Praktiska överväganden för utformning, utförande och tolkning av studier som omfattar böjningstester av gnagare

Summary

Mekanisk testning av ben från gnagare är en värdefull metod för att få fram information om benets benkänslighet för frakturer. I brist på praktisk förståelse kan resultaten övertolkas eller sakna validitet. Detta protokoll kommer att fungera som en guide för att säkerställa att mekaniska tester utförs korrekt för att ge giltiga och funktionella data.

Abstract

Skelettskörhet som leder till frakturer är en amerikansk folkhälsokris som resulterar i 1,5 miljoner frakturer varje år och 18 miljarder dollar i direkta vårdkostnader. Förmågan att förstå mekanismerna bakom bensjukdom och svaret på behandling är inte bara önskvärd, utan avgörande. Mekanisk testning av ben fungerar som en värdefull teknik för att förstå och kvantifiera ett bens känslighet för frakturer. Även om denna metod verkar enkel att utföra, kan olämpliga och felaktiga slutsatser dras om styrande antaganden och viktiga steg ignoreras av användaren. Detta har observerats inom olika discipliner eftersom studier fortsätter att publiceras med missbruk av metoder och felaktig tolkning av resultat. Detta protokoll kommer att fungera som en primer för de principer som är förknippade med mekanisk testning tillsammans med tillämpningen av dessa tekniker - från överväganden av provstorlek genom vävnadsskörd och lagring, till dataanalys och tolkning. Med detta i handen kan värdefull information om ett bens känslighet för frakturer erhållas, vilket ökar förståelsen för både akademisk forskning och kliniska lösningar.

Introduction

Mekanisk testning av ben är den primära metoden för att extrahera funktionell information relaterad till ett bens känslighet för frakturer. I prekliniska studier kan flera testmodaliteter användas, men den överlägset vanligaste är böjning av långa ben. Dessa tester är enkla att utföra och kan användas på ben som varierar i storlek från människa till mus. Eftersom möss är ett av de mest studerade djuren i preklinisk forskning, kommer detta protokoll att fokusera på böjningstester som utförs på lårbenet och skenbenet hos möss.

Innan böjningstester utförs måste benen skördas och förvaras på rätt sätt. De vanligaste lagringsmetoderna har traditionellt varit att frysa ben i saltindränkt gasväv, frysa i enbart saltlösning eller torka ben i etanol ¹. Ben lagrade i etanol har visat sig ha ökad styvhet och elasticitetsmodul och minskade deformationsparametrar jämfört med de lagrade frysta¹. Inte ens rehydrering av benen före testning återställer dessa egenskaper till normala nivåer ¹. Förvaring nedsänkt i koksaltlösning kan orsaka skador på benet eftersom trycket utövas när saltlösningen expanderar. Dessutom skulle en fullständig upptining av lösningen krävas för att avlägsna benen för mikrodatortomografi (μCT). Frysning av nyskördade ben i saltindränkt gasväv har därför blivit standardlagringsmetoden och rekommenderas i hela detta protokoll.

Eftersom storleken och formen på ett ben påverkar dess bulkstyrka och många sjukdomsmodeller avsevärt förändrar benstorlek och morfologi, används tekniska principer för att normalisera bort effekterna av storlek för att producera egenskaper som uppskattar vävnadens beteende². Detta tillvägagångssätt kräver tvärsnittsgeometri för felplatsen, som oftast förvärvas med hjälp av μCT för att skapa skanningar av benen före testning. μCT används ofta på grund av dess tillgänglighet och höga bildupplösning. Dessutom ingår inte bidrag från mjukvävnad, och skanning kräver inte kemisk fixering eller andra modifieringar av benet ^3,4. I alla former av CT fokuseras en röntgenkälla på ett objekt medan en detektor på andra sidan av objektet mäter den resulterande röntgenenergin. Detta ger en röntgenskugga av provet som kan omvandlas till en bild ^3,5. Objektet som skannas roteras (eller röntgenkällan och detektorn roteras runt provet), vilket genererar bilder som kan rekonstrueras till en tredimensionell datauppsättning som representerar objektet⁵.

Skanningsupplösningen, eller hur nära varandra två objekt kan vara och fortfarande lösas individuellt, styrs genom att ändra den nominella voxelstorleken eller storleken på en pixel i den resulterande bilden. Det är allmänt accepterat att objekt måste vara minst två gånger så stora som en enda voxel för att kunna identifieras³, men ett högre förhållande möjliggör förbättrad precision. Vidare är större voxlar mer benägna att drabbas av partiella volymeffekter: när en enda voxel innehåller vävnader med varierande densitet tilldelas den genomsnittet av dessa densiteter, snarare än den specifika densiteten av en enda vävnad, vilket kan leda till en över- eller underskattning av vävnadsområden och mineraldensitet³. Även om dessa problem kan mildras genom att välja mindre voxelstorlekar, säkerställer användning av en högre upplösning inte eliminering av partiella volymeffekter och kan kräva längre skanningstider³. Vid skanning av ben ex vivo rekommenderas i allmänhet en voxelstorlek på 6-10 μm för att noggrant bedöma den trabekulära arkitekturen hos musben. En större voxelstorlek på 10-17 μm kan användas för kortikalt ben, även om den minsta rimliga voxelstorleken bör användas. Detta protokoll använder en voxelstorlek på 10 μm, vilket är tillräckligt litet för att differentiera viktiga trabekulära egenskaper och minimera partiella volymeffekter utan omfattande skanningstid.

Röntgenenergi och energifilterinställningar måste också väljas noggrant, eftersom den höga mineraltätheten och tjockleken på benvävnaden kraftigt dämpar och förändrar det överförda röntgenenergispektrumet. Det antas allmänt att eftersom det emitterade röntgenspektrumet är ekvivalent med spektrumet som lämnar objektet⁶, kan användning av lågenergiröntgenstrålar på täta föremål som ben leda till en artefakt som kallas strålhärdning⁷. En högre spänning på 50-70 kVp rekommenderas vid skanning av benprover för att minska förekomsten av dessa artefakter⁵. Att sätta in ett energifilter av aluminium eller koppar skapar dessutom en mer koncentrerad energistråle, vilket ytterligare minimerar artefakter ^4,7. Ett 0,5 mm aluminiumfilter kommer att användas under hela detta protokoll.

