Summary
我们描述了一种用于微阵列分析的方法来确定所有的tRNA相对酰化水平
Abstract
tRNA的氨酰化，或充电，水平可以迅速改变细胞内的环境[1]。 tRNA的变化，在原核和真核细胞收费水平，导致翻译调控，这是一个重大的应激反应的细胞机制。熟悉的例子是在严格的响应
Protocol
第1部分：总收取的tRNA分离
- 在2000年的RFC台式离心机在5分钟沉淀细胞。相当于600 1细胞的OD应该产生至少1μg总RNA和程序建议至少30微克。
- 悬浮细胞裂解缓冲液中，0.3米的缓冲 NA +醋酸（pH值4.5）和10 mM EDTA。 NA +醋酸饱和酚/氯仿（pH值4.5）的三倍为30秒同等体积的涡一定要始终保持在冰样本之间震荡。缓冲醋酸可准备从NaOAC和醋酸，而醋酸饱和酚/氯仿可以准备9份酚/氯仿混合1份5个M醋酸缓冲液（pH值4.5）。
注：总RNA的分离是轻度酸性条件下和在冰上进行，以避免收取的tRNA deacylation。 - 离心15分钟，在18600的RFC 4 ° C。取出水层和执行另一个醋酸饱和酚/氯仿抽提。
- 第二萃取沉淀后加入2.7倍体积的乙醇和30分钟，离心18600 RFC在4 ° C的RNA
- RNA的悬浮颗粒在裂解缓冲液，然后用乙醇沉淀的第二次。
- 最后，重悬的RNA在含有10 mM的醋酸缓冲液（pH 4.5）和1 mM EDTA的后续治疗解决方案。样本可稳定储存于-80 ° C，大约两个星期。更长的储存，不建议作为部分收取的tRNA将开始deacylate。
第2部分：tRNA的标准准备
- 热E。大肠杆菌 tRNA的标准10.5微米至85 ° C在45毫米的Tris - CL pH值7.5 2分钟。以管为3分钟，在室温下离开。
- MgCl 2的一个终浓度为20毫米，并培育在37℃5分钟。
- 所以最终的反应含有氯化钾10毫米，5微米的tRNA，60毫米的Tris - HCl（pH值7.5），12.5毫米氯化镁2，3 mM的二硫苏糖醇，1.5毫米ATP，精胺1毫米，1毫米各自添加合成反应混合物氨基酸，4.2单位/μL 大肠杆菌大肠杆菌氨酰- tRNA合成酶混合。 37 ° 15分钟。
- 加入同等体积的0.5 M的醋酸（pH值4.5）缓冲和醋酸饱和酚/ 氯仿提取，在pH值4.5 。
- tRNA的标准2.7倍体积的乙醇，离心沉淀在18600 RFC 30分钟，在4 ° C
- 重悬在50毫米缓冲醋酸（pH值4.5）与1毫米EDTA和储存在-80 ° C至一个月标准。
第3部分：Cy3/Cy5 tRNA的标签
- 对于收取的tRNA样品与0.066μM孵化总RNA E.浓度为0.1微克/μL 大肠杆菌 tRNA的标准（即0.67 pmole标准每人μg总RNA）和100毫米的缓冲醋酸（pH值4.5）在室温下30分钟的50毫米NaIO4存在。对于控制总tRNA的样品使用50毫米NaIO4地方氯化钠。请记住只稀释与缓冲的解决方案，以保持充电的RNA。
- 解渴的反应，添加葡萄糖100毫米，在室温下孵育5分钟。
- 为了从样本中删除任何剩余的NaIO4执行缓冲区交换使用G25离心柱。为了达到最佳效果平衡列运行通过它的200毫米的缓冲醋酸缓冲液（pH值4.5）之前申请您的样品。
- 样品缓冲醋酸（pH值4.5）的133毫米和NaCl终浓度加入到终浓度为66毫米和2.7倍体积的乙醇沉淀。偶尔氧化样品可能需要第二次降水。这是必要的，只有当颗粒看起来明显高于同一样品的控制颗粒不同。例如，一个显着更大的或更分散的颗粒。如果第二个需要乙醇沉淀重新悬浮颗粒在50 mM的醋酸缓冲液pH值4.5，氯化钠和200毫米，前增加乙醇。
- deacylation tRNA的样品悬浮于50毫米的Tris - HCl（pH值）在37 ° C孵育30 min。反应是同等体积的50 mM的醋酸缓冲液（pH 4.5）和100 mM氯化钠此外瓦解。沉淀用2.7倍体积的乙醇。 RNA是经过沉淀，悬浮在水中〜1μg/μL的。琼脂糖凝胶上运行，在控制和氧化样品应检查RNA的质量。
- 要连接到tRNA的0.1微克/μLdeacylated RNA荧光寡核苷酸标记孵育1X连接酶缓冲液，15％二甲基亚砜，4微米Cy3标记或Cy5的含寡核苷酸，0.5单位/μLT4 DNA连接酶和酵母外磷酸酶（5000单位/μL16）° C过夜（超过16小时）。 EXO -磷酸仅适用于从酵母中获得的样本是必要的和可omitted如果这个协议是用于大肠杆菌大肠杆菌或人体标本。
- 结扎后的样品混合50 mM的KOAc（pH值7），200毫米氯化钾，并与等体积酚/氯仿提取，然后用4卷。水相萃取后，用乙醇沉淀RNA的准备工作和在水中的悬浮约0.1μg/μL的。
