. eine 10-lbf-Wägezelle mit einer Kapazität von 45 N für einen Mausknochen im Fehlerbereich von 0 bis 25 N).
   2. Lokalisieren Sie Last- und Stützspannvorrichtungen.
   3. Montieren Sie die Wägezelle und die Vorrichtungen wie in Abbildung 1 gezeigt, indem Sie die Wägezelle entweder auf die obere oder untere Halterung des Prüfgeräts, die obere Belastungsvorrichtung auf die Wägezelle und die untere Vorrichtung auf die untere Halterung des Prüfgeräts schrauben. Sorgen Sie für einen sicheren Sitz.
      HINWEIS: Die Befestigung der Wägezelle an der oberen Vorrichtung wird im Allgemeinen bei der Durchführung von Biegeversuchen empfohlen, um den Kontakt von Flüssigkeit mit der Wägezelle zu vermeiden, aber bei Bedarf kann die untere Vorrichtung verwendet werden.
   4. Sobald die Wägezelle und die Vorrichtungen installiert sind, wählen Sie eine Stützspannweite aus und stellen Sie sicher, dass diese für alle zu prüfenden Proben konstant bleibt. Um einen Stützspannweitenabstand auszuwählen, suchen Sie zunächst den kürzesten Knochen im Probensatz.
   5. Richten Sie den Knochen zwischen den Vorrichtungen aus, wie in Abbildung 2 gezeigt.
   6. Für die Dreipunktbeugung des Oberschenkelknochens ist Abbildung 2A zu folgen. Stellen Sie sicher, dass die vordere Oberfläche des Knochens gegen die Stützspanne und der Spannbereich innerhalb der Diaphyse der Probe liegt. Vermeiden Sie es, den dritten Trochanter am proximalen Ende und den Übergangspunkt, an dem sich der Knochen in die Metaphyse und die Kondylen am distalen Ende erweitert, einzubeziehen.
   7. Achten Sie beim Vierpunktbiegen darauf, dass die Stütz- und Lastspannweiten zueinander ausgerichtet und zentriert sind. Befolgen Sie Abbildung 2B , um den Knochen in die Halterungen zu laden.
      1. Stellen Sie die Länge der Stütz- und Lastspannweiten so ein, dass sie einem Verhältnis von 3:1⁸ folgen (z. B. 9 mm Stützspannweite und 3 mm Belastungsspanne).
      2. Bei einer Tibia wird die mediale Oberfläche des Knochens mit einer Stütze an der Tibia/Fibula-Verbindung gegen die Stützspannweite belastet. Die andere Stütze wird wahrscheinlich direkt nach dem Tibiakamm positioniert. Stellen Sie sicher, dass die Belastungsspanne, die innerhalb der Stützspannweite zentriert ist, dann einen gleichmäßigen Bereich des Knochens enthält.
   8. Messen Sie den Stützspannweitenabstand, wenn Sie eine Dreipunktbiegung durchführen, und sowohl den Last- als auch den Stützspannweitenabstand, wenn Sie eine 4-Punkt-Biegung durchführen, und zeichnen Sie diese Abstände auf. Stellen Sie sicher, dass dieser Wert sowohl für die Last- als auch für die Stützfeldmessungen von der Mitte der Belastungspunkte aus aufgezeichnet wird.
   9. Legen Sie den Knochen wieder in Kochsalzlösung oder rehydrieren Sie ihn mit einem Bolus Kochsalzlösung.
      HINWEIS: Bei der Auswahl von Punkten für eine Belastungsspanne wird empfohlen, kreisförmige Punkte zu verwenden (ein Radius von 0,75 mm ist ausreichend, da er die Last verteilt und gleichzeitig den Knochen an der Tangente des Kreises berührt). Während die Theorie eine Messerschneide empfiehlt, um eine Punktbelastung darzustellen, wird dies den Knochen am Punkt der Lastaufbringung zerquetschen, was zu einer Überschätzung der Dehnung und einer Unterschätzung des Moduls führt.
   10. Stellen Sie sicher, dass alle Teile der Vorrichtung fest und frei beweglich sind.
3. Software-Einrichtung
   1. Stellen Sie sicher, dass der Tester ordnungsgemäß über die Modulbox, die Wägezellenkanäle und alle anderen Anforderungen gemäß dem Systemhandbuch an den Computer angeschlossen ist.
   2. Erstellen Sie in der Software, die mit dem mechanischen Prüfgerät verbunden ist, ein Biegetestprofil mit einer Rampe, die eine Verschiebungsrate aufweist, die langsam genug ist, um keine viskoelastischen Effekte (0,025 mm/s werden häufig verwendet) zu induzieren, um den Knochen bis zum Versagen zu belasten.
   3. Eine Mindestabtastfrequenz von 25 Hz wird auch bei der Erstellung eines Testprofils empfohlen, obwohl eine höhere Abtastrate bevorzugt wird.
   4. Erstellen Sie einen Ordner pro Lerngruppe, und speichern Sie jeden Test als einzelne Datei in diesem Ordner.
4. Laden und Testen von Proben
   1. Wählen Sie einen richtig aufgetauten Knochen aus (siehe Schritt 1.2). Messen und zeichnen Sie die gesamte Länge mit Messschiebern auf.
   2. Laden Sie die Probe auf die Vorrichtungen, wie in Abbildung 2A gezeigt, wenn Sie einen Oberschenkelknochen in Dreipunktbiegung testen, und in Abbildung 2B, wenn Sie ein Schienbein in Vierpunktbiegung testen.
   3. Ändern Sie den Dateinamen so, dass er das zu testende Beispiel widerspiegelt.
   4. Null die Last (nicht die Verschiebung). Schalten Sie den Mover des Systems ein; Stellen Sie sicher, dass es sich nicht in einer Last- oder Verschiebungskontrolle befindet.
   5. Wenden Sie vorsichtig eine minimale Vorspannung auf den Knochen an, um seine Position zu sichern und ein Rollen des Knochens zu verhindern, aber stellen Sie sicher, dass die Probe nicht beeinträchtigt wird. Streben Sie eine Vorspannung von ca. 0,25 N an. Stellen Sie sicher, dass die gewünschte Knochenorientierung beibehalten wird, bevor Sie fortfahren.
   6. Hydratisieren Sie die Probe, indem Sie sie großzügig mit Kochsalzlösung übergießen.
   7. Beginnen Sie den Biegeversuch, indem Sie in der Software Start oder Ausführen auswählen. KRITISCH: Beobachten Sie die Probe während des gesamten Tests sorgfältig und notieren Sie Tests, bei denen Probleme aufgetreten sind (z. B. Rollen, Rutschen).
      HINWEIS: Diese Probleme können Daten beeinträchtigen, und Hinweise zu diesen Tests sind hilfreich, um sie während der Analyse zu konsultieren.
   8. Achte darauf, dass der Knochen zu brechen beginnt (auf der Zugseite). Die meisten Tests werden so lange fortgesetzt, bis ein Fehler auftritt. An diesem Punkt wird der Test über seine programmierten Grenzwerte beendet. Wenn ein Fehler auftritt, sich der Prüfer jedoch weiterhin bewegt, stoppen Sie den Test manuell, um eine Beschädigung der Wägezelle zu vermeiden.
   9. Sobald die Prüfung abgeschlossen ist, messen Sie die Länge vom distalen Ende bis zum Bruchpunkt mit Messschiebern und zeichnen Sie sie auf.
   10. Wiederholen Sie die Schritte 5.4.1 – 5.4.9 für jede Probe.