Slutligen styr skanningens rotationssteg och rotationslängd (t.ex. 180°-360°) tillsammans antalet bilder som tas, vilket bestämmer mängden brus i den slutliga skanningen⁴. Att ta ett genomsnitt av flera bildrutor i varje steg kan minska bruset men kan öka skanningstiden⁴. Detta protokoll använder ett rotationssteg på 0,7 grader och en bildruta på i genomsnitt 2.

En sista anmärkning om skanning: hydroxiapatitkalibreringsfantomer bör skannas med samma skanningsinställningar som experimentbenen för att möjliggöra omvandling av dämpningskoefficienter till mineraldensitet i g/cm³⁵. Detta protokoll använder fantomer på 0,25 g/cm3 och 0,75 g/^cm3 hydroxiapatit, även om olika fantomer finns tillgängliga. Observera att vissa skanningssystem använder interna fantomer som en del av den dagliga systemkalibreringen.

När skanningen är klar rekonstrueras vinkelprojektionerna till tvärsnittsbilder av objektet, vanligtvis med hjälp av tillverkarens medföljande programvara. Oavsett vilket system som används är det viktigt att se till att hela benet fångas upp i rekonstruktionen och att tröskelvärden sätts på lämpligt sätt för att möjliggöra igenkänning av ben kontra icke-ben. Efter rekonstruktionen är det viktigt att rotera alla skanningar i tre dimensioner så att benen orienteras konsekvent och korrekt i linje med den tvärgående axeln, återigen med hjälp av tillverkarens programvara.

Efter rotation kan regioner av intresse (ROI) för analys väljas baserat på om kortikala egenskaper, trabekulära egenskaper eller frakturgeometri för mekanisk normalisering önskas. För det senare bör ROI väljas efter testning genom att mäta avståndet från frakturstället till ena änden av benet och använda voxelstorlek för att bestämma motsvarande skivplats i skanningsfilen. Det valda området bör vara minst 100 μm långt, med brottpunkten i den ungefärliga mitten av ROI, för att ge adekvat uppskattning⁴.

Med ROI vald behövs två egenskaper för mekanisk normalisering (för att beräkna böjspänning och töjning): det maximala avståndet från den neutrala böjaxeln till ytan där fel initieras (antas vara ytan som belastas i spänning, bestäms av testuppställningen) och tröghetsmomentet runt den neutrala axeln (också beroende på testinställningen). Det här protokollet rekommenderar att du använder en anpassad kod för att fastställa dessa värden. För att få tillgång till koden, kontakta corresponding author direkt eller besök labbets webbplats på https://bbml.et.iupui.edu/ för mer information.

När μCT-skanningen har slutförts kan mekanisk testning påbörjas. Böjtester kan utföras i antingen fyrpunkts- eller trepunktskonfigurationer. Fyrpunktsböjningstester är att föredra eftersom de eliminerar skjuvspänning i benet mellan belastningspunkterna, vilket gör att ren böjning kan ske i denna region³. Benet kommer då att spricka på grund av spänning, vilket skapar ett fel som är mer representativt för de verkliga böjningsegenskaperna hos benet³. Benet måste dock belastas på ett sådant sätt att det ger samma belastning vid båda belastningspunkterna (detta kan underlättas med ett svängbart lasthuvud). I trepunktsböjningstester sker en stor förändring i skjuvspänningen där belastningspunkten möter benet, vilket gör att benet går sönder vid denna punkt på grund av skjuvning, inte spänning³. ASTM-standarder rekommenderar att material som genomgår böjning bör ha ett längd-till-bredd-förhållande på 16:1, vilket innebär att längden på stödspannet bör vara 16 gånger större än benets bredd för att minimera påverkan av skjuvning ^8,9. Detta är ofta omöjligt att uppnå när man testar ben från små gnagare, så belastningsspannet görs helt enkelt så stort som möjligt men med en så liten förändring i tvärsnittsform som möjligt. Dessutom, när man utför fyrpunktsböjning, bör förhållandet mellan längderna på det nedre och övre spannet vara ~3:1⁸, vilket vanligtvis kan uppnås i skenbenet, men det är svårt i det kortare lårbenet. Dessutom gör de tunnare kortikala väggarna i lårbenen dem mottagliga för deformation av ringtyp, vilket ändrar formen på bentvärsnittet under testet (detta kan accentueras i fyrpunktstester eftersom en större kraft krävs för att inducera samma böjmoment jämfört med trepunktsböjning). Därför kommer trepunktsböjning att användas för muslårben medan fyrpunktsböjning kommer att användas för skenben under hela detta protokoll.

Slutligen är det viktigt att driva studien på rätt sätt för statistisk analys. En allmän rekommendation för mekanisk testning är att ha en provstorlek på 10-12 ben per experimentgrupp för att kunna upptäcka skillnader, eftersom vissa mekaniska egenskaper, särskilt postyield-parametrar, kan vara mycket varierande. I vissa fall kan detta innebära att man börjar med en högre djururvalsstorlek med tanke på den bortfall som kan inträffa under studien. Analys av provstorlek med hjälp av befintliga data bör slutföras innan en studie görs.

Det finns många begränsningar och antaganden, men böjningstester kan ge ganska exakta resultat, särskilt när relativa skillnader mellan grupper är av intresse. Dessa egenskaper, tillsammans med analys av trabekulär arkitektur och kortikal morfologi, kan ge bättre insikt i sjukdomstillstånd och behandlingsregimer. Om vi är noga med de aspekter av experimentet som vi har kontroll över (t.ex. skörd, lagring, skanning och testning) kan vi känna oss säkra på att korrekta resultat har genererats.

Protocol

Alla procedurer som beskrivs i detta protokoll och som involverar djur har godkänts av Indiana University School of Science Institutional Animal and Use Committee (IACUC) före proceduren. Djur som beskrevs i proceduren avlivades via CO₂-inandning följt av cervikal luxation som en sekundär metod för avlivning.

