Summary
げっ歯類の骨の機械的試験は、骨の骨折しやすさに関する情報を抽出するための貴重な方法です。適切な実践的理解を欠いていると、結果が過剰に解釈されたり、妥当性に欠けたりする可能性があります。このプロトコルは、機械的試験が正確に実施され、有効で機能的なデータを提供するためのガイドとして機能します。
Abstract
骨折につながる骨格の脆弱性は、毎年150万人の骨折と180億ドルの直接的な医療費をもたらす米国の公衆衛生上の危機です。骨疾患の根底にあるメカニズムと治療への反応を理解する能力は、望まれるだけでなく、重要です。骨の機械的試験は、骨の骨折しやすさを理解し、定量化するための貴重な技術として役立ちます。この方法は簡単に実行できそうに見えますが、ユーザーがガバナンスの仮定と重要な手順を無視すると、不適切で不正確な結論に達する可能性があります。これは、方法の誤用や結果の誤った解釈を伴う研究が発表され続けているため、分野を超えて観察されています。このプロトコルは、サンプルサイズの考慮から組織の採取と保存、データ分析と解釈まで、これらの技術の適用とともに機械的試験に関連する原則の入門書として機能します。これにより、骨の骨折しやすさに関する貴重な情報が得られ、学術研究と臨床ソリューションの両方の理解が深まります。
Introduction
骨の機械的試験は、骨の骨折しやすさに関連する機能情報を抽出するための主要な方法です。前臨床試験では、いくつかの検査方法を使用できますが、最も一般的なのは長骨の曲げです。これらの検査は簡単に実施でき、ヒトからマウスまで、さまざまなサイズの骨に使用できます。マウスは前臨床研究で最も一般的に研究されている動物の1つであるため、このプロトコルはマウスの大腿骨と脛骨で実施される曲げ試験に焦点を当てます。
曲げ試験を行う前に、骨を適切に採取して保管する必要があります。最も一般的な保存方法は、伝統的に、生理食塩水に浸したガーゼで骨を凍結するか、生理食塩水のみで凍結するか、エ タノールで骨を脱水するかでした1。エタノールで保存された骨は、凍結保存されたものと比較して、剛性と弾性率が増加し、変形パラメータが減少することが示されています1。検査前に骨を水分補給しても、これらの特性は正常なレベル 1には回復しません。生理食塩水に浸して保管すると、生理食塩水が膨張すると圧力がかかるため、骨に損傷を与える可能性があります。さらに、マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)スキャンのために骨を取り除くには、溶液の完全な融解が必要になります。その結果、採取したばかりの骨を生理食塩水に浸したガーゼで冷凍することが標準的な保存方法となっており、このプロトコル全体で推奨されています。
骨の大きさと形状は骨のかさ強度に影響を与え、多くの疾患モデルは骨のサイズと形態を大きく変えるため、工学的原理を使用してサイズの影響を正規化し、組織の挙動を推定する特性を生成します2。このアプローチでは、破損箇所の断面形状が必要であり、これは試験前に骨のスキャンを作成するためにμCTを使用して取得されるのが最も一般的です。μCTは、その可用性と高い画像解像度により広く使用されています。さらに、軟部組織の寄与は含まれておらず、スキャンは骨への化学的固定やその他の修正を必要としません3,4。すべての形態のCTでは、X線源が物体に焦点を合わせ、物体の反対側にある検出器が結果として生じるX線エネルギーを測定します。これにより、画像3,5に変換できるサンプルのX線影が生成される。スキャンされる物体を回転させ(またはX線源と検出器を試料の周りを回転させ)、物体5を表す3次元データセットに再構成することができる画像を生成する。
スキャン解像度、つまり 2 つのオブジェクトがどれだけ接近していても個別に解決できるかは、公称ボクセル サイズまたは結果の画像のピクセル サイズを変更することによって制御されます。一般的には、オブジェクトが識別されるためには、1つのボクセルの少なくとも2倍のサイズでなければならないとされていますが3、比率を高くすると精度が向上します。さらに、ボクセルが大きいほど、部分的な体積効果が生じやすくなり、1つのボクセルにさまざまな密度の組織が含まれる場合、単一の組織の比密度ではなく、これらの密度の平均が割り当てられるため、組織面積と鉱物密度が過大または過小評価される可能性があります3。これらの問題は、より小さなボクセル サイズを選択することで軽減できますが、より高い解像度を使用しても、部分的なボリューム効果が排除されるわけではなく、スキャン時間が長くなる可能性があります3。 ex vivoで骨をスキャンする場合、マウスの骨の小柱構造を正確に評価するために、一般的に6〜10μmのボクセルサイズが推奨されます。皮質骨には10〜17μmのより大きなボクセルサイズを使用できますが、最小の妥当なボクセルサイズを使用する必要があります。このプロトコルは10 μmのボクセルサイズを使用しており、これは主要な小柱特性を区別し、長時間のスキャン時間なしで部分的な体積の影響を最小限に抑えるのに十分な大きさです。
骨組織のミネラル密度と厚さが高いと、透過X線エネルギースペクトルが大幅に減衰および変化するため、X線エネルギーとエネルギーフィルターの設定も慎重に選択する必要があります。一般に、放射されたX線スペクトルは物体6から出るスペクトルと同等であるため、骨などの高密度の物体に低エネルギーX線を使用すると、ビーム硬化7として知られるアーチファクトが発生する可能性があります。これらのアーチファクトの発生率を減らすために、骨サンプルをスキャンするときは、50〜70 kVpのより高い電圧が推奨されます5。さらに、アルミニウムまたは銅のエネルギーフィルタを挿入すると、より集中したエネルギービームが作成され、アーチファクトがさらに最小限に抑えられます4,7。このプロトコルでは、0.5mmのアルミニウムフィルターが使用されます。
最後に、スキャン回転ステップおよび回転長(例えば、180°〜360°)が一緒になって、キャプチャされる画像の数を制御し、これが最終スキャン4におけるノイズの量を決定する。各ステップで複数のフレームを平均化すると、ノイズは低減できますが、スキャン時間が長くなる可能性があります4。このプロトコルでは、0.7 度の回転ステップと 2 のフレーム平均を使用します。