Abbildung 1: Aufbau des mechanischen Prüfgeräts. (A) Dreipunkt- und (B) Vierpunktbiegeversuche. Die Wägezelle ist gelb, die Ladevorrichtungen blau und die Stützvorrichtungen grün dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Orientierung der Knochen zwischen den Vorrichtungen . (A) Korrekte Ausrichtung eines Oberschenkelknochens in Dreipunkt-Biegebelastungsvorrichtungen, die bei korrekter Positionierung (von oben nach unten) Ansichten von der medialen, vorderen und hinteren Seite des Oberschenkelknochens zeigen. Die Ladevorrichtungen sind in Orange und die Stützvorrichtungen in Blau dargestellt. Die unteren Spannweiten sollten so eingestellt werden, dass sie so viel wie möglich vom geradesten Teil der Diaphyse umfassen, und die obere Vorrichtung sollte zwischen diesen Spannweiten zentriert sein. (B) Korrekte Ausrichtung eines Schienbeins für die Vier-Punkt-Beugung, die (von oben nach unten) Ansichten von der vorderen, lateralen und medialen Seite des Schienbeins zeigt. Der Knochen sollte so belastet werden, dass die mediale Fläche die untere Vorrichtung und die laterale Fläche die obere Vorrichtung berührt. Die Verbindung zwischen Schienbein und Wadenbein sollte knapp außerhalb der Belastungsspanne platziert werden. Die Spannweiten sollten so eingestellt werden, dass sie ein Verhältnis von Last zu Auflager von 1:3 bestmöglich erfüllen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

6. ROI-Auswahl

1. Nachdem die Bruchlängen aufgezeichnet wurden, laden Sie die gedrehten Bilder in die Software der Wahl des Benutzers. Sobald die gedrehten Bilder geladen sind, lokalisieren und notieren Sie die oberen und unteren Schichten des Knochens.
2. Berechnen Sie die Differenz zwischen der oberen und der unteren Schicht. Multiplizieren Sie diesen Wert mit der Größe des Scan-Voxels, um die Gesamtlänge des Knochens in Mikrometern zu bestimmen.
3. Um die Frakturstelle im CT-Scan zu lokalisieren, dividieren Sie die aufgezeichnete Bruchlänge (in Mikrometern) durch die Voxelgröße, um die Anzahl der μCT-Schichten vom distalen Ende des Scans bis zum Bruchpunkt zu erhalten.
4. Wählen Sie eine ROI aus, die an dieser Position zentriert ist. Stellen Sie zunächst die gewünschte Gesamtlänge des ROI ein (mindestens 100 μm). Ermitteln Sie die Anzahl der Schichten, die diese Länge darstellt, indem Sie die Länge in Mikrometern durch die Voxelgröße dividieren, um die Gesamtzahl der Segmente im ROI zu bestimmen.
5. Um die untere Grenze der ROI zu erhalten, dividieren Sie die Gesamtzahl der ROI-Slices durch 2 und subtrahieren Sie diesen Wert von der zuvor berechneten Unterbrechungsposition in Schritt 6.4.
6. Addieren Sie die Gesamtlänge des ROI in Segmenten zum zuvor berechneten Wert, um die Obergrenze des ROI zu erhalten.
7. Wählen Sie den entsprechenden ROI basierend auf berechneten Grenzen aus, und speichern Sie ihn.