1. Skörd, lagring och upptining av ben

1. Skörd och lagring
   1. Placera musen med den ventrala sidan uppåt. Använd en skalpell (eller ett rakblad eller en sax) för att göra ett snitt vid den ungefärliga korsningen mellan lårbenet och bäckenet på ena sidan.
   2. Fortsätt det första snittet dorsalt tills höftleden är lokaliserad; Leta efter lårbenshuvudet som ser ut som en liten vit sfär fäst vid bäckenet.
   3. Tryck med kanten på en skalpell på den proximala kanten av lårbenshuvudet tills lårbenshuvudet hoppar ut ur hylsan. Avlägsna ytterligare vävnad för att frigöra bakbenen från resten av slaktkroppen.
   4. Med bakbenet isolerat, separera skenbenet och lårbenet genom att inducera flexion i knäleden. Flytta skalpellen i medial-lateral riktning vid knäets främre yta för att skära igenom all angränsande vävnad, inklusive ligamenten mellan benen.
   5. Om detta inte separerar benen, förläng knäleden för att ge tillgång till den bakre ytan. Var noga med att undvika att skära av benet eller skrapa ledbrosket.
   6. När lårbenet och skenbenet har separerats, ta bort bakfoten från skenbenet genom att böja leden och använda en medial-lateral sågrörelse på ledens bakre yta. Förläng vid behov fogen för att exponera den främre ytan. Var försiktig så att du inte skär i benet.
   7. När du har isolerat, rengör benen från all vidhäftande mjukvävnad. Om du utför fyrpunktsböjningstester på skenbenet, ta bort vadbenet också. Fibula är förbunden med ligament i den proximala änden men är sammanväxt med skenbenet nära den distala änden av benet. Använd en vass sax nära anslutningspunkten för att separera vadbenet.
   8. Linda in de isolerade och rengjorda benen separat i saltindränkt gasväv och förvara dem vid -20 °C. Gör detta omedelbart efter skörden.
   9. Upprepa steg 1.1.1 till 1.1.8 för den andra sidan av slaktkroppen.
      OBS: Om det finns motstånd när du försöker separera benen i steg 1.1.4-1.1.6, är det bäst att upprepa stegen snarare än att försöka dra isär benen. Kraftiga rörelser kan leda till skador eller frakturer på benen.
2. Upptining
   OBS: Antalet frys-upptiningscykler som ett ben genomgår bör minimeras eftersom överdrivna frys-upptiningscykler kan påverka benets mekaniska egenskaper negativt. Partiell upptining för μCT-skanning kan uppnås genom att lämna benet i rumstemperatur i 5-10 minuter. Tina endast benet helt när du utför böjtester enligt beskrivningen nedan.
   1. Upptining över natten föredras
      1. Flytta benen från -20 °C förvaring till 1-4 °C i ett kylrum eller kylskåp. Se till att benen förblir där i 8-12 timmar för att tina helt innan du testar.
   2. Snabbt töväder
      1. Ställ in badets temperatur på cirka 37 °C. När du har uppnått denna temperatur lägger du benen i badet.
      2. Låt benen ligga i badet i ca 1 timme.

2. μCT-skanning

1. Linda in benen i parafilm före skanning för att bibehålla hydreringen. Behåll alla andra ben på is i väntan på att bli skannade.
2. När du är insvept i parafilm, placera benet i en hållare för att komma i kontakt med skannern. Se till att alla skannade ben är justerade i samma riktning eftersom konsekvent justering förenklar rotationen senare i analysen.
3. Justera skanningsinställningarna enligt applikationen för skanningen. Följande allmänna skanningsinställningar rekommenderas för musben: upplösning/voxelstorlek: 10 μm; pixelstorlek: medium, 2000 x 1048; filter: 0,5 mm aluminium; rotationssteg: 0,7; Medelvärde: 2.
   OBS: Dessa inställningar kan variera beroende på vilket system som används för att skanna, och tillverkarens och användarmanualen bör konsulteras vid behov.
4. När röntgenkällan är på, utför en platt fältkorrigering för att minimera artefakter. För att göra detta, se först till att kammaren är tom och stäng av det plana fältet.
5. Mät fältets genomsnittliga intensitet och justera den till 60 %. När du har uppnått 60 % uppdaterar du det platta fältet och aktiverar det igen.
6. Se till att den genomsnittliga intensiteten är nu (86-88%).
   OBS: Denna process kan variera beroende på vilket μCT-system som används. Se bruksanvisningen innan du försöker processen.
7. När planfältskorrigeringen har utförts, placera hållaren i kammaren. Se till att samples är centrerade och jämna innan du placerar piedestalen i kammaren.
8. När piedestalen är säkrad, stäng kammaren, se till att hela benet kommer att fångas i skanningen (en scout view kan vara nödvändig) och starta skanningen.
9. Efter skanningen förvaras benen på nytt i saltindränkt gasväv vid -20 °C.

3. Rekonstruktion av μCT

1. Välj en ROI som kommer att fånga hela benet i rekonstruktionen. För att göra detta, se det största tvärsnittet av ben och storlek ROI baserat på detta tvärsnitt.
2. Ställ in tröskelvärdet för programvaran för att möjliggöra korrekt igenkänning av ben jämfört med icke-ben. Det gör du genom att använda ett histogram där en nedre begränsning anges till 0 och den övre begränsningen anges i slutet av topphistogramdata.
3. Justera ytterligare inställningar, inklusive minskning av ringartefakter och strålhärdning till 5 % respektive 20 %. Kontrollera att feljusteringskompensationen ligger inom intervallet -7 till 7. Dessa värden kan variera beroende på programvaran. Se till att de är verifierade med användarmanualen och tillverkarens instruktioner innan du påbörjar rekonstruktionen.
   OBS: Artefakter kan minimeras under rekonstruktion med hjälp av korrigeringar för balkhärdning, ringartefakter och feljusteringskompensation. Kompensation för feljustering kan fungera som en indikator på skanningens kvalitet och om den ligger utanför ett intervall som anges av tillverkaren måste skanningen upprepas. Rekonstruktionsinställningarna kommer dock att vara programvaruberoende, och användarmanualen bör konsulteras.

4. μCT-rotation

OBS: När skanningarna har rekonstruerats måste de roteras för att fastställa konsekvent orientering över alla ben och för att säkerställa att tvärgående sektioner av det resulterande benet tas normalt till den längsgående axeln med så liten förskjutningsvinkel som möjligt. Detta bör göras med användarens valda programvara.

1. Lårbenets rotation
   1. Rotera lårbenet så att alla ben har samma längsgående orientering. Du kan till exempel orientera alla ben med den proximala änden av benet högst upp i skanningen.
   2. Rotera benet så att tvärsnittsorienteringen för alla ben är densamma. Rotera till exempel benen så att den främre sidan alltid är på höger sida av skanningarna.
   3. När dessa justeringar är gjorda, räta ut skanningen för att säkerställa att symmetrin bibehålls runt den centrala axeln.
   4. Spara den roterade datauppsättningen.
2. Skenbenets rotation
   1. Upprepa steg 4.1.1-4.1.4 för skenbenet.