スキャンに関する最後の注意点:ハイドロキシアパタイトキャリブレーションファントムは、減衰係数を鉱物密度(g/cm35)に変換できるように、実験骨と同じスキャン設定を使用してスキャンする必要があります。このプロトコルでは、0.25 g/cm 3 および 0.75 g/cm3 のハイドロキシアパタイトのファントムを使用しますが、異なるファントムが利用可能です。一部のスキャンシステムは、毎日のシステムキャリブレーションの一部として内部ファントムを使用することに注意してください。
スキャンが完了すると、角度投影は、通常、メーカーの付属ソフトウェアを使用して、オブジェクトの断面画像に再構築されます。どのシステムを使用する場合でも、骨全体が再建に取り込まれ、骨と非骨の認識を可能にするために閾値が適切に設定されていることを確認することが重要です。再建後、すべてのスキャンを3次元で回転させて、骨の向きが一貫して横軸と適切に揃うようにすることが重要です。
回転後、分析のための関心領域(ROI)は、皮質特性、小柱特性、または機械的正規化のための骨折形状のいずれが望ましいかに基づいて選択され得る。後者の場合、ROIは、骨折部位から骨の一端までの距離を測定し、ボクセルサイズを使用してスキャンファイル内の対応するスライス位置を決定することにより、テスト後に選択する必要があります。選択された領域は、適切な推定を提供するために、ROIのほぼ中心に破砕点がある長さが少なくとも100μmである必要があります4。
ROI が選択されている場合、機械的な正規化 (曲げ応力とひずみを計算するため) には、中立曲げ軸から破損が始まる表面までの最大距離 (試験セットアップによって決定される引張荷重を受ける表面と仮定) と、中立軸周辺の面積慣性モーメント (これも試験セットアップに依存) の 2 つのプロパティが必要です。このプロトコルでは、カスタムコードを使用してこれらの値を決定することを推奨しています。コードへのアクセスについては、対応する作成者に直接お問い合わせいただくか、https://bbml.et.iupui.edu/ のラボのWebサイトにアクセスして詳細を確認してください。
μCTスキャンが完了すると、機械的試験を開始できます。曲げ試験は、4点または3点構成のいずれかで実行できます。4点曲げ試験は、荷重点間の骨のせん断応力を排除し、この領域で純粋な曲げを発生させることができるため、好まれます3。その後、骨は張力によって骨折し、骨の真の曲げ特性をより代表する破損を引き起こします3。ただし、両方の荷重点で同じ荷重がかかるように骨に荷重をかける必要があります(これは、ピボット式ローディングヘッドで容易に行うことができます)。3点曲げ試験では、荷重点と骨が接する部分でせん断応力が大きく変化し、張力3ではなくせん断によってこの時点で骨が折れます。ASTM規格では、曲げ加工を受ける材料の長さと幅の比率を16:1にすることを推奨しており、これは、せん断の影響を最小限に抑えるために、支持スパンの長さを骨の幅の16倍にする必要があることを意味します8,9。これは、小さなげっ歯類の骨を試験する場合、達成できないことが多いため、荷重スパンは、断面形状の変化をできるだけ小さくして、できるだけ大きくします。さらに、4点曲げを行う場合、下部スパンと上部スパンの長さの比率は~3:18である必要があり、これは通常、脛骨で達成できますが、短い大腿骨では困難です。さらに、大腿骨の皮質壁が薄いため、試験中に骨断面の形状が変化するリング型の変形の影響を受けやすくなります(これは、3点曲げと比較して同じ曲げモーメントを誘発するためにより大きな力が必要になるため、4点試験で強調できます)。したがって、マウス大腿骨には 3 点曲げが利用され、このプロトコル全体で脛骨には 4 点曲げが使用されます。
最後に、統計分析のために研究に適切な電力を供給することが重要です。機械的試験の一般的な推奨事項は、一部の機械的特性、特に降伏後のパラメータが非常に変動する可能性があるため、違いを検出できるように、実験グループごとに10〜12個の骨のサンプルサイズを持つことです。場合によっては、これは、研究中に発生する可能性のある減少を考慮して、より大きな動物サンプルサイズから始めることを意味する場合があります。既存のデータを使用したサンプルサイズ分析は、研究を試みる前に完了する必要があります。
多くの制限と仮定がありますが、曲げ試験は、特にグループ間の相対的な差が重要な場合に、非常に正確な結果を提供できます。これらの特性は、小柱構造と皮質形態の分析とともに、病態と治療計画に関するより良い洞察を提供することができます。私たちが管理できる実験の側面(収穫、保管、スキャン、テストなど)に注意を払えば、正確な結果が得られていると確信できます。
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Protocol
このプロトコル全体を通して動物を含むすべての手順は、手順の前にインディアナ大学理学部の施設動物および使用委員会(IACUC)によって承認されています。手順で説明された動物は、安楽死の二次的な手段として、CO2吸入とそれに続く子宮頸部脱臼によって安楽死させられました。
1.骨の収穫、保管、解凍
- 収穫と貯蔵
- マウスの腹側を上にして置きます。メス(またはカミソリの刃やはさみ)を使用して、片側の大腿骨と骨盤のおおよその接合部を切開します。
- 股関節が見つかるまで、背側で最初の切開を続けます。骨盤に付着した小さな白い球体として表示される大腿骨頭を探します。
- 大腿骨頭がソケットから飛び出すまで、メスの端で大腿骨頭の近位端に圧力をかけます。死骸の残りの部分から後肢を解放するために、追加の組織を切除します。
- 後肢を分離した状態で、膝関節の屈曲を誘発して脛骨と大腿骨を分離します。膝の前面でメスを内側から外側方向に動かして、骨の間の靭帯を含む隣接する組織を切断します。
- これで骨が分離しない場合は、膝関節を伸ばして後面にアクセスできるようにします。骨を切ったり、関節軟骨を削ったりしないように注意してください。
- 大腿骨と脛骨が分離したら、関節を曲げ、関節の後面を内側外側の鋸で切る動作を使用して、後足を脛骨から取り外します。必要に応じて、関節を伸ばして前面を露出させます。骨を切らないように注意してください。
