הגנום כולו ניתוח (טעינה) רמות Aminoacylation של tRNA שימוש microarrays

Summary

אנו מתארים שיטה לניתוח microarray לקבוע רמות aminoacylation היחסי של כל tRNAs מ

Abstract

aminoacylation tRNA, או טעינה, רמות יכול לשנות במהירות בתוך תא בתגובה הסביבה [1]. שינויים tRNA לחייב רמות בתאים פרוקריוטים וגם הן אוקריוטים להוביל תקנה translational המהווה מנגנון הסלולר הגדולות של תגובת הלחץ. דוגמאות מוכרות הן תגובה מחמירים

Protocol

חלק 1: בידוד מוחלט של tRNA טעונים

1. גלולה תאים בצנטריפוגה ליד השולחן RFC 2000 במשך 5 דקות. המקבילה של 1 OD ₆₀₀ של תאים צריך לייצר לפחות 1μg של רנ"א סך מינימלי של 30 מיקרוגרם מומלץ ההליך.
2. תאים Resuspend בפתרון חיץ תמוגה המורכב מ 0.3 שנאגרו Na ^+-אצטט (pH 4.5) ו 10 mM EDTA. וורטקס עם נפח שווה של Na ^+-אצטט רווי פנול / כלורופורם (pH 4.5) שלוש פעמים כל אחד במשך 30 s. הקפד תמיד לשמור על דגימות קרח בין vortexing. אצטט שנאגרו ניתן להכין מ NaOAC ו HOAc בעוד אצטט רווי פנול / כלורופורם יכול להיות מוכן על ידי ערבוב 1 חלק 5 מ שנאגרו אצטט (pH 4.5) עם 9 חלקים פנול / כלורופורם.
   הערה: סך בידוד RNA מתבצעת בתנאים חומציים במקצת על קרח, כדי למנוע deacylation של tRNA טעונים.
3. צנטריפוגה ב 18,600 RFC במשך 15 דקות 4 ° C. הסירו את השכבה המימית ולבצע מיצוי נוסף אצטט רווי פנול / כלורופורם.
4. לאחר החילוץ second לזרז את הרנ"א על ​​ידי הוספת כמויות 2.7x של אתנול centrifuging ב 18,600 RFC במשך 30 דקות ב 4 ° C.
5. Resuspend כדורי רנ"א פתרון חיץ תמוגה ולאחר מכן להאיץ עם אתנול בפעם השנייה.
6. לבסוף, resuspend רנ"א בתמיסה המכילה 10 אצטט mM שנאגרו (pH 4.5) ו 1 mM EDTA לטיפול הבאים. המדגם יכול להיות מאוחסן ביציבות כשבועיים ב -80 ° C. אחסון ארוך יותר אינו מומלץ כמו כמה tRNA טעונים יתחיל deacylate.

חלק 2: הכנת תקנים tRNA

1. מחממים E. coli סטנדרטים tRNA ב מיקרומטר 10.5-85 ° C ב-pH 45 טריס-Cl mM 7.5 במשך 2 דקות. קחו את הצינור החוצה ולהשאיר בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
2. הוסף MgCl ₂ לריכוז סופי של 20 מ"מ ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
3. מוסיפים את תערובת התגובה synthetase כך התגובה הסופי מכיל 5 מיקרומטר tRNA, 60 מ"מ טריס-HCl (pH 7.5), 12.5 מ"מ MgCl _2, 10 mM KCl, 3 מ"מ dithiothreitol, 1.5 mM ATP, 1 mM spermine, 1 מ"מ בהתאמה חומצת אמינו, ו - 4.2 יחידות / ה μl aminoacyl-tRNA coli synthetase לערבב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
4. הוסף נפח שווה של אצטט M 0.5 שנאגרו (pH 4.5) ותמצית עם אצטט רווי פנול / CHCl ₃ ב-pH 4.5.
5. לזרז את הסטנדרטים tRNA עם כרכים 2.7x של אתנול centrifuging ב 18,600 RFC במשך 30 דקות 4 ° C.
6. Resuspend את הסטנדרטים של אצטט 50 מ"מ שנאגרו (pH 4.5) עם 1 mM EDTA ולאחסן ב -80 ° C עד חודש אחד.

