Summary
Nós descrevemos um método para análise de microarray para determinar os níveis aminoacylation relação de todos os tRNAs de
Abstract
tRNA aminoacylation, ou carga, os níveis podem mudar rapidamente dentro de uma célula em resposta ao ambiente [1]. Mudanças nos níveis de carregamento tRNA em células procariotas e eucariotas levar a regulação de translação que é um dos principais mecanismos celulares de resposta ao estresse. Exemplos familiares são a resposta rigorosa em
Protocol
Parte 1: Isolamento de tRNA cobrados total de
- Células sedimento em uma centrífuga de mesa em 2000 RFC por 5 minutos. O equivalente a 1 600 OD de células deve produzir pelo menos 1μg de RNA total e um mínimo de 30 mg é recomendado para o procedimento.
- Ressuspender as células em solução tampão de lise constituído por 0,3 M tampão acetato de Na + (pH 4,5) e 10 mM EDTA. Vortex com igual volume de acetato de Na +-saturada de fenol / clorofórmio (pH 4,5) três vezes para cada 30 s. Certifique-se sempre manter as amostras em gelo entre vórtex. Acetato de tampão pode ser preparada a partir de NaOAC e HOAc enquanto saturada de acetato de fenol / clorofórmio pode ser preparado pela mistura de 1 parte 5 M tampão acetato (pH 4,5) com 9 partes de fenol / clorofórmio.
Nota: o isolamento do RNA total é realizada sob condições levemente ácidas e no gelo para evitar deacylation de tRNA carregado. - Centrifugar a 18.600 RFC por 15 minutos a 4 ° C. Remover a camada aquosa e executar a nova extracção de acetato saturada de fenol / clorofórmio.
- Após a segunda extração precipitar o RNA, adicionando volumes de etanol e 2,7 x centrifugação a 18.600 RFC por 30 minutos a 4 ° C.
- Pellets ressuspender RNA em solução tampão de lise e precipitado com etanol pela segunda vez.
- Finalmente, ressuspender o RNA em uma solução contendo 10 mM de acetato tamponado (pH 4,5) e 1 mM EDTA para posterior tratamento. A amostra pode ser armazenada de maneira estável a -80 ° C por cerca de duas semanas. Prolongar o armazenamento não é recomendado como alguns tRNA carregado vai começar a deacylate.
Parte 2: Elaboração de Normas de tRNA
- Calor E. padrões coli tRNA em 10,5 M a 85 ° C em 45 mM Tris-Cl pH 7,5 por 2 minutos. Pegue o tubo e deixe em temperatura ambiente por 3 minutos.
- Adicionar MgCl 2 a uma concentração final de 20 mM e incubar a 37 ° C por 5 minutos.
- Adicione a mistura de reacção sintetase para a reação final contém 5 mM tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 3 mM ditiotreitol, 1,5 mM ATP, 1 mM espermina, 1 mM dos respectivos aminoácido, e 4,2 unidades / mL E. coli mix sintetase aminoacil-tRNA. Incubar a 37 ° C por 15 minutos.
- Adicionar um volume igual de 0,5 M de acetato tampão (pH 4.5) e extrair com acetato saturada de fenol / CHCl 3 em pH 4.5.
- Precipitar os padrões tRNA com volumes de etanol e 2,7 x centrifugação a 18.600 RFC por 30 minutos a 4 ° C.
- Ressuspender as normas em 50 mM tampão acetato (pH 4,5) com 1 mM EDTA e armazenar a -80 ° C por até um mês.
Parte 3: Cy3/Cy5 rotulagem de tRNA
- Para a amostra tRNA cobrado incubar RNA total a uma concentração de 0,1 g / mL com 0,066 mM cada E. coli tRNA padrões (ie pmole 0,67 mg por cada padrão de RNA total) e 100 mM de acetato tamponado (pH 4,5) na presença de 50 mM NaIO4 por 30 minutos em temperatura ambiente. Para controlar o uso total da amostra tRNA 50 mM NaCl no lugar de NaIO4. Lembre-se de diluir o RNA apenas com soluções tamponadas para preservar a carregar.