- 単離したら、付着したすべての軟部組織の骨をきれいにします。脛骨の4点曲げ試験を行う場合は、腓骨も取り除きます。腓骨は近位端の靭帯で接続されていますが、骨の遠位端近くの脛骨に癒合しています。接続点の近くで鋭利なはさみを使用して、腓骨を分離します。
- 分離して洗浄した骨を生理食塩水に浸したガーゼで別々に包み、-20°Cで保存します。 収穫後すぐにこれを行います。
- 枝肉の反対側について、手順1.1.1から1.1.8を繰り返します。
注:手順1.1.4-1.1.6で骨を分離しようとしたときに抵抗がある場合は、骨を引き離そうとするのではなく、手順を繰り返すのが最善です。無理な動きは、骨の損傷や骨折につながる可能性があります。
- 解凍
注:過度の凍結融解サイクルは骨の機械的特性に悪影響を与える可能性があるため、骨が受ける凍結融解サイクルの数を最小限に抑える必要があります。μCTスキャンの部分融解は、骨を室温で5〜10分間放置することで達成できます。以下に説明するように、曲げ試験を行う場合にのみ、骨を完全に解凍します。- 一晩解凍を推奨
- 骨を-20°Cの保管から冷蔵室または冷蔵庫の1〜4°Cに移します。テストの前に、骨が8〜12時間そこに留まって完全に解凍していることを確認してください。
- クイック解凍
- 浴槽の温度を約37°Cに設定します。 この温度になったら、骨をお風呂に入れます。
- 骨をお風呂に約1時間入れておきます。
- 一晩解凍を推奨
2. μCTスキャン
- 水分補給を維持するために、スキャンする前に骨をパラフィルムで包みます。スキャンを待つ間、他のすべての骨を氷の上に置いてください。
- パラフィルムで包まれたら、骨をホルダーに入れてスキャナーと接続します。スキャンしたすべてのボーンが同じ方向に整列されていることを確認すると、一貫した位置合わせにより、分析の後半での回転が簡素化されます。
- スキャンの用途に合わせてスキャン設定を調整してください。マウスの骨には、次の一般的なスキャン設定が推奨されます:解像度/ボクセルサイズ:10 μm;ピクセルサイズ:ミディアム、2000 x 1048;フィルター:0.5mmアルミニウム;回転ステップ:0.7;フレーム平均化:2。
メモ: これらの設定は、スキャンに使用するシステムによって異なる場合があるため、必要に応じて製造元のマニュアルおよびユーザーマニュアルを参照してください。 - X線源がオンになったら、フラットフィールド補正を実行してアーチファクトを最小限に抑えます。これを行うには、まずチャンバーが空であることを確認し、フラットフィールドをオフにします。
- フィールドの平均強度を測定し、60%に調整します。60%になったら、フラットフィールドを更新してオンに戻します。
- 平均強度が現在(86〜88%)であることを確認します。
メモ: このプロセスは、使用する μCT システムによって異なる場合があります。プロセスを試す前に、ユーザーマニュアルを参照してください。 - フラットフィールド補正が正常に実行されたら、ホルダーをチャンバーに置きます。ペデスタルをチャンバーに入れる前に、サンプルが中央に並んで水平であることを確認してください。
- 台座が固定されたら、チャンバーを閉じ、骨全体がスキャンでキャプチャされることを確認し(スカウトビューが必要な場合があります)、スキャンを開始します。
- スキャン後、-20°Cの生理食塩水に浸したガーゼで骨を再保存します。
3. μCT再構成
- 再建で骨全体をキャプチャするROIを選択します。これを行うには、骨の最大断面を表示し、この断面に基づいてROIのサイズを設定します。
- ソフトウェアの閾値を設定して、骨以外の骨と比較して骨を適切に認識できるようにします。これを行うには、下限制約を 0 に設定し、上限制約をピーク ヒストグラム データの末尾に設定したヒストグラムを使用します。
- リングアーチファクトの低減やビーム硬化などの追加設定をそれぞれ5%と20%に調整します。ミスアライメント補正が-7〜7の範囲にあることを確認してください。これらの値は、ソフトウェアによって異なる場合があります。再構築を開始する前に、ユーザーマニュアルおよびメーカーベースの指示で確認されていることを確認してください。
注: アーチファクトは、ビーム硬化、リングアーチファクト、およびミスアライメント補正の補正を使用して、再構成中に最小限に抑えることができます。ミスアライメント補正は、スキャンの品質の指標として機能する場合があり、メーカーが指定した範囲外の場合は、スキャンを繰り返す必要があります。ただし、再構築の設定はソフトウェアに依存するため、ユーザーズマニュアルを参照してください。
4. μCT回転
注:再構築したら、スキャンを回転させて、すべての骨で一貫した方向を確立し、結果の骨の横断面が、できるだけ少ないオフセット角度で縦軸に垂直になるようにする必要があります。これは、ユーザーが選択したソフトウェアを使用して行う必要があります。
- 大腿骨の回転
- 大腿骨を回転させて、すべての骨が同じ縦方向になるようにします。たとえば、すべてのボーンの向きを、スキャンの上部にあるボーンの近位端に向けます。
- すべてのボーンの断面の向きが同じになるようにボーンを回転させます。たとえば、前側が常にスキャンの右側になるようにボーンを回転させます。
- これらの調整が完了したら、スキャンをまっすぐにして、中心軸を中心に対称性が維持されるようにします。
- ローテーションしたデータセットを保存します。
- 脛骨の回転
- 脛骨に対して手順4.1.1-4.1.4を繰り返します。
5.機械的試験手順
- 準備
- 機械的試験の前に、6〜10μmの分解能のμCTスキャンが取得され、再構成され、各サンプルの品質スキャンが取得されたことを確認して、破砕部位の断面形状を計算します(セクション2〜3)。
- スキャンを取得して検証したら、テストの前にすべての骨を融解します(セクション1)。同じ日に 1 つの実験からすべての骨を検査し、検査の順序をランダム化して、サンプルや実験グループ間でのユーザーの偏りとシステムのばらつきを最小限に抑えます。試験プロセス全体を通して骨が水分補給されたままであることを確認してください。
- 装置のセットアップ
- 試験片に適した感度と容量のロードセルを見つけます。試験片の予想される故障範囲を考慮し、感度を最大化しながら容量が約50%多いロードセルを選択します(たとえば、0〜25 Nの破損範囲のマウスの骨には、容量45 Nの10 lbfのロードセル)。
