Summary
Wir beschreiben eine Methode für die Microarray-Analyse der relativen Aminoacylierung Pegel aller tRNAs aus bestimmen
Abstract
tRNA Aminoacylierung oder des Ladevorgangs kann Ebenen schnell innerhalb einer Zelle ändern in Reaktion auf die Umwelt [1]. Änderungen in tRNA Ladezustände in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen führen zu translationale Regulation, die eine wichtige zelluläre Mechanismus der Reaktion auf Stress ist. Bekannte Beispiele sind die strengen Reaktion in
Protocol
Teil 1: Isolierung von Gesamt-tRNA geladen
- Pellet-Zellen in einer Tischzentrifuge bei 2000 RFC für 5 Minuten. Der Gegenwert von 1 OD 600 von Zellen sollte mindestens 1 g Gesamt-RNA und ein Minimum von 30 Mikrogramm ist für das Verfahren empfohlen.
- Die Zellen in Lysepuffer Lösung bestehend aus 0,3 M gepufferte Na +-Acetat (pH 4,5) und 10 mM EDTA. Vortex mit dem gleichen Volumen von Na +-Acetat-gesättigtem Phenol / Chloroform (pH 4,5) dreimal für jeweils 30 s. Achten Sie darauf, stets Proben auf Eis zwischen Vortexen. Buffered-Acetat kann von NaOAc und HOAc vorbereitet werden, während Acetat gesättigtem Phenol / Chloroform durch Mischen von 1 Teil 5 M gepufferte Acetat (pH 4,5) mit 9 Teilen Phenol / Chloroform hergestellt werden kann.
Hinweis: Gesamt-RNA isoliert wird unter schwach sauren Bedingungen und auf Eis durchgeführt, um Deacylierung geladener tRNA zu vermeiden. - Zentrifugation bei 18.600 RFC für 15 Minuten bei 4 ° C. Entfernen der wässrigen Schicht und führen Sie einen anderen Acetat-gesättigtem Phenol / Chloroform-Extraktion.
- Nach der zweiten Extraktion Fällung der RNA durch Zugabe von 2.7x Volumen Ethanol und Zentrifugation bei 18.600 RFC für 30 Minuten bei 4 ° C.
- Resuspendieren RNA-Pellets in Lysepuffer gewaschen und dann Niederschlag mit Ethanol ein zweites Mal.
- Schließlich resuspendieren RNA in eine Lösung mit 10 mM Acetat-gepufferten (pH 4,5) und 1 mM EDTA für die anschließende Behandlung. Die Probe kann stabil bei -80 ° C für etwa zwei Wochen gelagert. Eine längere Lagerung ist nicht empfehlenswert, da einige geladene tRNA beginnt zu deacylate.
Teil 2: Herstellung von tRNA Standards
- Hitze E. coli tRNA Standards bei 10,5 uM bis 85 ° C in 45 mM Tris-Cl pH 7,5 für 2 Minuten. Nehmen Sie den Schlauch heraus und lassen bei Raumtemperatur für 3 Minuten.
- Add MgCl 2 bis zu einer Endkonzentration von 20 mM und Inkubation bei 37 ° C für 5 Minuten.
- Fügen Sie die Synthetase-Reaktion mischen, so dass die endgültige Reaktion enthält 5 uM tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 3 mM Dithiothreitol, 1,5 mM ATP, 1 mM Spermin, 1 mM des jeweiligen Aminosäure und 4,2 Einheiten / ul E. coli Aminoacyl-tRNA-Synthetase-Mix. Bei 37 ° C für 15 Minuten.
- Fügen Sie dem gleichen Volumen von 0,5 M gepufferte Acetat (pH 4,5) und extrahieren mit Acetat-gesättigtem Phenol / CHCl 3 bei pH 4,5.
- Fällung der tRNA-Standards mit 2.7x Volumen Ethanol und Zentrifugation bei 18.600 RFC für 30 Minuten bei 4 ° C.
- Resuspendieren Standards in 50 mM Acetat gepufferten (pH 4,5) mit 1 mM EDTA und bei -80 ° C bis zu einem Monat.
Teil 3: Cy3/Cy5 Kennzeichnung von tRNA
- Für die geladenen tRNA Probe inkubieren Gesamt-RNA bei einer Konzentration von 0,1 ug / ul mit 0,066 uM jedes E. coli tRNA-Normen (dh 0,67 pmol jedes Standard pro pg Gesamt-RNA) und 100 mM Acetat gepufferten (pH 4,5) in Gegenwart von 50 mM NaIO4 für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Für die Regelung der gesamten tRNA-Beispiel verwenden 50 mM NaCl anstelle von NaIO4. Denken Sie daran, die RNA nur mit gepufferten Lösungen zu bewahren Laden zu verdünnen.