- 连接效率，可以运行5-10％的样本含7M尿素的12％聚丙烯酰胺凝胶，并用荧光凝胶扫描仪观察评估。此页的分析也是有用的，确定氧化和控制芯片杂交所需的样本量。一个良好结扎结果表明，〜10％或更多的Cy3/Cy5含有寡核苷酸酶的tRNA。对于良好的标记效率的样品，每个样品的总RNA 0.1-0.5微克用于阵列杂交。
第4部分：杂交和基因芯片分析
- 杂交芯片幻灯片之前在蒸馏水中煮沸1-2分钟，以去除未结合的寡核苷酸。
- Cy3/Cy5标记的样品相结合，与140μL的杂交缓冲液和鲑鱼的精子DNA的终浓度为140微克/毫升的poly（A）到终浓度为70微克/毫升。
- 杂交方案（表1），运行自动数组hybridizer。 tRNA的工作，这是强烈建议使用，因为人工杂交产生高的背景自动杂交机。
- 程序完成后手动用洗3解决方案的幻灯片至少两次轻轻摇晃3-5分钟，在50 ml锥形管。
- 幻灯片可以干离心5-10分钟，在较低的速度，小于200的RFC。重要的是保持光的幻灯片，因为暴露在光线下会漂白荧光团。
- 幻灯片干燥后，他们应该被扫描立即以达到最佳的效果，如果必要的话，他们可以几天在干燥的室温避光的地方保存。幻灯片可以扫描在图像质量没有明显退化的2-3倍。
第5部分：代表结果
当孤立的总RNA样品应产生一个非常干净的频谱与外径 260： 外径 280接近2的比例。应该没有检测的蛋白质或酚污染。 1％琼脂糖凝胶上运行时，强大的tRNA的频段应与其他可能的核酸生物之间的不同波段观察。氧化后，一个干净的tRNA的频段应得到遵守。如果样品是明显比其他样品或涂抹观察弱，样品不应该被用来对芯片。微阵列应该有非常低的背景，这是一个幅度低于最弱的tRNA的探头。高的背景通常是由于在洗涤步骤中的问题。这通常是固定的准备新鲜的清洗解决方案，并彻底清洗所有设备和管道，以去除残留和SDS沉淀。
| 步骤 | 详情 |
| O型环空调 | 75℃，2分钟 |
| 介绍样本 | 60℃ |
| 变性样品 | 90℃，5分钟 |
| 杂交 | 60℃，16H |
| 洗1 | 50℃，流量10秒按住20秒 |
| 洗2 | 42℃，流量10秒按住20秒 |
| 洗3 | 42℃，流量10秒按住20秒 |
表1：杂交协议
Discussion
我们提出了一个方法，同时确定在基因组范围内的所有tRNA的收费水平相对。这里介绍的协议进行了优化， 为 S. 酵母 ，它也被成功地用来衡量在大肠杆菌 tRNA的充电配置文件大肠杆菌和人类细胞培养。它可以修改，以适应任何生物体与已知的基因组序列（允许所有的tRNA基因的注释），只要可以得到总收取的tRNA。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
酵母泛实验室工作是由一个从日本味之素公司，日本和美国国立卫生培训资助T32GM007183 - 33研究院授予。我们感谢酵母项目的长期合作在美国印第安纳大学医学院的罗纳德WEK博士。我们也感谢金佰利Dittmar博士充电芯片的方法开发的tRNA。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microspin G-25 columns | GE Healthcare | 25-5325-01 | |
| E. coli tRNAPhe | Sigma-Aldrich | R3143 | |
| E. coli tRNATyr | Sigma-Aldrich | R0258 | |
| E. coli tRNALys | Sigma-Aldrich | R6018 | |
| E. coli aminoacyl-tRNA synthetases | Sigma-Aldrich | A3646 | |
| T4 DNA ligase | USB Corp., Affymetrix | 70042X | |
| PerfectHyb Plus | Sigma-Aldrich | H-7033 | |
| Hyb4 station | Digilab | ||
| GenePix 4000B scanner | Axon instruments | ||
| GenePix 6.0 | Axon instruments |
References
- Zaborske, J. M. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).
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