- 荷重と支持スパンの固定具を配置します。
- 図1に示すように、ロードセルをテスターの上部または下部のサポートにねじ込み、上部のローディングフィクスチャをロードセルに、下部の固定具をテスターの下部サポートにねじ込み、ロードセルと固定具を取り付けます。しっかりとフィットするようにします。
注:ロードセルと流体の接触を避けるために曲げ試験を行う場合は、ロードセルを上部固定具に取り付けることが一般的に推奨されますが、必要に応じて下部を使用できます。 - ロードセルと治具を取り付けたら、サポートスパンの長さを選択し、テストするすべてのサンプルで一定に保たれるようにします。サポートスパンの距離を選択するには、まず、サンプルセット内の最短のボーンを見つけます。
- 図 2 に示すように、フィクスチャ間のボーンの向きを合わせます。
- 大腿骨の3点曲げについては、 図2Aに従います。骨の前面が支持スパンに対してあり、スパン領域がサンプルの骨幹内にあることを確認します。近位端に第3転子を含め、遠位端に骨が骨端と顆に広がる移行点を含めることは避けてください。
- 4点曲げの場合、支持スパンと荷重スパンが互いに位置合わせされ、中央に配置されていることを確認します。 図2B に従って、固定具にボーンをロードします。
- サポートスパンとローディングスパンの長さを3:1の比率8(例えば、サポートスパン9mm、ローディングスパン3mm)になるように設定します。
- 脛骨の場合、脛骨/腓骨接合部に1つのサポートがあるサポートスパンに対して骨の内側表面に負荷をかけます。もう一方の支持体は、脛骨稜の直後に配置される可能性があります。支持スパンの中央に荷重スパンがあり、骨の均一な領域が含まれていることを確認します。
- 3点曲げを行う場合は支持スパン距離を測定し、4点曲げを実行する場合は荷重スパン距離と支持スパン距離の両方を測定し、これらの距離を記録します。この値が、荷重スパンとサポートスパンの両方の測定値について、荷重点の中心から記録されていることを確認します。
- 骨を生理食塩水に戻すか、生理食塩水ボーラスで水分補給します。
注: 荷重スパンのポイントを選択する場合は、円形のポイントを使用することをお勧めします(半径 0.75 mm は、円の接線でボーンに接触しながら荷重を分散するため、十分です)。理論的には、点荷重を表すためにナイフエッジが推奨されていますが、これは荷重適用点で骨を押しつぶし、ひずみの過大評価と弾性率の過小評価につながります。 - 固定具のすべての部品がしっかりと締まっていて、動きがないことを確認してください。
- ソフトウェアのセットアップ
- テスターがモジュールボックス、ロードセルチャネル、およびシステムマニュアルによるその他の要件を介してコンピューターに正しく接続されていることを確認します。
- 機械式試験機に関連するソフトウェアで、骨に破損するまで荷重をかけない粘弾性効果(0.025 mm/sがよく使用されます)を引き起こさないほど遅い変位率を持つランプを使用して、曲げ試験プロファイルを作成します。
- テストプロファイルを作成するときは、25 Hzの最小サンプル周波数も推奨されますが、より高いサンプリングレートが推奨されます。
- 研究グループごとに1つのフォルダを作成し、そのフォルダ内に各テストを個別のファイルとして保存します。
- サンプルのロードとテスト
- 適切にフリーズしたボーンを選択します(手順1.2を参照)。ノギスで全長を測定して記録します。
- 3点曲げで大腿骨をテストする場合は図2A、4点曲げで脛骨をテストする場合は図2Bに示すように、サンプルを治具にロードします。
- テストするサンプルを反映するようにファイル名を変更します。
- 荷重をゼロにします(変位ではありません)。システムのムーバーをオンにします。荷重または変位制御されていないことを確認してください。
- 注意して、骨に最小限の予荷重をかけ、その位置を固定し、骨が転がるのを防ぎますが、サンプルを損なわないようにします。約0.25Nの予圧を目安にしてください。先に進む前に、目的のボーンの向きが維持されていることを確認してください。
- サンプルに生理食塩水をたっぷりと浴びせて水和させます。
- ソフトウェアで[ 開始 ]または [実行 ]を選択して、曲げ試験を開始します。重大:テスト全体を通してサンプルを注意深く観察し、問題が発生したテスト(転がり、滑りなど)をメモします。
注: これらの問題はデータを危険にさらす可能性があり、これらのテストに関するメモは、分析中に参照するのに役立ちます。 - 骨が骨折し始めるのに注意してください(引張側)。ほとんどのテストは、障害が発生するまで続行されます。この時点で、テストはプログラムされた制限値で終了します。故障が発生してもテスターが変位し続ける場合は、ロードセルの損傷を防ぐために手動でテストを停止してください。
- テストが完了したら、ノギスを使用して遠位端からブレークポイントまでの長さを測定し、記録します。
- サンプルごとに手順5.4.1〜5.4.9を繰り返します。
図1:メカニカルテスターのセットアップ。 (A)3点曲げ試験、(B)4点曲げ試験。ロードセルは黄色、荷重固定具は青、支持固定具は緑色で示されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:固定具間の骨の向き 。 (A)大腿骨の内側、前側、後側から(上から下へ)ビューを示す3点曲げ荷重治具における大腿骨の適切な向き。荷重固定具はオレンジ色で表示され、支持具は青色で示されます。下部スパンは、骨幹の最もまっすぐな部分をできるだけ多く含むように調整する必要があり、上部の固定具はそれらのスパンの中央に配置する必要があります。(B)脛骨の前側、側方、内側からの(上から下への)ビューを示す4点曲げのための脛骨の適切な向き。内側の表面が下部の固定具に接触し、側面が上部の固定具に接触するように骨に負荷をかける必要があります。脛骨と腓骨の接合部は、荷重スパンのすぐ外側に配置する必要があります。スパンは、荷重と支持のスパン比が1:3になるように調整する必要があります。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
6. ROIの選択