- Zum Abschrecken der Reaktion zuzusetzen Glukose zu 100 mM und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
- Um die verbleibenden NaIO4 aus der Probe zu entfernen führen Sie einen Puffer Austausch mit einem G25-Spin-Säule. Für beste Ergebnisse Äquilibrierung der Säule zuerst, indem Sie 200 mM gepufferten Acetatpuffer (pH 4,5) durch ihn vor dem Auftragen Ihrer Probe.
- Man fällt die Probe, indem gepuffert Acetat (pH 4,5) auf eine Endkonzentration von 133 mM und NaCl auf eine Endkonzentration von 66 mM und 2.7x Volumen Ethanol. Gelegentlich eine zweite Fällung kann für die oxidierten Proben benötigt werden. Dies ist nur erforderlich, wenn das Pellet sieht deutlich anders als in der Kontrollgruppe Pellet der gleichen Probe. Zum Beispiel eine deutlich größere oder mehr diffuse Pellet. Wenn eine zweite Ethanolfällung Pellet in 50 mM Acetatpuffer pH 4,5 und 200 mM NaCl, bevor die Zugabe von Ethanol benötigt.
- Für Deacylierung der tRNA-Proben werden in 50 mM Tris-HCl resuspendiert (pH 9) und bei 37 ° C für 30 min. Die Reaktion wird durch Zugabe eines gleichen Volumen 50 mM Acetat gepufferten (pH 4,5) und 100 mM NaCl neutralisiert. Niederschlag mit 2.7x Volumen Ethanol. Nach der Fällung wird die RNA in Wasser bei ~ 1 ug / ul resuspendiert. Sowohl die Steuerung und oxidierten Proben sollten auf Agarosegelen ausgeführt werden, um RNA-Qualität zu überprüfen.
- So hängen fluoreszierende Oligo-Tags auf die tRNA 0,1 ug / ul deacylierten RNA wird in 1x Ligase-Puffer, 15% DMSO, 4 uM Cy3-oder Cy5-haltigen Oligonukleotiden, 0,5 Einheiten / ul T4 DNA-Ligase und Hefe exo-Phosphatase (5.000 Einheiten / ul) bei 16 ° C über Nacht (über 16 h). Die exo-Phosphatase ist nur für Proben aus Hefe gewonnen und kann omitted, wenn dieses Protokoll ist für E. verwendet coli oder menschlichen Proben.
- Nach der Ligation Proben werden mit 4 Volumina 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM KCl, und dann mit dem gleichen Volumen Phenol / Chloroform extrahiert. Nach Extraktion der wässrigen Phase werden RNA-Präparationen mit Ethanol gefällt und in Wasser resuspendiert etwa 0,1 ug / ul.
- Ligation Effizienz kann durch Ausführen von 5-10% der Proben auf 12% Polyacrylamidgele 7M Harnstoff bewertet und visualisiert mit einem fluoreszierenden Gel-Scanner. Das PAGE-Analyse ist auch nützlich, um die Menge an oxidierten Proben und Kontrollproben für die Microarray-Hybridisierung benötigt bestimmen. Eine gute Ligation Ergebnis sollte ~ 10% oder mehr der Cy3/Cy5 mit Oligonukleotids an die tRNA wird ligiert. Für Proben mit einer guten Kennzeichnung Effizienz ist 0,1-0,5 pg Gesamt-RNA pro Probe für die Array-Hybridisierung verwendet.
Teil 4: Hybridisierung und Analyse der Microarray
- Vor Hybridisierung Microarray-Slides werden in destilliertem Wasser für 1-2 Minuten, um ungebundene Oligonukleotide zu entfernen gekocht.
- Cy3/Cy5 markierten Proben werden mit 140 ul Hybridisierungspuffer und Lachssperma-DNA auf eine Endkonzentration von 140 pg / ml und Poly (A) bis zu einer Endkonzentration von 70 pg / ml kombiniert.
- Eine Hybridisierung Programm (Tabelle 1) wird auf einer automatischen Array Züchter laufen. Für tRNA arbeiten, ist es dringend empfohlen, eine automatische Hybridisierung Maschine verwendet werden, da manuelle Hybridisierung erzeugt hohe Hintergrund.