7. Normalisierung von Kraft- und Wegdaten

HINWEIS: Der mechanische Prüfer erzeugt nur Punkte mit x- und y-Koordinaten (Verschiebung, Kraft). Diese Punkte können mit Hilfe der Euler-Bernoulli-Biegespannungs- und Dehnungsgleichungen in Spannung und Dehnung umgewandelt werden, erfordern jedoch geometrische Eigenschaften, die aus μCT-Scans gewonnen werden. Die Quantifizierung dieser Eigenschaften kann mit der bevorzugten Software des Benutzers durchgeführt werden. Wir bevorzugen einen benutzerdefinierten Code, der die vollständige Kontrolle über alle Eingaben, Berechnungen und Ausgaben bietet. Wie bereits erwähnt, wenden Sie sich für den Zugriff auf den Code direkt an den korrespondierenden Autor oder besuchen Sie die Lab-Website unter https://bbml.et.iupui.edu/, um weitere Informationen zu erhalten. Die Spannungs- und Dehnungsgleichungen sowie die notwendigen geometrischen Eigenschaften, die aus μCT-Scans gewonnen werden müssen, um diese zu berechnen, werden im Folgenden erläutert.

1. Dreipunkt-Biegenormalisierungsgleichungen
   1. Die Gleichung, die zur Berechnung der Spannung bei der Dreipunktbiegung verwendet wird, ist unten in Gleichung 1 dargestellt. In dieser Gleichung steht "F" für die Kraft und "L" für die Länge der Auflagespannweite. Kraftwerte werden während der Prüfung vom mechanischen Prüfgerät aufgezeichnet. Stellen Sie sicher, dass die Länge der Stützspanne vor der Prüfung aufgezeichnet wird. "c" und "I" sind geometrische Eigenschaften, die mit Hilfe von μCT-Scans berechnet werden (Abschnitt 7.3).
      (1)
   2. Die Gleichung zur Berechnung der Dehnung ist unten in Gleichung 2 dargestellt. "c" und "L" stellen die gleichen Eigenschaften für Spannungs- und Dehnungsberechnungen dar. "d" steht für Wegwerte, die vom mechanischen Prüfgerät während der Prüfungen aufgezeichnet werden.
      (2)
2. Vier-Punkt-Biegenormalisierungsgleichungen
   1. Die Gleichung für die Spannung bei der Vierpunktbiegung ist unten in Gleichung 3 dargestellt. "F" und "I" bleiben die gleichen Variablen, die in Schritt 7.1.1 besprochen wurden. Berechnen Sie "a" aus den Messungen des Stütz- und Lastspanns vor der Prüfung. Bei Einhaltung des empfohlenen Verhältnisses von 3:1 für Stütze zu Lastspannweite für Vierpunktbiegung beträgt "a" ein Drittel der Länge des Auflagerfeldes.
      (3)
   2. Die Gleichung für die Dehnung bei der Vierpunktbiegung ist unten in Gleichung 4 dargestellt. "c" und "a" bedeuten die gleichen Eigenschaften für Spannungs- und Dehnungsberechnungen. "d" steht für die Wegwerte, die der mechanische Prüfer während der Prüfungen aufzeichnet.
      (4)
3. Berechnung geometrischer Eigenschaften aus μCT-Scans
   1. Die Variable "c" stellt den Abstand von der neutralen Achse zur Oberfläche des Knochens dar, der unter Zug belastet wurde. Bestimmen Sie daher den Schwerpunkt jedes Querschnitts in den μCT-Scans, da die neutrale Achse durch den Schwerpunkt verläuft.
      1. Folgt man der in Schritt 5.2.6 beschriebenen Prüforientierung eines Oberschenkelknochens in Dreipunktbiegung, so ist "c" in Bezug auf die vordere Fläche zu messen.
      2. Folgt man der in Schritt 5.2.7 beschriebenen Testorientierung eines Schienbeins, so ist "c" in Bezug auf die mediale Oberfläche des Knochens zu messen.
   2. Die Variable "I" stellt das flächenmäßige Trägheitsmoment um die Biegeachse dar (die medial-laterale Achse bei einem Oberschenkelknochen, die anterior-posteriore Achse bei einer Tibia). Berechnen Sie diesen Wert mit Gleichung 5. In dieser Gleichung ist "dA" die Fläche jedes Pixels, die im μCT-Scan erfasst wird, während y der berechnete Abstand jedes Pixels von der neutralen Achse ist.
      (5)