- ブレークの長さを記録した状態で、回転した画像をユーザーが選択したソフトウェアにロードします。回転した画像が読み込まれたら、ボーンの上部と下部のスライスを見つけて記録します。
- 上のスライスと下のスライスの差を計算します。この値にスキャン ボクセル サイズを掛けて、骨の全体の長さをマイクロメートル単位で決定します。
- CTスキャンで破砕位置を特定するには、記録された破断長(マイクロメートル単位)をボクセルサイズで割って、スキャンの遠位端から破断点までのμCTスライスの数を取得します。
- この位置を中心とする ROI を選択します。まず、ROIの所望の全長(少なくとも100μm)を設定する。マイクロメートル単位の長さをボクセル サイズで割って、この長さが表すスライスの数を求め、ROI 内のスライスの総数を求めます。
- ROI の下限を求めるには、ROI スライスの総数を 2 で割り、手順 6.4 で計算したブレーク位置からこの値を減算します。
- スライス単位の ROI の全長を以前に計算した値に加算して、ROI の上限を求めます。
- 計算された範囲に基づいて適切な ROI を選択し、保存します。
7. 力と変位データの正規化
注:メカニカルテスターは、x座標とy座標(変位、力)を持つポイントのみを生成します。これらの点は、オイラー・ベルヌーイ曲げ応力およびひずみ方程式を使用して応力とひずみに変換できますが、これらにはμCTスキャンから得られる幾何学的特性が必要です。これらの特性の定量化は、ユーザーの好みのソフトウェアで実行できます。私たちは、すべての入力、計算、および出力を完全に制御できるカスタムコードを好みます。前述したように、コードにアクセスするには、対応する作成者に直接問い合わせるか、https://bbml.et.iupui.edu/ のラボのWebサイトにアクセスして詳細を確認してください。応力とひずみの方程式、およびこれらを計算するためにμCTスキャンから取得する必要がある必要な幾何学的特性については、以下で説明します。
- 3 点曲げ正規化方程式
- 3点曲げの応力の計算に使用される式は、以下の 式1に示されています。この式において、「F」は力を表し、「L」は支持スパンの長さを表す。力の値は、試験中に機械試験機によって記録されます。テストの前に、サポートスパンの長さが記録されていることを確認してください。「c」と「I」は、μCTスキャンを使用して計算される幾何学的特性です(セクション7.3)。
(1) - ひずみを計算する式は、以下の 式2に示されています。「c」と「L」は、応力とひずみの両方の計算で同じプロパティを表します。「D」は、試験中に機械試験機によって記録された変位値を示します。
(2)
- 3点曲げの応力の計算に使用される式は、以下の 式1に示されています。この式において、「F」は力を表し、「L」は支持スパンの長さを表す。力の値は、試験中に機械試験機によって記録されます。テストの前に、サポートスパンの長さが記録されていることを確認してください。「c」と「I」は、μCTスキャンを使用して計算される幾何学的特性です(セクション7.3)。
- 4 点曲げ正規化方程式
- 4点曲げにおける応力の式は、以下の 式3に示されています。「F」と「I」は、手順7.1.1で説明したのと同じ変数のままです。試験前に、支持と荷重スパンの測定値から「a」を計算します。4点曲げの荷重スパンに対するサポートの推奨比率3:1に従う場合、「a」はサポートスパンの長さの3分の1になります。
(3) - 4点曲げにおけるひずみの式は、以下の 式4に示されています。「c」と「a」は、応力計算とひずみ計算の両方で同じプロパティを示します。「D」は、試験中に機械試験機によって記録された変位値を示します。
(4)
- 4点曲げにおける応力の式は、以下の 式3に示されています。「F」と「I」は、手順7.1.1で説明したのと同じ変数のままです。試験前に、支持と荷重スパンの測定値から「a」を計算します。4点曲げの荷重スパンに対するサポートの推奨比率3:1に従う場合、「a」はサポートスパンの長さの3分の1になります。
- μCTスキャンからの幾何学的特性の計算
- 変数「c」は、中立軸から張力がかかったボーンの表面までの距離を表します。したがって、中立軸が重心を通過するため、μCTスキャンの各断面の重心を決定します。
- ステップ5.2.6で説明した3点曲げにおける大腿骨の試験方向に従う場合は、前面に対して「c」を測定します。
- ステップ5.2.7で説明した脛骨のテスト方向に従う場合は、骨の内側表面に対して「c」を測定します。
- 変数「I」は、曲げ軸(大腿骨の場合は内側-外側軸、脛骨の場合は前後軸)の周りの面積慣性モーメントを表します。この値は 、式 5 を使用して計算します。この式において、「dA」はμCTスキャンで捕捉された各画素の面積であり、yは中立軸から計算された各画素の距離である。
(5)
- 変数「c」は、中立軸から張力がかかったボーンの表面までの距離を表します。したがって、中立軸が重心を通過するため、μCTスキャンの各断面の重心を決定します。
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)8. 関心のある機械的試験特性
- 機械的特性を計算する前に、力-変位曲線と応力-ひずみ曲線( 図 3 に示す理想的な曲線と重要な特性)を生成します。
注:生物学的サンプルの試験では、これらの理想的な例のように見える曲線が常に生成されるとは限りませんが、有用なガイドであることに変わりはありません。 - 分析前にこれらの曲線を調べて、骨の転がりや滑りなどのテストのエラーを特定します。これらのエラーは、通常、カーブの最初の線形部分にバンプまたは平坦な領域を引き起こします。この時点で、テスターが骨に接触する前に収集された可能性のあるデータや、故障後のデータなど、余分なデータを削除します。
- プロットされた曲線によって品質テストが保証されたら、重要な特性の分析を開始します。
- 剛性と弾性率
- 力-変位曲線の弾性領域のみを使用して剛性を計算します。この領域のカーブの傾きは剛性です。
- 応力-ひずみ曲線の弾性部分のみの傾きを使用して弾性率を計算します。
- 降伏点