5. Mekaniskt provningsförfarande

1. Förberedelse
   1. Före mekanisk testning, se till att en μCT-skanning med en upplösning på 6-10 μm har erhållits och rekonstruerats för att verifiera att en kvalitetsskanning har erhållits för varje prov för att beräkna tvärsnittsgeometrin vid brottstället (avsnitt 2-3).
   2. Med skanningar erhållna och verifierade, tina alla ben före testning (avsnitt 1). Testa alla ben från ett experiment samma dag och randomisera testordningen för att minimera användarbias och systemvariabilitet mellan prover och experimentgrupper. Se till att benen förblir hydrerade under hela testprocessen.
2. Installation av utrustning
   1. Leta reda på en lastcell med lämplig känslighet och kapacitet för provet. Tänk på det förväntade felintervallet för provet och välj en lastcell med ungefär 50 % mer kapacitet samtidigt som känsligheten maximeras (t.ex. en 10 lbf lastcell med en kapacitet på 45 N för ett musben i felintervallet 0-25 N).
   2. Lokalisera fixturer för lastning och stödspännvidd.
   3. Installera lastcellen och fixturerna som visas i figur 1 genom att skruva fast lastcellen på antingen testarens övre eller nedre stöd, den övre laddningsfixturen på lastcellen och den nedre fixturen på testarens bottenstöd. Se till att det sitter säkert.
      OBS: Att fästa lastcellen på den övre fixturen rekommenderas i allmänhet när man utför böjtester för att undvika att vätska kommer i kontakt med lastcellen, men botten kan användas vid behov.
   4. När lastcellen och fixturerna är installerade, välj en stödspännvidd och se till att den förblir konstant för alla samples som testas. För att välja ett stödspannsavstånd, lokalisera först det kortaste benet i sample uppsättningen.
   5. Orientera benet mellan fixturerna som visas i figur 2.
   6. För trepunktsböjning av lårbenet, följ figur 2A. Se till att den främre ytan av benet ligger mot stödspannet och att spännområdet ligger inom diafysen av sample. Undvik att inkludera den tredje trochantern i den proximala änden och övergångspunkten där benet vidgas till metafysen och kondylerna i den distala änden.
   7. För fyrpunktsböjning, se till att stöd- och lastspännvidderna är inriktade och centrerade med varandra. Följ figur 2B för att ladda benet i fixturerna.
      1. Ställ in stöd- och lastspannens längder så att de följer förhållandet 3:1⁸ (t.ex. 9 mm stödspann och 3 mm lastspann).
      2. För ett skenben, belasta benets mediala yta mot stödspannet med ett stöd vid tibia/fibula-övergången. Det andra stödet kommer sannolikt att placeras strax efter tibialkammen. Se till att belastningsspannet, centrerat inom stödspannet, sedan innehåller en enhetlig region av benet.
   8. Mät stödspännvidden om du utför trepunktsbockning och både belastnings- och stödspännvidden om du utför 4-punktsbockning och registrera dessa avstånd. Se till att detta värde registreras från mitten av lastpunkterna för både belastnings- och stödspännviddsmätningar.
   9. Lägg tillbaka benet i koksaltlösning eller återfukta med en bolus koksaltlösning.
      OBS: När du väljer punkter för ett belastningsspann rekommenderas att du använder cirkulära spetsar (en radie på 0,75 mm är tillräcklig eftersom den fördelar belastningen samtidigt som den kommer i kontakt med benet vid cirkelns tangent). Även om teorin rekommenderar en knivsegg för att representera en punktbelastning, kommer detta att krossa benet vid appliceringspunkten, vilket leder till överskattningar av töjning och underskattningar av modulen.
   10. Se till att alla delar av fixturen är täta och fria från rörelse.
3. Installation av programvara
   1. Se till att testaren är korrekt ansluten till datorn via modulboxen, laddningscellkanaler och eventuella andra krav enligt systemmanualen.
   2. I programvaran som är associerad med den mekaniska testaren, skapa en böjtestprofil med en ramp som har en förskjutningshastighet som är tillräckligt långsam för att inte inducera viskoelastiska effekter (0,025 mm/s används ofta) för att belasta benet till brott.
   3. En minsta samplingsfrekvens på 25 Hz rekommenderas också när du skapar en testprofil, även om en högre samplingsfrekvens är att föredra.
   4. Skapa en mapp per studiegrupp och spara varje test som en enskild fil i den mappen.
4. Läsa in och testa prover
   1. Välj ett ordentligt tinat ben (se steg 1.2). Mät och registrera dess fulla längd med skjutmått.
   2. Ladda provet på fixturerna som visas i figur 2A om du testar ett lårben i trepunktsböjning och figur 2B om du testar ett skenben i fyrpunktsböjning.
   3. Ändra filnamnet så att det återspeglar exemplet som testas.
   4. Nollställ belastningen (inte deplacementet). Slå på systemets flyttare; Se till att den inte är i belastnings- eller förskjutningskontroll.
   5. Var försiktig, applicera en minimal förspänning på benet för att säkra dess position och hjälpa till att förhindra att benet rullar men se till att det inte äventyrar sample. Sikta på en förspänning på cirka 0,25 N. Se till att önskad benorientering bibehålls innan du fortsätter.
   6. Återfukta provet genom att generöst skölja det med saltlösning.
   7. Börja bockningstestet genom att välja Start eller Kör i programvaran. KRITISK: Titta noga på sample under hela testet och notera tester där några problem uppstod (t.ex. rullning, halka).
      OBS: Dessa problem kan äventyra data och anteckningar om dessa tester kommer att vara till hjälp att konsultera under analysen.
   8. Se till att benet börjar spricka (på dragsidan). De flesta tester fortsätter tills fel uppstår. Vid denna tidpunkt kommer testet att avslutas via dess programmerade gränser. Om fel uppstår men testaren fortsätter att förskjutas, stoppa testet manuellt för att förhindra skador på lastcellen.
   9. När testningen är klar, mät längden från den distala änden till brytpunkten med hjälp av skjutmått och registrera den.
   10. Upprepa steg 5.4.1 – 5.4.9 för varje sample.