8. Mechanische Prüfeigenschaften von Interesse

1. Bevor Sie mechanische Eigenschaften berechnen, erstellen Sie eine Kraft-Weg-Kurve und eine Spannungs-Dehnungs-Kurve (ideale Kurven sind unten in Abbildung 3 zusammen mit signifikanten Eigenschaften dargestellt).
   HINWEIS: Das Testen biologischer Proben erzeugt nicht immer Kurven, die wie diese idealisierten Beispiele aussehen, aber sie bleiben ein nützlicher Anhaltspunkt.
2. Untersuchen Sie diese Kurven vor der Analyse, um Fehler beim Testen zu erkennen, z. B. ein rollendes oder rutschendes Knochen. Diese Fehler verursachen in der Regel Unebenheiten oder flache Bereiche im anfänglichen linearen Teil der Kurve. Entfernen Sie an dieser Stelle überschüssige Daten, einschließlich aller Daten, die möglicherweise vor dem Kontakt des Testers mit dem Knochen oder Daten nach einem Ausfall gesammelt wurden.
3. Sobald Sie sich durch die gezeichneten Kurven eines Qualitätstests vergewissert haben, beginnen Sie mit der Analyse der signifikanten Eigenschaften.
   1. Steifigkeit und Elastizitätsmodul
      1. Berechnen Sie die Steifigkeit nur anhand des elastischen Bereichs der Kraft-Weg-Kurve. Die Steigung der Kurve in diesem Bereich ist die Steifigkeit.
      2. Berechnen Sie den Elastizitätsmodul nur anhand der Steigung des elastischen Teils der Spannungs-Dehnungs-Kurve.
   2. Streckgrenze
      ANMERKUNG: Es gibt zwei Streckgrenzen, einen auf der Kraft-Weg-Kurve und einen auf der Spannungs-Dehnungs-Kurve. Die (x,y)-Werte für diesen Punkt aus der Kraft-Weg-Kurve werden als Verschiebung zu Fließstrecke und Fließkraft bezeichnet, während die Werte aus der Spannungs-Dehnungs-Kurve als Dehnung zu Fließstrecke und Fließspannung bezeichnet werden. Diese Punkte stellen das Ende des elastischen Bereichs der Kurve dar und können auf die unten aufgeführten Arten gefunden werden.
      1. Spannungs-Dehnungs-Kurvenmethode: Berechnen Sie einen Linienversatz von (0,0) um 0,2 % Dehnung (2.000 Mikrodehnung), aber mit der gleichen Steigung wie der Elastizitätsmodul. Zeichnen Sie diese Linie auf dem Spannungs-Dehnungs-Diagramm auf. Die Position, an der diese Linie die Spannungs-Dehnungs-Kurve schneidet, wird als Streckgrenze definiert. Verwenden Sie diese Fließspannungs- und Dehnungskoordinate, um die analogen Kraft- und Wegwerte zu ermitteln. Diese Werte stellen die Streckgrenze und die Verschiebung zu den Streckgrenzen dar.
      2. Sekantenmethode: Berechnen Sie die Steifigkeit aus der Kraft-Weg-Kurve und reduzieren Sie die Steifigkeit um einen bestimmten Prozentsatz (5-10%). Zeichnen Sie eine Linie, die bei (0,0) beginnt, mit der Steigung dieser reduzierten Steifigkeit, und lassen Sie sie mit der Kraft-Weg-Kurve schneiden. Der Schnittpunkt hat die Koordinaten (Verschiebung zum Weichen, Streckkraft).
         ANMERKUNG: Die Sekantenmethode kann verwendet werden, um die Streckgrenze ohne Spannungs-Dehnungs-Daten zu ermitteln.
   3. Ultimative Kraft und ultimative Spannung
      1. Berechnen Sie die Bruchkraft und die Bruchspannung, indem Sie den Maximalwert in den jeweiligen Datensätzen finden.
   4. Verschiebungs- und Dehnungseigenschaften
      1. Die Werte für die Verschiebung bis zur Streckgrenze und die Dehnung bis zur Streckgrenze stellen die Verschiebung oder Dehnung bis zur Streckgrenze dar. Um sie zu finden, suchen Sie die Ausbeute wie in Schritt 8.3.2 beschrieben.
      2. Die Werte für die Gesamtverschiebung und die Gesamtdehnung stellen die Gesamtverschiebung oder Gesamtdehnung dar, der eine Probe während des gesamten Tests ausgesetzt war, und entsprechen dem Versagenspunkt.
      3. Verschiebung nach Fließgrenze und Nachstreckungsdehnung: Die Verschiebung nach der Fließgrenze wird häufig gemeldet und kann berechnet werden, indem die Verschiebung von der Gesamtverdrängung zur Ausbeute abgezogen wird. Berechnen Sie die Nachdehnung, indem Sie die Dehnung von der Gesamtdehnung subtrahieren, aber geben Sie dies mit Vorsicht an, da die Dehnung zunächst unter der Annahme abgeleitet wird, dass das Material linear elastisch ist (Vorstrecke). Dies macht eine Nachertragskennzahl anfällig für Ungültigkeit.
   5. Energetische Eigenschaften
      1. Berechnen Sie die Energie als Fläche unter der Kraft-Weg- oder der Spannungs-Dehnungs-Kurve.
      2. Die Fläche unter der Kraft-Weg-Kurve wird als Arbeit bezeichnet. Die Fläche, die unter dem Teil vor der Fließgrenze der Kurve berechnet wird, oder der elastische Bereich, wird als elastische Arbeit oder Energie bezeichnet. Die Fläche, die unter der Kurve nach der Streckgrenze berechnet wird, oder der plastische Bereich, wird als Nachstreckgrenze oder plastische Arbeit oder Energieverlust bezeichnet.
      3. Die berechnete Gesamtfläche unter der Spannungs-Dehnungs-Kurve wird als Zähigkeit oder Zähigkeitsmodul bezeichnet, während die unter der Spannungs-Dehnungs-Kurve bis zur Streckgrenze berechnete Fläche als Elastizität bezeichnet wird. Die Zähigkeit nach der Fließgrenze wird, wie die Nachdehnung, aufgrund der Annahmen der Dehnungsgleichungen, unter die diese Eigenschaft nicht fällt, oft nicht angegeben.