注: 降伏点は 2 つあり、1 つは力-変位曲線上、もう 1 つは応力-ひずみ曲線上にあります。力-変位曲線のこの点の(x,y)値は、変位降伏および降伏力と呼ばれ、応力-ひずみ曲線の値は、ひずみ降伏および降伏応力と呼ばれます。これらの点は、曲線の弾性領域の終点を表し、以下に示す方法で見つけることができます。- 応力-ひずみ曲線法: (0,0)から 0.2% ひずみ(2,000 マイクロひずみ)だけ線分オフセットを計算しますが、弾性率と同じ傾きで計算します。この線を応力-ひずみグラフにプロットします。この線が応力-ひずみ曲線を切る位置は、降伏点として定義されます。この降伏応力とひずみの座標を使用して、類似する力と変位の値を見つけます。これらの値は、降伏力と変位を表し、降伏値になります。
- 割線法:力-変位曲線から剛性を計算し、選択したパーセンテージ(5〜10%)で剛性を減らします。(0,0)から始まるラインを、この減少した剛性の勾配でプロットし、力-変位曲線と交差できるようにします。交点には座標(降伏する変位、降伏力)があります。
注: 割線法は、応力-ひずみデータなしで降伏点を見つけるために使用できます。
- 極限力と極限応力
- それぞれのデータセットで最大値を見つけることにより、最大荷重と最大応力を計算します。
- 変位とひずみの特性
- 降伏点までの変位またはひずみを表す降伏およびひずみから降伏までの変位値。それらを見つけるには、ステップ8.3.2の説明に従って歩留まりを見つけます。
- 総変位と全ひずみの値は、試験中にサンプルが経験した総変位または全ひずみを表し、破壊点に対応します。
- 降伏後変位と降伏後ひずみ: 降伏後変位は一般的に報告され、総変位から降伏に対する変位を差し引くことによって計算できます。全ひずみから降伏するひずみを差し引いて降伏後ひずみを計算しますが、ひずみは材料が線形弾性(事前降伏)であるという仮定の下で最初に導出されるため、注意して報告してください。これにより、降伏後のメジャーは無効になりやすくなります。
- エネルギー特性
- エネルギーは、力-変位または応力-ひずみ曲線の下の面積として計算します。
- 力-変位曲線の下の面積は、仕事と呼ばれます。曲線の降伏前部分、または弾性領域の下で計算された面積は、弾性仕事またはエネルギーとして知られています。降伏点を過ぎた曲線の下で計算された面積、または塑性領域は、降伏後または塑性仕事、またはエネルギー損失と呼ばれます。
- 応力-ひずみ曲線の下で計算された総面積は靭性または靭性係数として知られ、降伏点までの応力-ひずみ曲線の下で計算された面積は弾性として知られています。降伏後の靭性は、降伏後のひずみと同様に、この特性が該当しないというひずみ方程式の仮定により、報告されないことがよくあります。
- 剛性と弾性率
図3:力-変位曲線と応力-ひずみ曲線。 (A)理想的な力-変位曲線。(B)降伏点の計算に使用した0.2%オフセット法から導出された線を赤で示した理想的な応力-ひずみ曲線(この線は曲線の弾性領域の傾きと同じであることに注意してください)。力-変位曲線から得られる主な特性には、降伏力、極限力、降伏変位、総変位、および仕事が含まれます。応力-ひずみ曲線から得られる組織レベルの特性には、降伏応力、終局応力、ひずみ対降伏、全ひずみ、弾力性、靭性などがあります。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
CTスキャンが完了すると、ほとんどの不十分なスキャンが再構成で捕捉されます。多くの場合、スキャンが不十分な場合、スキャン中のエラーの明確な指標である高いミスアライメント補正が発生します。ただし、他の手順でエラーが発生し、データが不正確になる可能性もあります。これらのエラーは、計算された個々のアーキテクチャ プロパティを調べるときに発見されることがよくあります。値がグループ内の他の値の範囲から大きく外れている場合は、スキャン、ROI、およびプロパティの計算方法を再検討する必要があります。
曲げ試験が完了したら、各試験の力-変位プロットを調べて、データセットから削除する必要がある可能性のある不十分な試験を特定する必要があります。問題のあるテストの例を 図4に示します。 図4A のプロットは、正しく実行された曲げ試験の結果を示しています。低勾配のトーイン、降伏点、終点(最大力)、変位が最大力を超えて伸びることによる力の低下、および破壊点がない明確な線形領域があります。曲線は滑らかで、最終点に達するまで荷重が急激に変化することはありません。その結果、このテストのプロパティは簡単に識別され、信頼される可能性があります。 図4B に示すプロットは、複数の関連特徴を持つ曲げ試験の結果を示しています。負荷量の急激な変化とプロット内の複数のピークの出現は、この検定の問題の主要な指標です。適切な試験では、極限力付近で小さなピークが発生することがありますが、このプロットのピークの大きさと数は、試験中に骨が転がった可能性があることを示唆しています。テスト中に観察してメモした場合でも、分析前にテストを調べるときに、テスト後の分析中にサンプルデータを調査する必要があります。データに実際に欠陥がある場合、またはグループ内の他のサンプルの範囲から大きく外れている場合は、この検定を最終データセットに含めないのが理想的です。これが、 先験的 検出力計算で実験を適切に強化する理由の1つです。サンプルから特定の特性のみを報告することは可能かもしれませんが(この場合、収率前特性は許容される可能性があります)、これは理想的ではなく、報告時に明確に説明する必要があります。
図4:力-変位プロット 。 (A) 理想的な力-変位プロット。(B)不十分な曲げ試験の結果による力-変位プロット。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
すべての力-変位プロットを調べ、値を応力-ひずみに正規化すると、関心のある特性を特定し、複数の方法で示すことができます。 図 5 に、スタディ全体の力-変位と応力-ひずみのプロットが示されています。これらは、各ボーンの開始点(0,0)、降伏点、最終点、および破損における力と変位を決定し、力/応力と変位/ひずみを平均化して各グループの平均プロットを提供する概略図です。プロットは統計分析には使用されませんが、治療や病状などの要因によって全体的な行動がどのように変化するかを示すために使用できます。 図5に示すプロットは、対照マウスと2型糖尿病および慢性腎臓病(T2D-CKD)の状態で誘発されたマウスを比較した研究からのものです。これらの動物の右脛骨は、4点曲げを使用して失敗するまでテストされ、プロトコルセクション8で説明されている特性を得るために分析されました。 図5から、T2D-CKD群は、構造レベルと組織レベルの両方で、強度や剛性などの機械的特性が低下していることは明らかです。また、これらのマウスは、脆性の指標である降伏後の特性が低下しているようです。これらのプロットは、研究から決定的な結論を導き出すために使用すべきではありません。むしろ、それらは視覚的表現として機能し、関心のあるすべてのプロパティに対して統計分析を実行することによって検証する必要があります。