- Para matar a reação de glicose para adicionar 100 mM e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.
- , A fim de remover qualquer NaIO4 restante da amostra realizar uma troca de buffer usando uma coluna de spin G25. Para melhores resultados equilibrar a primeira coluna, executando 200 mM tampão acetato tamponado (pH 4,5) por ele antes de aplicar a sua amostra.
- Precipitar a amostra pela adição de acetato tamponado (pH 4,5) para uma concentração final de 133 mM e NaCl para uma concentração final de 66 mM e 2,7 x volumes de etanol. Ocasionalmente, uma segunda precipitação podem ser necessários para as amostras oxidadas. Isso é necessário somente se o pellet parece significativamente diferente do pellet controle da mesma amostra. Por exemplo, um pellet significativamente maior ou mais difusa. Se uma precipitação etanol de segunda é necessária ressuspender pellet em 50 mM de acetato pH 4,5 e 200 mM NaCl antes da adição de etanol.
- Para as amostras deacylation tRNA são suspensas em 50 mM Tris-HCl (pH 9) e incubados a 37 ° C por 30 min. A reação é neutralizado pela adição de igual volume de acetato 50 mM tampão (pH 4,5) e 100 mM NaCl. Precipitado com 2,7 x volumes de etanol. Após precipitação, o RNA é ressuspenso em água a ~ 1 mg / mL. Tanto o controle e as amostras oxidadas devem ser executados em gel de agarose para verificar a qualidade RNA.
- Para anexar etiquetas fluorescentes oligo para o tRNA 0,1 mcg / mL de RNA deacylated é incubada em 1x tampão ligase, DMSO 15%, 4 mM Cy3 ou Cy5 contendo oligonucleotides, 0,5 unidades / mL DNA ligase T4, e leveduras exo-fosfatase (5.000 unidades / mL) a 16 ° C durante a noite (mais de 16 h). O exo-fosfatase é necessário apenas para as amostras obtidas a partir de leveduras e pode ser omitted se esse protocolo é utilizado para E. coli ou amostras humanas.
- Após ligadura amostras são misturadas com 4 volumes de 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM KCl, e então extraído com um volume igual de clorofórmio fenol /. Após a extracção da fase aquosa, os preparativos estão RNA precipitado com etanol e ressuspenso em água a cerca de 0,1 mcg / mL.
- Ligadura eficiência pode ser avaliada através da execução de 5-10% das amostras em gel de poliacrilamida 12% contendo uréia 7M e visualizado com um scanner gel fluorescente. Esta análise PAGE também é útil para determinar a quantidade de oxidado e amostras de controlo necessários para a hibridização microarray. Um resultado bom ligadura deve mostrar ~ 10% ou mais do oligonucleotídeo Cy3/Cy5 contendo sendo ligada ao tRNA. Para amostras com eficiência rotulagem bom, 0,1-0,5 mg RNA total por amostra é utilizada para a hibridização matriz.
Parte 4: Hibridação e Análise do Microarray
- Antes de slides microarray de hibridização são fervidas em água destilada por 1-2 minutos para remover oligonucleotides desacoplado.
- Cy3/Cy5 amostras rotuladas são combinados com 140 mL de tampão de hibridação e DNA de esperma de salmão para uma concentração final de 140 mg / ml e poli (A) para uma concentração final de 70 mcg / ml.
- Um programa de hibridação, (tabela 1), é executado em uma variedade hybridizer automática. TRNA para o trabalho, é altamente recomendável que uma máquina automática de hibridização ser usado desde a hibridização produz manual de fundo de alta.
- Depois que o programa está completo manualmente lavar as lâminas com solução de Lavar 3 pelo menos duas vezes agitando em um tubo de 50 ml por 3-5 minutos.