Abbildung 3: Kraft-Weg- und Spannungs-Dehnungs-Kurven. (A) Ideale Kraft-Weg-Kurve; (B) ideale Spannungs-Dehnungs-Kurve mit der Linie, die aus der 0,2%-Offset-Methode abgeleitet wurde, die zur Berechnung der rot dargestellten Streckgrenze verwendet wird (beachten Sie, dass diese Linie die gleiche Steigung wie die des elastischen Bereichs der Kurve hat). Zu den wichtigsten Eigenschaften, die aus der Kraft-Weg-Kurve ermittelt werden können, gehören die Streckgrenze, die Tragfähigkeit, die Verschiebung zur Streckgrenze, die Gesamtverschiebung und die Arbeit. Zu den Eigenschaften auf Gewebeebene, die aus der Spannungs-Dehnungs-Kurve gewonnen werden können, gehören Fließspannung, Dauerspannung, Dehnung bis Streckgrenze, Gesamtdehnung, Elastizität und Zähigkeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Representative Results

Nach Abschluss der CT-Untersuchung können die meisten unzureichenden Scans bei der Rekonstruktion erfasst werden. Schlechte Scans weisen häufig eine hohe Fehlausrichtungskompensation auf, die ein klarer Indikator für einen Fehler während des Scans ist. In anderen Schritten können jedoch Fehler auftreten, die ebenfalls zu ungenauen Daten führen können. Diese Fehler sind oft bei der Untersuchung der einzelnen berechneten architektonischen Eigenschaften zu erkennen. Wenn die Werte weit außerhalb des Bereichs der anderen in einer Gruppe liegen, sollten der Scan, der ROI und die Methode zur Berechnung der Eigenschaften erneut überprüft werden.

Sobald die Biegetests abgeschlossen sind, sollten die Kraft-Weg-Diagramme aus jedem Test untersucht werden, um schlechte Tests zu identifizieren, die möglicherweise aus dem Datensatz entfernt werden müssen. Ein Beispiel für einen problematischen Test ist in Abbildung 4 dargestellt. Das Diagramm in Abbildung 4A zeigt die Ergebnisse eines korrekt durchgeführten Biegeversuchs. Es gibt einen klaren linearen Bereich, in dem eine Vorspur mit geringer Neigung fehlt, eine Streckgrenze, einen Endpunkt (Maximalkraft), einen Kraftabfall, wenn sich die Verschiebung über die Maximalkraft hinaus erstreckt, und einen Bruchpunkt. Die Kurve ist glatt und es treten keine abrupten Änderungen der Belastung auf, bis der Endpunkt erreicht ist. Folglich können Eigenschaften aus diesem Test leicht identifiziert und als vertrauenswürdig eingestuft werden. Das in Abbildung 4B gezeigte Diagramm zeigt das Ergebnis eines Biegeversuchs mit mehreren besorgniserregenden Merkmalen. Die abrupten Änderungen der Belastung und das Auftreten mehrerer Peaks im Diagramm sind wichtige Indikatoren für Probleme mit diesem Test. Während bei einem ordnungsgemäßen Test geringfügige Spitzen in der Nähe der Endkraft auftreten können, deuten die Größe und Anzahl der Spitzen in diesem Diagramm darauf hin, dass der Knochen während des Tests umgekippt sein könnte. Unabhängig davon, ob sie während des Tests oder bei der Untersuchung der Tests vor der Analyse beobachtet und notiert wurden, sollten die Probendaten während der Analyse nach dem Test untersucht werden. Wenn die Daten tatsächlich fehlerhaft sind oder weit außerhalb des Bereichs anderer Stichproben in der Gruppe liegen, wäre es ideal, diesen Test nicht in den endgültigen Datensatz aufzunehmen. Dies ist einer der Gründe, warum das Experiment mit priori-Power-Berechnungen ordnungsgemäß betrieben werden sollte. Es könnte möglich sein, nur bestimmte Eigenschaften aus einer Probe zu melden (in diesem Fall könnten Eigenschaften vor der Fließgrenze akzeptabel sein), aber dies ist nicht ideal und sollte bei der Meldung klar erklärt werden.