図5:研究全体の力-変位と応力-ひずみプロット 。 (A)対照動物および2型糖尿病および慢性腎臓病誘発動物の力-変位プロット。このプロットは、各グループの降伏力、降伏変位、極限力、極限変位、破壊力、および総変位を平均し、これらの平均を標準偏差とともにプロットすることによって得られました。(B)対照動物およびT2D-CKD動物のストレス-ひずみ。このプロットは、降伏応力、降伏間ひずみ、最大応力、極限ひずみ、破壊応力、および全ひずみを平均し、結果の平均を標準偏差とともにプロットした結果です。略称:T2D-CKD = 2型糖尿病および慢性腎臓病誘発動物。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
両側 t検定の機械的データと結果を 表Iに示します。データは平均±標準偏差で表されます。一般的な調査では、適切な範囲内で、予想される変動レベルを持つデータが示唆されます。降伏後の特性は変動が大きい傾向があるため、意味のある差を検出するには最大のサンプルサイズが必要になることが多いことに注意してください。図5の概略 図が示すように、ほとんどすべての構造的および組織レベルの機械的特性が大幅に低下しています。これらのデータから、誘発された病態は、変形性の喪失と靭性の低下により、骨が弱くなり、硬くならず、骨折しやすくなったと結論付けることができます。より微妙な比較を伴う研究は、解釈がそれほど簡単ではないかもしれません。この例としては、構造レベルの機械的特性では有意な改善が観察されるが、組織レベルの機械的特性では観察されない場合が考えられます。この場合、観察された影響は、組織レベルでの骨の質の改善ではなく、骨の構造の変化(例えば、面積の増加、皮質の厚さの増加)によって引き起こされる可能性が高い。例えば、編まれた骨の増加により骨面積は増加したが、組織化された層状骨ではなく、組織化されていない織られた骨が存在するようになったため、組織の質は低下している。これは、アーキテクチャに統計的に有意な改善が観察される可能性のあるμCT分析によって裏付けられる可能性があります。対照的に、組織レベルの機械的特性には有意な改善があり、構造レベルの機械的特性にはほとんど改善がない/まったく改善されない可能性があります。この高い組織品質は、小さな骨の落とし穴を覆い隠す可能性があります。降伏前の特性に変化が見られ、降伏後の特性に変化が見られない場合、または その逆の場合、データの解釈はさらに複雑になる可能性があります。前者の場合、変形に抵抗する骨の能力の変化は改善されるかもしれませんが、損傷に耐える能力は改善されません。いずれの場合も、μCT分析から構造特性を参照できることは非常に有益であり、利用する必要があります(ただし、その方法の説明は本稿の範囲外です)。これらの特性の解釈は複雑なため、すべての特性を表または図の形式で提示すると(究極の力など、解釈が最も簡単な傾向のある特性や、伝えようとしているストーリーを伝える特性だけでなく)、機械的衝撃をより完全に表現できます。
| コントロール | T2D-CKDシリーズ | P値 | |||
| 降伏力(N) | 19.7 ± 2.9 | 15.2 ± 2.6 | 0.0032** | ||
| アルティメットフォース(N) | 22.8 ± 3 | 17.6 ± 3.4 | 0.0031** | ||
| 変位収量(μm) | 205±17 | 190±21 | 0.1039 | ||
| 降伏後変位 (μm) | 246±235 | 60±51 | 0.0435* | ||
| 総分配量(μm) | 451 ± 230 | 249 ± 53 | 0.0278* | ||
| 剛性(N/mm) | 110±10 | 91±13 | 0.0037** | ||
| 収穫量 (mJ) | 2.16 ± 0.45 | 1.54 ± 0.36 | 0.0055** | ||
| 降伏後作業量(mJ) | 4.24 ± 3.01 | 1.04 ± 0.9 | 0.0109* | ||
| 総作業量 (mJ) | 6.4 ± 2.88 | 2.58 ± 0.97 | 0.0025** | ||
| 降伏応力(MPa) | 180±20 | 157 ± 25 | 0.0504 | ||
| 最大応力(MPa) | 209±26 | 181 ± 27 | 0.0434* | ||
| ひずみ降伏(mɛ) | 16.8 ±2 | 16.4 ± 1.5 | 0.5771 | ||
| 全ひずみ(mɛ) | 36.6 ± 17.2 | 21.5 ± 4.3 | 0.0277* | ||
| 弾性率(GPa) | 12.2 ±1.1 | 10.9 ± 1.1 | 0.0171* | ||
| レジリエンス(MPa) | 1.62 ± 0.33 | 1.38 ± 0.33 | 0.1377 | ||
| 靭性(MPa) | 4.85±2.29 | 2.26 ± 0.73 | 0.0076** | ||
表1:機械的試験と統計分析の結果。 標準偏差±平均値として表示される値。P値は、両側対応のない t検定の結果です。* P < 0.05 および ** P < 0.01。略称:T2D-CKD = 2型糖尿病および慢性腎臓病誘発動物。
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Discussion
スキャンとテストのプロセス全体を通して、トラブルシューティングと最適化が適切な瞬間があります。1つ目は、μCTで骨をスキャンするときに発生します。多くのシステムには、1つのオブジェクトを保持してスキャンできるホルダーが付属していますが、カスタムホルダーを作成して複数のボーンを同時にスキャンすることができます。複数のボーンをスキャンすることは、最適化のための優れたポイントですが、スキャンと分析のプロセス全体を通して、アーチファクトが誘発されないように注意する必要があります。X線は角度増分ごとにさまざまな量の骨組織を通過する(そして減衰する)ため、結果のデータが不正確になる可能性があります。