Figur 1: Inställning av mekanisk testare. A) Trepunkts- och B-fyrpunktsböjningsprovningar. Lastcellen visas i gult, lastfixturerna visas i blått och stödfixturerna visas i grönt. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Benens orientering mellan fixturerna . A) Lårbenets korrekta orientering i trepunktsböjbelastningsfixturer som visar (uppifrån och ned) vyer från lårbenets mediala, främre och bakre sida när de är korrekt placerade. Lastfixturerna visas i orange och stödfixturerna visas i blått. De nedre spännvidderna bör justeras för att inkludera så mycket av den rakaste delen av diafysen som möjligt, och den övre fixturen bör vara centrerad mellan dessa spännvidder. (B) Korrekt orientering av ett skenben för fyrpunktsböjning som visar (uppifrån och ner) vyer från de främre, laterala och mediala sidorna av skenbenet. Benet ska belastas så att den mediala ytan kommer i kontakt med den nedre fixturen och den laterala ytan kommer i kontakt med den övre fixturen. Skenbenet-vadbensförbindelsen ska placeras strax utanför belastningsspannet. Spännvidderna bör justeras för att på bästa sätt möta ett last-till-stöd-spännviddsförhållande på 1:3. Klicka här för att se en större version av denna figur.

6. Val av avkastning på investeringen

1. När pauslängderna har registrerats laddar du in de roterade bilderna i användarens valda programvara. När de roterade bilderna har laddats, lokalisera och spela in de övre och nedre skivorna av benet.
2. Beräkna skillnaden mellan de övre och nedre sektorerna. Multiplicera detta värde med skanningsvoxelstorleken för att bestämma benets totala längd i mikrometer.
3. För att lokalisera frakturplatsen i CT-skanningen, dividera den registrerade brottlängden (i mikrometer) med voxelstorleken för att få antalet μCT-skivor från den distala änden av skanningen till brytpunkten.
4. Välj en ROI, centrerad på den här platsen. Ställ först in den totala önskade längden på ROI (minst 100 μm). Hitta antalet skivor som denna längd representerar genom att dividera längden i mikrometer med voxelstorleken för att bestämma det totala antalet skivor i ROI.
5. Om du vill få den nedre gränsen för ROI dividerar du det totala antalet ROI-sektorer med 2 och subtraherar detta värde från den tidigare beräknade brytplatsen som hittades i steg 6.4.
6. Lägg till den totala längden på ROI i sektorer till det tidigare beräknade värdet för att få den övre gränsen för ROI.
7. Välj lämplig ROI, baserat på beräknade gränser, och spara den.

7. Normalisering av kraft- och förskjutningsdata

OBS: Den mekaniska testaren kommer endast att generera punkter med x- och y-koordinater (förskjutning, kraft). Dessa punkter kan omvandlas till spänning och töjning med hjälp av Euler-Bernoullis böjspännings- och töjningsekvationer, men dessa kräver geometriska egenskaper som erhålls från μCT-skanningar. Kvantifieringen av dessa egenskaper kan utföras med användarens föredragna programvara. Vi föredrar en anpassad kod som ger fullständig kontroll över alla indata, beräkningar och utgångar. Som tidigare nämnts, för att få tillgång till koden, kontakta corresponding author direkt eller besök labbets webbplats på https://bbml.et.iupui.edu/ för mer information. Spännings- och töjningsekvationerna, liksom de nödvändiga geometriska egenskaperna som måste erhållas från μCT-skanningar, för att beräkna dessa diskuteras nedan.

1. Normaliseringsekvationer för trepunktsböjning
   1. Ekvationen som används för att beräkna spänningen vid trepunktsböjning visas nedan i ekvation 1. I denna ekvation representerar "F" kraften och "L" representerar längden på stödspannet. Kraftvärden registreras av den mekaniska testaren under provningen. Se till att längden på stödspannet registreras före testning. "c" och "I" är geometriska egenskaper som beräknas med hjälp av μCT-skanning (avsnitt 7.3).
      Nej (1)
   2. Ekvationen för att beräkna töjning visas nedan i ekvation 2; "c" och "L" representerar samma egenskaper för både spännings- och töjningsberäkningar. "d" betecknar förskjutningsvärden som registrerats av den mekaniska provaren under provningar.
      Nej (2)
2. Normaliseringsekvationer för fyrpunktsböjning
   1. Ekvationen för spänning vid fyrpunktsböjning visas nedan i ekvation 3. "F" och "I" förblir samma variabler som diskuterades i steg 7.1.1. Beräkna "a" från mätningarna av stödet och belastningsspannet före provning. Om du följer det rekommenderade förhållandet på 3:1 för stöd till belastningsspann för fyrpunktsböjning, kommer "a" att vara en tredjedel av stödspännviddens längd.
      Nej (3)
   2. Ekvationen för töjning vid fyrpunktsböjning visas nedan i ekvation 4. "C" och "A" betecknar samma egenskaper för både spännings- och töjningsberäkningar. "d" betecknar de förskjutningsvärden som registrerats av den mekaniska provaren under provningar.
      Nej (4)
3. Beräkna geometriska egenskaper från μCT-skanningar
   1. Variabeln "c" representerar avståndet från den neutrala axeln till ytan av benet som belastades i spänning. Bestäm följaktligen centroiden för varje tvärsnitt i μCT-skanningarna eftersom den neutrala axeln passerar genom centroiden.
      1. Om du följer provningsriktningen för ett lårben i trepunktsböjning som beskrivs i steg 5.2.6, mät "c" med avseende på den främre ytan.
      2. Om du följer testorienteringen av ett skenben som beskrivs i steg 5.2.7, mät "c" med avseende på benets mediala yta.
   2. Variabeln "I" representerar yttröghetsmomentet runt böjningsaxeln (den mediala-laterala axeln för ett lårben; den främre-bakre axeln för ett skenben). Beräkna detta värde med hjälp av ekvation 5. I denna ekvation är "dA" arean av varje pixel som fångats i μCT-skanningen medan y är det beräknade avståndet för varje pixel från den neutrala axeln.
      Nej (5)