Abbildung 4: Kraft-Weg-Diagramme. (A) Ideales Kraft-Weg-Diagramm. (B) Kraft-Weg-Diagramm als Ergebnis eines schlechten Biegeversuchs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Wenn alle Kraft-Weg-Diagramme untersucht und die Werte auf die Spannungsdehnung normiert werden, können die interessierenden Eigenschaften auf verschiedene Weise identifiziert und dargestellt werden. In Abbildung 5 sind die resultierenden Kraft-Weg- und Spannungs-Dehnungs-Diagramme für eine gesamte Studie dargestellt. Dabei handelt es sich um schematische Darstellungen, bei denen die Kraft und die Verschiebung am Startpunkt (0,0), die Streckgrenze, der Endpunkt und das Versagen für jeden Knochen bestimmt werden und dann die Kraft/Spannung und die Verschiebung/Dehnung gemittelt werden, um ein Durchschnittsdiagramm für jede Gruppe zu erhalten. Die Diagramme werden nicht für statistische Analysen verwendet, aber sie können verwendet werden, um zu zeigen, wie das Gesamtverhalten aufgrund von Faktoren wie einer Behandlung oder einem Krankheitszustand variiert. Die in Abbildung 5 gezeigten Diagramme stammen aus einer Studie, in der Kontrollmäuse mit solchen verglichen wurden, die an Typ-2-Diabetes und chronischer Nierenerkrankung (T2D-CKD) litten. Das rechte Schienbein dieser Tiere wurde mittels Vier-Punkt-Biegung bis zum Versagen getestet und analysiert, um die in Protokollabschnitt 8 beschriebenen Eigenschaften zu erhalten. Aus Abbildung 5 geht hervor, dass die T2D-CKD-Gruppe reduzierte mechanische Eigenschaften, einschließlich Festigkeit und Steifigkeit, sowohl auf struktureller als auch auf Gewebeebene aufwies. Diese Mäuse scheinen auch reduzierte Nachertragseigenschaften zu haben, ein Indikator für Sprödigkeit. Diese Diagramme sollten nicht verwendet werden, um endgültige Schlussfolgerungen aus einer Studie zu ziehen. Vielmehr dienen sie als visuelle Darstellung und sollten durch eine statistische Analyse aller interessierenden Eigenschaften verifiziert werden.

Abbildung 5: Kraft-Weg- und Spannungs-Dehnungs-Diagramme für eine gesamte Studie . (A) Kraft-Verdrängungs-Diagramm für Kontrolltiere und Tiere, die durch Typ-2-Diabetes und chronische Nierenerkrankungen induziert werden. Dieses Diagramm ergab sich aus der Mittelung der Streckgrenze, der Verschiebung zur Streckgrenze, der Bruchkraft, der Tragfähigkeit, der Tragfähigkeit, der Versagenskraft und der Gesamtverschiebung für jede Gruppe und der Darstellung dieser Mittelwerte zusammen mit der Standardabweichung. (B) Stressbelastung für Kontrolltiere und T2D-CKD-Tiere. Dieses Diagramm ergab sich aus der Mittelung der Fließspannung, der Dehnung zur Streckgrenze, der Endspannung, der Bruchdehnung, der Versagensspannung und der Gesamtdehnung und der Darstellung der resultierenden Mittelwerte zusammen mit der Standardabweichung. Abkürzung: T2D-CKD = durch Typ-2-Diabetes und chronische Nierenerkrankungen ausgelöste Tiere. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die mechanischen Daten und Ergebnisse eines zweiseitigen t-Tests sind in Tabelle I dargestellt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Eine allgemeine Untersuchung schlägt Daten vor, die innerhalb der richtigen Bereiche und mit erwarteten Variabilitätsgraden liegen. Beachten Sie, dass Postyield-Eigenschaften in der Regel die größte Variation aufweisen und daher häufig die größten Stichprobenumfänge erfordern, um aussagekräftige Unterschiede zu erkennen. Wie die schematischen Kurven in Abbildung 5 zeigen, gibt es signifikante Abnahmen bei fast allen strukturellen und gewebespezifischen mechanischen Eigenschaften. Aus diesen Daten kann geschlossen werden, dass der induzierte Krankheitszustand zu Knochen führte, die schwächer, weniger steif und anfälliger für Frakturen sind, da die Verformbarkeit verloren geht und die Zähigkeit vermindert ist. Studien mit nuancierteren Vergleichen sind möglicherweise nicht so einfach zu interpretieren. Ein Beispiel hierfür kann sein, wenn signifikante Verbesserungen bei den mechanischen Eigenschaften auf struktureller Ebene beobachtet werden, aber nicht bei den mechanischen Eigenschaften auf Gewebeebene. In diesem Fall sind die beobachteten Effekte wahrscheinlich eher auf Veränderungen in der Architektur des Knochens (z. B. vergrößerte Fläche, erhöhte kortikale Dicke) als auf Verbesserungen der Knochenqualität auf Gewebeebene zurückzuführen. Zum Beispiel hat sich die Knochenfläche aufgrund des Zuwachses an gewebtem Knochen vergrößert, aber die Gewebequalität hat abgenommen, da jetzt ein unorganisierter gewebter Knochen anstelle eines organisierten lamellären Knochens vorhanden ist. Dies könnte durch eine μCT-Analyse unterstützt werden, bei der statistisch signifikante Verbesserungen in der Architektur beobachtet werden können. Im Gegensatz dazu kann es signifikante Verbesserungen der mechanischen Eigenschaften auf Gewebeebene geben, während die mechanischen Eigenschaften auf struktureller Ebene nur minimal/gar nicht verbessert werden. Diese hohe Gewebequalität könnte die Fallstricke kleinerer Knochen kaschieren. Die Dateninterpretation kann noch komplizierter werden, wenn Änderungen bei den Eigenschaften vor der Fließgabe, aber nicht bei den Eigenschaften nach der Fließgrenze beobachtet werden oder umgekehrt. Im ersten Fall kann eine Veränderung der Fähigkeit des Knochens, Verformungen zu widerstehen, verbessert werden, während seine Fähigkeit, Schäden zu tolerieren, nicht verbessert wird. In jedem dieser Fälle ist die Möglichkeit, architektonische Eigenschaften aus der μCT-Analyse zu referenzieren, sehr vorteilhaft und sollte genutzt werden (obwohl die Beschreibung dieser Methode den Rahmen dieses Artikels sprengen würde). Aufgrund der Komplexität der Interpretation dieser Eigenschaften ermöglicht die Darstellung aller Eigenschaften in Tabellen- oder Abbildungsform (nicht nur die Eigenschaften, die tendenziell am einfachsten zu interpretieren sind, wie z. B. die Bruchkraft, oder die die Geschichte erzählen, die man erzählen möchte), eine vollständigere Darstellung der mechanischen Einwirkungen.