- Slides pode ser secas por centrifugação a baixa velocidade, a menos de 200 RFC, por 5-10 minutos. É importante manter o desliza para fora da luz desde a exposição à luz alvejarão o fluoróforos.
- Após as lâminas são secas que devem ser verificados imediatamente para melhores resultados, se necessário, eles podem ser salvos por vários dias em um lugar seco e escuro à temperatura ambiente. Slides podem ser digitalizados 2-3 vezes sem degradação perceptível na qualidade da imagem.
Parte 5: Resultados Representante
Quando isolados adequadamente a amostra de RNA total, deve produzir um espectro muito limpo, com uma 260 OD: OD relação de perto de 2 280. Não deve haver nenhuma proteína ou contaminação detectável fenol. Quando executado em gel agarose 1%, uma banda tRNA forte deve ser observado com outros possíveis bandas de ácido nucléico variando entre organismos. Após a oxidação de uma banda tRNA limpas devem ser observados. Se uma amostra é visivelmente mais fraco do que outras amostras ou manchas é observada, as amostras não devem ser usadas para microarrays. Microarrays devem ter fundo muito baixa, que é uma ordem de magnitude menor do que a sonda mais fraco tRNA. Elevado ruído de fundo é geralmente devido a problemas durante as etapas de lavagem. Isto normalmente pode ser corrigido através da preparação de soluções de lavagem fresca e lavar bem todos os equipamentos e tubulação para remover SDS residual e precipitado.
| Passo | Detalhes |
| O-ring condicionado | 75 ° C, 2 min |
| Apresentar amostra | 60 ° C |
| Exemplo de desnaturar | 90 ° C, 5 min |
| Hibridização | 60 ° C, 16h |
| Lavar uma | 50 ° C, 10s fluxo segurar 20s |
| Lavar 2 | 42 ° C, 10s fluxo segurar 20s |
| Lavar 3 | 42 ° C, 10s fluxo segurar 20s |
Tabela 1: Protocolo de hibridação
Discussion
Nós apresentamos um método para determinar simultaneamente os níveis relativos de carga de todos os tRNAs em escala genômica. O protocolo aqui apresentado foi otimizado para S. cerevisiae, e também tem sido utilizado com sucesso para medir perfis de carga tRNA em E. coli e culturas de células humanas. Ele pode ser modificado para acomodar qualquer organismo com seqüências do genoma conhecido (permitindo a anotação de todos os genes tRNA), desde que tRNA cobrados total pode ser obtida.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O trabalho de fermento no laboratório Pan foi financiado por uma doação da Ajinomoto, Inc. Japão e National Institutes of Health Training Grant T32GM007183-33. Agradecemos ao Dr. Ronald Wek na Escola de Medicina da Universidade de Indiana para a colaboração a longo prazo sobre os projetos de levedura. Agradecemos também a Dra. Kimberly Dittmar para o desenvolvimento do método de carregamento tRNA microarray.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microspin G-25 columns | GE Healthcare | 25-5325-01 | |
| E. coli tRNAPhe | Sigma-Aldrich | R3143 | |
| E. coli tRNATyr | Sigma-Aldrich | R0258 | |
| E. coli tRNALys | Sigma-Aldrich | R6018 | |
| E. coli aminoacyl-tRNA synthetases | Sigma-Aldrich | A3646 | |
| T4 DNA ligase | USB Corp., Affymetrix | 70042X | |
| PerfectHyb Plus | Sigma-Aldrich | H-7033 | |
| Hyb4 station | Digilab | ||
| GenePix 4000B scanner | Axon instruments | ||
| GenePix 6.0 | Axon instruments |
References
- Zaborske, J. M. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).
- Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids. Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).
- Hinnebusch, A. G. Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast. Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).
- Braeken, K. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Dong, J. Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain. Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).
- Cashel, M. The Stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).
- Dittmar, K. A. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
- Zhou, Y. High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma. Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).