8. Mekaniska provningsegenskaper av intresse

1. Innan du beräknar några mekaniska egenskaper, generera en kraft-förskjutningskurva och spännings-töjningskurva (idealkurvor visas nedan i figur 3, tillsammans med signifikanta egenskaper).
   OBS: Testning av biologiska prover genererar inte alltid kurvor som ser ut som dessa idealiserade exempel, men de är fortfarande en användbar vägledning.
2. Undersök dessa kurvor före analys för att upptäcka fel i testningen, t.ex. ett ben som rullar eller halkar. Dessa fel orsakar vanligtvis ojämnheter eller platta områden i den initiala linjära delen av kurvan. Ta bort överflödiga data, inklusive alla data som kan ha samlats in innan testaren kontaktade benet eller data efter fel, vid denna tidpunkt.
3. När du har försäkrat dig om ett kvalitetstest av de plottade kurvorna, börja analysera signifikanta egenskaper.
   1. Styvhet och elasticitetsmodul
      1. Beräkna styvheten med hjälp av endast det elastiska området på kraftförskjutningskurvan. Kurvans lutning i detta område är styvhet.
      2. Beräkna elasticitetsmodulen genom att använda lutningen för endast den elastiska delen av spännings-töjningskurvan.
   2. Sträckgräns
      OBS: Det finns två sträckgränser, en på kraft-förskjutningskurvan och en på spännings-töjningskurvan. Värdena (x,y) för denna punkt från kraft-förskjutningskurvan är kända som förskjutning till utbyte och sträckkraft, medan de från spännings-töjningskurvan är kända som töjning till avkastning och sträckgräns. Dessa punkter representerar slutet av det elastiska området i kurvan och kan hittas på de sätt som anges nedan.
      1. Spännings-töjningskurvmetod: Beräkna en linjeförskjutning från (0,0) med 0,2 % töjning (2 000 mikrotöjning) men med samma lutning som elasticitetsmodulen. Rita denna linje på spännings-töjningsgrafen; Den position där denna linje skär spännings-töjningskurvan definieras som sträckgränsen. Använd denna sträckspännings- och töjningskoordinat för att hitta de analoga kraft- och förskjutningsvärdena; Dessa värden kommer att representera sträckkraft och förskjutning till avkastningsvärden.
      2. Sekantmetoden: Beräkna styvheten från kraft-förskjutningskurvan och minska styvheten med en vald procentsats (5-10%). Rita en linje som börjar vid (0,0) med lutningen på denna reducerade styvhet och låt den skära kraftförskjutningskurvan. Skärningspunkten kommer att ha koordinaterna (förskjutning för att ge efter, ge kraft).
         OBS: Sekantmetoden kan användas för att hitta sträckgränsen utan spännings-töjningsdata.
   3. Ultimat kraft och ultimat stress
      1. Beräkna slutkraft och slutspänning genom att hitta maxvärdet i respektive datamängd.
   4. Förskjutnings- och töjningsegenskaper
      1. Förskjutning till eftergift och töjning till sträckgräns värden som representerar förskjutningen eller töjningen till sträckgränsen. För att hitta dem, leta reda på avkastningen enligt beskrivningen i steg 8.3.2.
      2. Värdena för total förskjutning och total töjning representerar den totala förskjutningen eller den totala töjningen som ett prov upplevde under hela testet och motsvarar felpunkten.
      3. Förskjutning efter avkastning och töjning efter avkastning: Förskjutning efter avkastning rapporteras ofta och kan beräknas genom att subtrahera förskjutning till avkastning från total förskjutning. Beräkna töjning efter töjning genom att subtrahera töjning till utbyte från total töjning, men rapportera detta med försiktighet, eftersom töjning först härleds under antagandet att materialet är linjärt elastiskt (preyield). Detta gör att ett efteravkastningsmått kan bli ogiltigt.
   5. Energins egenskaper
      1. Beräkna energi som arean under kraftförskjutningen eller spännings-töjningskurvan.
      2. Arean under kraftförskjutningskurvan kallas arbete. Arean som beräknas under den del av kurvan som föregår avkastning, eller den elastiska regionen, kallas elastiskt arbete eller energi. Arean som beräknas under kurvan förbi sträckgränsen, eller plastregionen, kallas efteravkastning eller plastiskt arbete, eller förlorad energi.
      3. Den beräknade totala arean under spännings-töjningskurvan är känd som seghet eller seghetsmodul medan arean som beräknas under spännings-töjningskurvan fram till sträckgränsen är känd som motståndskraft. Seghet efter avkastning, liksom töjning efter avkastning, rapporteras ofta inte på grund av antagandena i töjningsekvationerna som denna egenskap inte faller under.

Figur 3: Kraft-förskjutning och spännings-töjningskurvor . (A) Idealisk kraft-förskjutningskurva. (B) Idealisk spännings-töjningskurva med linjen härledd från 0,2 % offset-metoden som används för att beräkna sträckgränsen som visas i rött (observera att denna linje har samma lutning som den för det elastiska området av kurvan). Viktiga egenskaper som kan erhållas från kraft-förskjutningskurvan inkluderar sträckkraft, slutkraft, förskjutning till avkastning, total förskjutning och arbete. Egenskaper på vävnadsnivå som kan erhållas från spännings-töjningskurvan inkluderar sträckgräns, slutspänning, töjning till avkastning, total töjning, motståndskraft och seghet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Representative Results

Efter avslutad datortomografi kan de flesta otillräckliga skanningar fångas upp i rekonstruktionen. Ofta har dåliga skanningar en hög feljusteringskompensation som är en tydlig indikator på ett fel under skanningen. Fel kan dock uppstå i andra steg och kan också leda till felaktiga uppgifter. Dessa fel kan ofta upptäckas när de enskilda beräknade arkitektoniska egenskaperna undersöks. Om värdena ligger långt utanför intervallet för andra i en grupp bör genomsökningen, ROI och metoden för att beräkna egenskaperna undersökas på nytt.

När böjningstesterna är klara bör kraftförskjutningsdiagrammen från varje test undersökas för att identifiera dåliga tester som kan behöva tas bort från datauppsättningen. Ett exempel på ett problematiskt test visas i figur 4. Diagrammet i figur 4A visar resultatet av ett korrekt utfört böjtest. Det finns ett tydligt linjärt område som saknar en tå med låg lutning, en sträckgräns, en slutpunkt (maximal kraft), en minskning av kraften när förskjutningen sträcker sig förbi den maximala kraften och en brottpunkt. Kurvan är jämn utan plötsliga förändringar i belastningen förrän efter att den slutliga punkten har nåtts. Följaktligen kan egenskaper från detta test lätt identifieras och litas på. Diagrammet som visas i figur 4B visar resultatet av ett böjningstest med flera oroande egenskaper. De plötsliga förändringarna i belastningen och uppkomsten av flera toppar i diagrammet är viktiga indikatorer på problem med detta test. Även om mindre toppar kan inträffa i ett korrekt test nära den ultimata kraften, tyder storleken och antalet toppar i detta diagram på att benet kan ha rullat under testet. Oavsett om provdata observeras och noteras under testet eller när testerna undersöks före analysen, bör de undersökas under analysen efter testet. Om uppgifterna verkligen är felaktiga eller ligger långt utanför intervallet för andra urval i gruppen skulle det vara idealiskt att inte inkludera detta test i den slutliga datauppsättningen. Detta är en anledning till att experimentet ska kunna drivas på rätt sätt med föreffektberäkningar . Det kan vara möjligt att endast rapportera vissa egenskaper från ett prov (i det här fallet kan föravkastningsegenskaper vara acceptabla), men detta är inte idealiskt och bör tydligt förklaras när det rapporteras.