			Steuerung	T2D-CKD	P-Wert
Streckgrenze (N)			19,7 ± 2,9	15,2 ± 2,6	0.0032**
Ultimative Kraft (N)			22,8 ± 3	17,6 ± 3,4	0.0031**
Verschiebung zur Streckgrenze (μm)			205 ± 17	190 ± 21	0.1039
Verschiebung nach der Fließgrenze (μm)			246 ± 235	60 ± 51	0.0435*
Gesamtverdrängung (μm)			451 ± 230	249 ± 53	0.0278*
Steifigkeit (N/mm)			110 ± 10	91 ± 13	0.0037**
Arbeit bis zum Ertrag (mJ)			2,16 ± 0,45	1,54 ± 0,36	0.0055**
Nachtragsarbeiten (mJ)			4,24 ± 3,01	1,04 ± 0,9	0.0109*
Gesamtarbeit (mJ)			6,4 ± 2,88	2,58 ± 0,97	0.0025**
Streckgrenze (MPa)			180 ± 20	157 ± 25	0.0504
Bruchspannung (MPa)			209 ± 26	181 ± 27	0.0434*
Von der Sorte bis zum Ertrag (mɛ)			16,8 ± 2	16,4 ± 1,5	0.5771
Gesamtdehnung (mɛ)			36,6 ± 17,2	21,5 ± 4,3	0.0277*
Modul (GPa)			12,2 ± 1,1	10,9 ± 1,1	0.0171*
Belastbarkeit (MPa)			1,62 ± 0,33	1,38 ± 0,33	0.1377
Zähigkeit (MPa)			4,85 ± 2,29	2,26 ± 0,73	0.0076**

Tabelle 1: Ergebnisse mechanischer Tests und statistischer Analysen. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Die P-Werte resultieren aus einem zweiseitigen, ungepaarten t-Test. * P < 0,05 und ** P < 0,01. Abkürzung: T2D-CKD = durch Typ-2-Diabetes und chronische Nierenerkrankungen ausgelöste Tiere.

Discussion

Während des gesamten Scan- und Testprozesses gibt es Momente, in denen Fehlerbehebung und Optimierung angebracht sind. Die erste davon tritt auf, wenn Knochen mit μCT gescannt werden. Während viele Systeme mit einer Halterung geliefert werden, in der ein Objekt gehalten und gescannt werden kann, können benutzerdefinierte Halterungen hergestellt werden, um mehrere Knochen gleichzeitig zu scannen. Das Scannen mehrerer Knochen kann ein hervorragender Punkt für die Optimierung sein, aber während des gesamten Scan- und Analyseprozesses ist Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass keine Artefakte induziert werden. Da Röntgenstrahlen bei jedem Winkelschritt unterschiedliche Mengen an Knochengewebe durchdringen (und durch diese abgeschwächt werden), kann dies zu Ungenauigkeiten in den resultierenden Daten führen.