- Nachdem das Programm beendet ist manuell waschen die Folien mit Wash 3-Lösung mindestens zweimal durch vorsichtiges Schütteln in einem 50 ml konischen Rohr für 3-5 Minuten.
- Dias können durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, weniger als 200 RFC, für 5-10 Minuten getrocknet werden. Es ist wichtig, um die Folien zu halten aus dem Licht da Lichteinwirkung wird bleichen Fluorophore.
- Nach dem Objektträger getrocknet sind, sollten sie sofort für optimale Ergebnisse geprüft werden, ggf. können sie für mehrere Tage in einem trockenen dunklen Ort bei Raumtemperatur gespeichert werden. Dias können 2-3 Mal ohne merkliche Verschlechterung der Bildqualität gescannt werden.
Teil 5: Repräsentative Ergebnisse
Als isolierte richtig die RNA-Probe sollte eine sehr saubere Spektrum mit einer OD 260: OD 280-Verhältnis in der Nähe 2. Es sollte kein nachweisbares Protein oder Phenol Kontamination sein. Wenn auf 1% Agarosegelen laufen, sollte eine starke tRNA-Band mit anderen möglichen Nukleinsäure Bands variierte zwischen Organismen zu beobachten. Nach der Oxidation einer sauberen tRNA-Band sind zu beachten. Wenn eine Probe ist deutlich schwächer als andere Proben oder Verschmieren beobachtet wird, sollten die Proben nicht für Microarrays verwendet werden. Microarrays sollte sehr niedrigen Hintergrund, um eine Größenordnung niedriger als die schwächsten tRNA-Sonde. Hoher Hintergrund ist in der Regel aufgrund von Problemen während der Waschschritte. Diese können in der Regel durch die Vorbereitung frische Waschlösungen und gründlich waschen alle Geräte und Schläuche zu Rest-und ausgefallene SDS zu entfernen fixiert werden.
| Schritt | Details |
| O-Ring-Anlage | 75 ° C, 2 min |
| Einführung Probe | 60 ° C |
| Denaturieren Probe | 90 ° C, 5 min |
| Hybridisierung | 60 ° C, 16h |
| Waschlösung 1 | 50 ° C, halten flow 10s 20s |
| Wash 2 | 42 ° C, halten flow 10s 20s |
| Wash 3 | 42 ° C, halten flow 10s 20s |
Tabelle 1: Die Hybridisierung Protokoll
Discussion
Wir stellen eine Methode zur gleichzeitigen Bestimmung der relativen Ladezustand aller tRNAs auf genomischer Ebene. Das Protokoll präsentierte hier ist für S. optimiert cerevisiae, und es wurde auch erfolgreich zur tRNA Ladeprofile in E. messen coli und menschlichen Zellkulturen. Es kann geändert werden, um jeden Organismus mit bekannten Genomsequenzen (unter Berücksichtigung der Anmerkungen der tRNA-Gene), so lange beherbergen, da insgesamt berechnet tRNA erreicht werden kann.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Hefe Arbeit in der Pan-Labor wurde durch einen Zuschuss von Ajinomoto, Inc. in Japan und National Institutes of Health Training Grant T32GM007183-33 finanziert. Wir danken Dr. Ronald Wek an der Indiana University School of Medicine für die langfristige Zusammenarbeit auf der Hefe-Projekte. Wir danken auch Dr. Kimberly Dittmar für die Entwicklung der tRNA-Beladung Microarray-Methode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microspin G-25 columns | GE Healthcare | 25-5325-01 | |
| E. coli tRNAPhe | Sigma-Aldrich | R3143 | |
| E. coli tRNATyr | Sigma-Aldrich | R0258 | |
| E. coli tRNALys | Sigma-Aldrich | R6018 | |
| E. coli aminoacyl-tRNA synthetases | Sigma-Aldrich | A3646 | |
| T4 DNA ligase | USB Corp., Affymetrix | 70042X | |
| PerfectHyb Plus | Sigma-Aldrich | H-7033 | |
| Hyb4 station | Digilab | ||
| GenePix 4000B scanner | Axon instruments | ||
| GenePix 6.0 | Axon instruments |
References
- Zaborske, J. M. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).
- Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids. Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).
- Hinnebusch, A. G. Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast. Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).
- Braeken, K. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Dong, J. Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain. Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).
- Cashel, M. The Stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).
- Dittmar, K. A. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
- Zhou, Y. High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma. Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).