Figur 4: Diagram över kraftförskjutning. (A) Idealisk kraftförskjutningsplott. B) Kraftförskjutningskurva till följd av ett dåligt böjningsprov. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Med alla kraftförskjutningsdiagram undersökta och värden normaliserade till spänningsbelastning, kan de intressanta egenskaperna identifieras och visas upp på flera sätt. I figur 5 visas resulterande kraftförskjutnings- och spänningstöjningsdiagram för en hel studie. Dessa är schematiska representationer där kraften och förskjutningen vid startpunkten (0,0), utbyte, slutpunkt och misslyckande för varje ben bestäms och sedan medelvärdet av kraften/spänningen och förskjutningen/töjningen för att ge ett medelvärde för varje grupp. Diagrammen används inte för statistisk analys, men de kan användas för att visa hur det övergripande beteendet varierar på grund av faktorer som behandling eller sjukdomstillstånd. Diagrammen som visas i figur 5 är från en studie som jämför kontrollmöss med de som inducerats med typ 2-diabetes och kronisk njursjukdom (T2D-CKD). De högra skenbenen hos dessa djur testades till failure med hjälp av fyrpunktsböjning och analyserades för att erhålla de egenskaper som diskuteras i protokollavsnitt 8. Från figur 5 är det tydligt att T2D-CKD-gruppen hade reducerade mekaniska egenskaper, inklusive styrka och styvhet, på både struktur- och vävnadsnivå. Dessa möss verkar också ha minskade efteravkastningsegenskaper, en indikator på sprödhet. Dessa diagram bör inte användas för att dra definitiva slutsatser av en studie. Snarare fungerar de som en visuell representation och bör verifieras genom att utföra en statistisk analys av alla egenskaper av intresse.

Figur 5: Kraftförskjutnings- och spänningstöjningsdiagram för en hel studie. A) Kraftförskjutningsdiagram för kontrolldjur och djur som orsakas av typ 2-diabetes och kronisk njursjukdom. Detta diagram resulterade genom att medelvärdet av sträckkraften, förskjutning till avkastning, slutkraft, slutlig förskjutning, brottkraft och total förskjutning för varje grupp och plotta dessa medel tillsammans med standardavvikelsen. B) Stressbelastning för kontrolldjur och djur med typ 2-kronisk njursjukdom. Detta diagram var resultatet av medelvärdesbildning av sträckspänning, töjning till avkastning, slutspänning, slutlig töjning, brottspänning och total töjning och plottning av de resulterande medelvärdena tillsammans med standardavvikelsen. Förkortning: T2D-CKD = typ 2-diabetes- och kronisk njursjukdom inducerade djur. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Mekaniska data och resultat från ett tvåsidigt t-test visas i tabell I. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. En allmän undersökning tyder på data inom lämpliga intervall och med förväntade nivåer av variabilitet. Observera att postyield-egenskaper tenderar att ha den största variationen och därför ofta kräver de största provstorlekarna för att upptäcka meningsfulla skillnader. Som de schematiska kurvorna i figur 5 antydde finns det signifikanta minskningar i nästan alla mekaniska egenskaper på struktur- och vävnadsnivå. Från dessa data kan man dra slutsatsen att det inducerade sjukdomstillståndet ledde till ben som är svagare, mindre stela och mer mottagliga för frakturer på grund av förlust av deformerbarhet och minskad seghet. Studier med mer nyanserade jämförelser är kanske inte lika enkla att tolka. Ett exempel på detta kan vara om signifikanta förbättringar observeras för mekaniska egenskaper på strukturell nivå men inte mekaniska egenskaper på vävnadsnivå. I detta fall drivs de observerade effekterna sannolikt av förändringar i benets arkitektur (t.ex. ökad yta, ökad kortikal tjocklek) snarare än förbättringar av benkvaliteten på vävnadsnivå. Till exempel ökade benarean på grund av ökningen av vävt ben, men vävnadskvaliteten har minskat eftersom ett oorganiserat vävt ben nu finns snarare än ett organiserat lamellben. Detta skulle kunna stödjas av μCT-analys där statistiskt signifikanta förbättringar av arkitekturen kan observeras. Däremot kan det finnas betydande förbättringar av mekaniska egenskaper på vävnadsnivå med minimala/inga förbättringar av mekaniska egenskaper på strukturell nivå. Denna höga vävnadskvalitet kan maskera fallgroparna med mindre ben. Datatolkningen kan bli ytterligare invecklad om förändringar observeras i preyield-egenskaper men inte i postyield-egenskaper eller vice versa. I det förstnämnda fallet kan en förändring i benets förmåga att motstå deformation förbättras medan dess förmåga att tolerera skador inte förbättras. I vart och ett av dessa fall är möjligheten att referera till arkitektoniska egenskaper från μCT-analys mycket fördelaktig och bör användas (även om beskrivningen av den metoden ligger utanför ramen för denna artikel). På grund av komplexiteten i tolkningen av dessa egenskaper kan man presentera alla egenskaper i tabell- eller figurform (inte bara de egenskaper som tenderar att vara lättast att tolka, t.ex. ultimat kraft, eller som berättar den historia man vill berätta) för att möjliggöra en mer fullständig representation av de mekaniska effekterna.