トラブルシューティングの 2 つ目のポイントは、スキャンの再構築です。使用するプログラムに応じて、ユーザーはスキャンの減衰係数値から計算された再構成の密度ウィンドウを定義できます。これは、X線ビームが物体5によってどれだけ減衰するかを表すために使用される線形係数である。一部のプログラムでは、これらの密度を取得し、ヒストグラムで 0 から 255 の範囲のグレースケール値に変換します。2 つの値がヒストグラムに表示され、コントラスト制限10 として知られており、ボーン ボクセルと非ボーン ボクセルを認識できるように適切に設定する必要があります。通常、低い値はゼロのグレースケール値に設定され、高いコントラスト値は、対象の材料(ボーン)の最大減衰の10〜20%に設定することをお勧めします10。この値が適切に設定されていないと、データの一部が切り捨てられる可能性があるため、分析でエラーが発生する可能性があります。したがって、この値は、スキャンされたサンプルに応じて調整する必要があります。ベスト プラクティスは、ヒストグラムを対数スケールで表示し、上限を対数裾の末尾よりわずかに大きい数値として選択して、すべてのボーン データが含まれるようにすることです10。
トラブルシューティングのための追加のポイントは、機械的テストと分析中に発生します。試験中および試験後の力-変位曲線の表示中に、転がったサンプルが発見される可能性があり、代表的な結果で説明したように、データセットから削除する必要があります。さらに、テストされる骨の形状を支配する仮定があるため、骨の向きに関して注意を払う必要があります。オイラー・ベルヌーイ曲げ方程式を使用して応力とひずみを計算する場合、サンプルの断面は長さ3 に沿って均一であると仮定します。ほとんどのボーンは均一な断面を持たないため、テストするボーンの最も均一な領域を選択するのが最善です(3点曲げの場合はサポートスパン全体、4点曲げの場合は荷重点間)。
大腿骨では、ミッドシャフトでの3点曲げ試験が好ましい。骨の湾曲は緩やかなため、局所的な表面の座屈を防ぐために、湾曲の方向でテストする必要があります(つまり、前面に張力がかかった状態で大腿骨をテストする)。脛骨はより可変的な断面形状を有するため、試験に理想的な領域は、脛骨と腓骨の接合部のすぐ近位から始まります。骨が内側表面に張力がかかった状態で配置されている場合、テストされる骨の領域は平坦であり、曲げ方向の半径と慣性モーメントの変動が最も少なくなります。また、曲げ試験の結果を解釈する際には、材料が等方性、均質性、直線弾性であるという仮定に注意する必要があります - 骨3を試験する際には、これらの仮定のそれぞれがある程度違反されます。Boneはこれらの仮定に当てはめることができないため、曲げ試験の結果は慎重に解釈する必要があります。最も慎重に解釈する必要がある特性は、降伏点を過ぎた応力-ひずみ曲線から導出された特性であり、定義上、降伏を渡すことは線形弾性の仮定に違反するためです。骨の形状の正規化は可能ですが、グループ間で大きな違いがない限り、動物の体重に正規化を試みることは推奨されません。この場合、これらの差を補正するために共分散の分析を実行できますが、ほとんどの場合、体重に対する一般的な正規化は避けるべきです。
このプロセス全体で発生する可能性のあるトラブルシューティングの問題にもかかわらず、曲げ試験は、骨の骨折に対する感受性を説明できる機械的特性をもたらします。また、これらのテストは比較的簡単で、迅速に実行できます。これらの検定の絶対値が常に完全に有効であるとは限りませんが、グループ間の相対的な差を検出できれば、さまざまなサイズや形状のサンプルに対して非常に正確です。得られた機械的特性は、骨の違いが予想される研究において機能的な関連性を提供します。単調破壊試験は最も一般的で簡単にアクセスできる機械的試験ですが、疲労寿命や破壊靭性などの他の方法では、関心のある追加の機械的特性が明らかになる可能性があり、検討できます。
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Disclosures
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
このプロトコルを開発するために行われた作業は、米国国立衛生研究所(NIH)の支援を受けています[AR072609]。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTAn | Bruker | NA | CT Scan Analysis Software |
| DataViewer | Bruker | NA | CT Scan Rotation Software |
| Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a | MathWorks | NA | Coding platform used for data analysis |
| NRecon | Bruker | NA | CT Scan Reconstruction software |
| SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software | Micro Photonics Inc | SKY-016814 | Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object |
References
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- Basic and Applied Bone Biology. Eds Burr, D. B., Allen, M. R. , Elsevier/Academic Press, London. (2019).
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