Ein zweiter Punkt zur Fehlersuche ist die Rekonstruktion von Scans. Je nach verwendetem Programm kann der Benutzer das Dichtefenster für die Rekonstruktion definieren, das aus den Dämpfungskoeffizientenwerten des Scans berechnet wird. Dies ist ein linearer Koeffizient, der verwendet wird, um darzustellen, wie stark der Röntgenstrahl von einem Objekt⁵ abgeschwächt wird. Einige Programme ermitteln diese Dichten und wandeln sie in einem Histogramm in Graustufenwerte von 0 bis 255 um. Zwei Werte werden in einem Histogramm angezeigt und werden als Kontrastgrenzen¹⁰ bezeichnet, die entsprechend eingestellt werden müssen, um die Erkennung von Knochen- und Nicht-Knochen-Voxeln zu ermöglichen. Der niedrigere Wert wird normalerweise auf einen Graustufenwert von Null eingestellt, während der höhere Kontrastwert auf 10-20 % der maximalen Dämpfung des interessierenden Materials (Knochen) eingestellt ^wird10. Bei der Analyse können Fehler auftreten, wenn dieser Wert nicht richtig festgelegt ist, da Teile der Daten abgeschnitten werden können. Folglich muss dieser Wert je nach gescannter Probe angepasst werden. Es empfiehlt sich, das Histogramm auf einer logarithmischen Skala anzuzeigen und die Obergrenze als Zahl auszuwählen, die etwas größer als das Ende des logarithmischen Schwanzes ist, um sicherzustellen, dass alle Knochendaten enthalten sind¹⁰.

Zusätzliche Punkte für die Fehlersuche ergeben sich bei mechanischen Tests und Analysen. Während der Prüfung und der Anzeige von Kraft-Weg-Kurven nach dem Test können gerollte Proben entdeckt werden und sollten aus dem Datensatz entfernt werden, wie in den repräsentativen Ergebnissen beschrieben. Darüber hinaus ist bei der Ausrichtung des Knochens Vorsicht geboten, da es Annahmen gibt, die die Form des zu testenden Knochens bestimmen. Bei der Verwendung von Euler-Bernoulli-Biegegleichungen zur Berechnung von Spannung und Dehnung wird davon ausgegangen, dass die Probe einen gleichmäßigen Querschnitt entlang ihrer Länge³ aufweist. Da die meisten Knochen keinen einheitlichen Querschnitt haben, ist es am besten, den gleichmäßigsten Bereich des zu prüfenden Knochens auszuwählen (über die gesamte Stützspannweite bei Dreipunktbiegung oder zwischen den Belastungspunkten bei Vierpunktbiegung).

Bei einem Oberschenkelknochen wird die Prüfung in Dreipunktbiegung am Mittelschaft bevorzugt. Wegen der sanften Krümmung des Knochens sollte man in Richtung der Krümmung testen, um ein lokales Einknicken der Oberfläche zu verhindern (d. h. den Oberschenkelknochen mit der vorderen Fläche unter Spannung zu testen). Das Schienbein hat eine variablere Querschnittsform, so dass die ideale Region für die Untersuchung direkt in der Nähe des Übergangs von Schienbein und Wadenbein beginnt. Wenn der Knochen mit der medialen Oberfläche unter Spannung steht, ist der zu prüfende Knochenbereich flach und weist die geringste Variabilität in Radius und Trägheitsmoment in Biegerichtung auf. Auch bei der Interpretation der Ergebnisse der Biegeversuche ist Vorsicht geboten, da davon ausgegangen wird, dass das Material isotrop, homogen und linear elastisch ist – jede dieser Annahmen wird bei der Prüfung von Knochen³ bis zu einem gewissen Grad verletzt. Die Unfähigkeit von Bone, diese Annahmen zu erfüllen, führt zu Ergebnissen von Biegeversuchen, die mit Vorsicht interpretiert werden müssen. Die Eigenschaften, die am sorgfältigsten interpretiert werden müssen, sind diejenigen, die aus der Spannungs-Dehnungs-Kurve über die Streckgrenze hinaus abgeleitet werden, da das Überschreiten der Streckgrenze definitionsgemäß gegen die linear-elastische Annahme verstößt. Während eine Normalisierung auf die Knochenform durchgeführt werden kann, wird nicht empfohlen, zu versuchen, sie auf das Körpergewicht des Tieres zu normalisieren, es sei denn, es gibt grobe Unterschiede zwischen den Gruppen. In diesem Fall kann eine Kovarianzanalyse durchgeführt werden, um diese Unterschiede auszugleichen, aber eine allgemeine Normalisierung auf das Körpergewicht sollte in den meisten Fällen vermieden werden.

Trotz der Probleme bei der Fehlerbehebung, die während dieses Prozesses auftreten können, liefern Biegeversuche mechanische Eigenschaften, die die Bruchanfälligkeit eines Knochens beschreiben können. Diese Tests sind auch relativ einfach und schnell durchzuführen. Obwohl die absoluten Werte aus diesen Tests nicht immer vollständig gültig sind, kann die Fähigkeit, relative Unterschiede zwischen Gruppen zu erkennen, für Proben unterschiedlicher Größe und Form recht genau sein. Die erhaltenen mechanischen Eigenschaften bieten funktionelle Relevanz für Studien, bei denen Unterschiede im Knochen zu erwarten sind. Obwohl monotone Versagensprüfungen die gebräuchlichsten und leicht zugänglichen mechanischen Prüfungen sind, können andere Methoden, einschließlich Ermüdungslebensdauer und Bruchzähigkeit, zusätzliche mechanische Eigenschaften von Interesse aufdecken und in Betracht gezogen werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAn	Bruker	NA	CT Scan Analysis Software
DataViewer	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Coding platform used for data analysis
NRecon	Bruker	NA	CT Scan Reconstruction software
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software	Micro Photonics Inc	SKY-016814	Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object