			Kontroll	T2D-CKD	P-värde
Sträckgräns (N)			19,7 ± 2,9	15,2 ± 2,6	0.0032**
Ultimat kraft (N)			22,8 ± 3	17,6 ± 3,4	0.0031**
Förskjutning till utbyte (μm)			205 ± 17	190 ± 21	0.1039
Förskjutning efter avkastning (μm)			246 ± 235	60 ± 51	0.0435*
Total förskjutning (μm)			451 ± 230	249 ± 53	0.0278*
Styvhet (N/mm)			110 ± 10	91 ± 13	0.0037**
Arbete för att ge avkastning (mJ)			2,16 ± 0,45	1,54 ± 0,36	0.0055**
Efterarbete (mJ)			4.24 ± 3.01	1,04 ± 0,9	0.0109*
Totalt arbete (mJ)			6,4 ± 2,88	2,58 ± 0,97	0.0025**
Sträckgräns (MPa)			180 ± 20	157 ± 25	0.0504
Ultimat stress (MPa)			209 ± 26	181 ± 27	0.0434*
Stam för att ge avkastning (mɛ)			16,8 ± 2	16,4 ± 1,5	0.5771
Total töjning (mɛ)			36,6 ± 17,2	21,5 ± 4,3	0.0277*
Modul (GPa)			12.2 ± 1.1	10,9 ± 1,1	0.0171*
Motståndskraft (MPa)			1,62 ± 0,33	1,38 ± 0,33	0.1377
Seghet (MPa)			4,85 ± 2,29	2,26 ± 0,73	0.0076**

Tabell 1: Resultat av mekanisk provning och statistisk analys. Värden visas som medelvärde ± standardavvikelse. P-värden är resultatet av ett tvåsidigt oparat t-test. * P < 0,05 och ** P < 0,01. Förkortning: T2D-CKD = typ 2-diabetes- och kronisk njursjukdom inducerade djur.

Discussion

Under hela skannings- och testprocessen finns det tillfällen då felsökning och optimering är lämpliga. Den första av dessa inträffar vid skanning av ben med hjälp av μCT. Medan många system kommer med en hållare där ett föremål kan hållas och skannas, kan anpassade hållare tillverkas för att skanna flera ben samtidigt. Genomsökning av flera ben kan vara en utmärkt punkt för optimering, men försiktighet bör iakttas under hela skannings- och analysprocessen för att säkerställa att artefakter inte induceras. Eftersom röntgenstrålar passerar genom (och dämpas av) olika mängder benvävnad vid varje vinkelsteg, kan detta leda till felaktigheter i de resulterande data.

En andra punkt för felsökning sker i rekonstruktionen av skanningar. Beroende på vilket program som används kan användaren definiera densitetsfönstret för rekonstruktion, beräknat utifrån dämpningskoefficientvärdena för skanningen. Detta är en linjär koefficient som används för att representera hur mycket röntgenstrålen dämpas av ett objekt⁵. Vissa program hämtar dessa densiteter och konverterar dem till gråskalevärden från 0 till 255 i ett histogram. Två värden kommer att visas i ett histogram och kallas kontrastgränser¹⁰, som måste ställas in på lämpligt sätt för att möjliggöra igenkänning av benvoxlar kontra icke-benvoxlar. Det lägre värdet kommer normalt att ställas in på ett gråskalevärde på noll medan det högre kontrastvärdet rekommenderas att ställas in på 10-20 % av den maximala dämpningen av materialet av intresse (ben)¹⁰. Fel kan uppstå i analysen om det här värdet inte anges på rätt sätt eftersom delar av data kan skäras av. Följaktligen måste detta värde justeras beroende på vilket prov som skannades. Det bästa sättet är att visa histogrammet på en logaritmisk skala och välja den övre gränsen som ett tal som är något större än slutet av den logaritmiska svansen för att säkerställa att alla bendata ingår¹⁰.

Ytterligare punkter för felsökning sker under mekanisk testning och analys. Under testning och visning av kraftförskjutningskurvor efter testet kan prover som rullade upptäckas och bör tas bort från datauppsättningen enligt beskrivningen i de representativa resultaten. Dessutom bör försiktighet iakttas när det gäller benets orientering eftersom det finns antaganden som styr formen på det ben som testas. När man använder Euler-Bernoullis böjningsekvationer för att beräkna spänning och töjning, antas det att provet har ett likformigt tvärsnitt längs sin längd³. Med tanke på att de flesta ben inte har ett enhetligt tvärsnitt är det bäst att välja den mest enhetliga regionen av benet som ska testas (över hela stödspannet för trepunktsböjning eller mellan belastningspunkterna för fyrpunktsböjning).

I ett lårben är testning i trepunktsböjning vid mittskaftet att föredra. På grund av benets mjuka krökning bör man testa i krökningsriktningen för att förhindra lokal ytböjning (dvs. testa lårbenet med den främre ytan i spänning). Skenbenet har en mer variabel tvärsnittsform, så det idealiska området att testa börjar precis proximalt till korsningen mellan skenbenet och vadbenet. Om benet placeras med den mediala ytan i spänning är det område av benet som testas platt och har minst variation i radie och tröghetsmoment i böjningsriktningen. Försiktighet bör också iakttas vid tolkning av resultaten av böjtesterna på grund av antagandet att materialet är isotropt, homogent och linjärt elastiskt – vart och ett av dessa antaganden bryts till viss del vid testning av ben³. Bones oförmåga att passa in i dessa antaganden leder till resultat från böjningstester som måste tolkas med försiktighet. De egenskaper som måste tolkas mest noggrant är de som härleds från spännings-töjningskurvan förbi sträckgränsen eftersom godkänd avkastning per definition bryter mot det linjära elastiska antagandet. Även om normalisering av benets form kan göras, rekommenderas det inte att försöka normalisera till djurens kroppsvikt om det inte finns stora skillnader mellan grupperna. I detta fall kan en kovariansanalys utföras för att kompensera för dessa skillnader, men allmän normalisering av kroppsvikten bör undvikas i de flesta fall.

Trots de felsökningsproblem som kan uppstå under denna process ger böjningstester mekaniska egenskaper som kan beskriva ett bens känslighet för frakturer. Dessa tester är också relativt enkla och snabba att utföra. Även om absoluta värden från dessa tester kanske inte alltid är helt giltiga, kan det vara ganska exakt att kunna upptäcka relativa skillnader mellan grupper för prover av olika storlekar och former. De erhållna mekaniska egenskaperna ger funktionell relevans i studier där skillnader i benvävnad kan förväntas. Även om monotona feltester är det vanligaste och mest lättillgängliga mekaniska testet, kan andra metoder, inklusive utmattningslivslängd och brottseghet, avslöja ytterligare mekaniska egenskaper av intresse och kan övervägas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAn	Bruker	NA	CT Scan Analysis Software
DataViewer	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Coding platform used for data analysis
NRecon	Bruker	NA	CT Scan Reconstruction software
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software	Micro Photonics Inc	SKY-016814	Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object