חלק 3: Cy3/Cy5 תיוג של tRNA

1. למדגם tRNA טעונים דגירה RNA סך בריכוז של 0.1 מיקרוגרם / μl עם 0.066 מיקרומטר E. כל coli tRNA תקנים (כלומר 0.67 pmole כל תקן לכל מיקרוגרם RNA סה"כ) ו 100 אצטט mM בופר (pH 4.5) בנוכחות של 50 מ"מ NaIO4 במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לשליטה המוחלטת להשתמש tRNA מדגם 50 mM NaCl במקום NaIO4. זכור לדלל את RNA רק עם פתרונות שנאגרו לשמור על הטעינה.
2. כדי להרוות את התגובה להוסיף גלוקוז 100 מ"מ ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
3. על מנת להסיר כל NaIO4 שנותרו מן המדגם לבצע חילופי חיץ באמצעות טור ספין G25. לקבלת התוצאות הטובות ביותר לאזן את העמודה הראשונה על ידי הפעלת 200 שנאגרו mM אצטט חיץ (pH 4.5) דרך זה לפני החלת מדגם שלך.
4. לזרז את המדגם על ידי הוספת אצטט שנאגרו (pH 4.5) לריכוז סופי של 133 מ"מ ו NaCl לריכוז סופי של 66 mM ו כרכים 2.7x של אתנול. לעיתים משקעים שנייה עשוי להיות נחוץ עבור דגימות חמצון. זה נחוץ רק אם גלולה נראה שונה באופן משמעותי מזו של גלולה שליטה על מדגם זהה. לדוגמה גלולה באופן משמעותי יותר או מפוזר יותר. אם המשקעים אתנול השני הוא נדרש resuspend גלולה ב 50 pH אצטט חיץ mM 4.5 ו 200 mM NaCl לפני תוספת של אתנול.
5. עבור deacylation הדגימות tRNA הם resuspended ב 50 מ"מ טריס-HCl (pH 9) וטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. התגובה מנוטרלת על ידי תוספת של נפח שווה של אצטט 50 מ"מ שנאגרו (pH 4.5) ו 100 mM NaCl. המשקע עם כרכים 2.7x של אתנול. לאחר משקעים, RNA הוא resuspended במים ב ~ 1 מיקרוגרם / μl. שניהם שולטים דגימות חמצון צריך לרוץ על ג'לים agarose כדי לבדוק את איכות RNA.
6. כדי לצרף תגים אוליגו ניאון על גבי tRNA 0.1 מיקרוגרם / μl RNA deacylated הוא מודגרות במאגר האנזים 1x, DMSO 15%, 4 מיקרומטר Cy3 או Cy5 המכילים oligonucleotides, 0.5 יחידות / μl האנזים T4 DNA, ואת exo-phosphatase שמרים (5000 יחידות / μl) בשעה 16 ° C במשך הלילה (מעל 16 שעות). Exo-phosphatase הכרחי רק עבור דגימות שהתקבלו שמרים ניתן omitteד אם פרוטוקול זה משמש E. coli או דגימות אנושיות.
7. לאחר דגימות קשירת מעורבבים עם 4 כרכים של 50 מ"מ KOAc (pH 7), 200 מ"מ KCl, ולאחר מכן שלף עם נפח שווה של כלורופורם פנול /. לאחר מיצוי שלב מימית, ההכנות RNA הם זירז עם אתנול resuspended במים כ 0.1 מיקרוגרם / μl.
8. יעילות קשירת ניתן להעריך על ידי הפעלת 5-10% של הדגימות על polyacrylamide ג'ל המכיל 12% אוריאה 7m ו דמיינו עם סורק ג'ל ניאון. ניתוח זה PAGE שימושית גם כדי לקבוע את כמות חמצון דגימות בקרה הדרושים הכלאה microarray. התוצאה קשירת טוב צריך להראות ~ 10% או יותר oligonucleotide Cy3/Cy5 המכיל להיות ligated כדי tRNA. לקבלת דוגמיות ביעילות תיוג טוב, בסך הכל 0.1-0.5 מיקרוגרם RNA לפי המדגם משמש הכלאה המערך.

חלק 4: הכלאת ניתוח microarray

1. לפני שקופיות microarray הכלאה הם מבושלים במים מזוקקים במשך 1-2 דקות להסיר oligonucleotides מאוגד.
2. Cy3/Cy5 דגימות שכותרתו משולבים עם 140 μl של חיץ הכלאה והזרע DNA סלמון לריכוז סופי של 140 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו poly (A) לריכוז סופי של 70 מיקרוגרם / מ"ל.
3. תוכנית הכלאה, (לוח 1), מנוהלת על hybridizer מערך אוטומטי. עבור עבודה tRNA, מומלץ מאוד כי מכונת הכלאה אוטומטית לשמש מאז הכלאה ידני מייצר רקע גבוה.
4. לאחר התוכנית היא להשלים באופן ידני לשטוף את השקופיות עם פתרון לשטוף 3 לפחות פעמיים על ידי בעדינות רועד צינור חרוטי 50 מ"ל במשך 3-5 דקות.
5. שקופיות יכול להיות מיובש על ידי centrifuging במהירות נמוכה, פחות מ 200 RFC, למשך 5-10 דקות. חשוב לשמור את השקופיות מתוך האור מאז החשיפה לאור לא להלבין את fluorophores.
6. לאחר השקופיות הם יבשים הם צריכים להיות סרוקים מיד עבור תוצאות אופטימליות, במידת הצורך הם יכולים להישמר במשך כמה ימים במקום חשוך ויבש בטמפרטורת החדר. ניתן לסרוק שקופיות 2-3 פעמים ללא השפלה ניכר באיכות התמונה.

חלק 5: תוצאות נציג

כאשר מבודדים כראוי המדגם הכולל RNA צריך לייצר ספקטרום מאוד נקי עם ₂₆₀ OD: OD ₂₈₀ יחס ליד 2. לא צריך להיות שום חלבון שניתן לזיהוי זיהום או פנול. מתי לרוץ על 1% agarose ג'לים, להקה חזקה tRNA יש לשים לב אפשרי עם להקות אחרות חומצות גרעין שונות בין אורגניזמים. לאחר חמצון הלהקה נקי tRNA יש לשים לב. אם מדגם ניכרת חלשה יותר מדגמים אחרים או מריחות הוא ציין, דגימות לא אמור לשמש עבור microarrays. Microarrays צריך רקע נמוך מאוד שהוא בסדר גודל נמוך יותר מאשר לחקור את tRNA החלשה. הרקע העליון הוא בדרך כלל בגלל בעיות במהלך השלבים כביסה. בדרך כלל ניתן לתקן על ידי הכנת פתרונות טרי לשטוף ביסודיות את כל הציוד כביסה צינורות להסיר SDS שיורית ו זירז.

צעד	פרטים
O-Ring מיזוג	75 ° C, 2 דקות
הציגו את המדגם	60 ° C
לפגל לדוגמא	90 ° C, 5 דקות
הכלאה	60 ° C, 16h
שטפי 1	50 ° C, 10s תזרים להחזיק שנות ה -20
לשטוף 2	42 ° C, 10s תזרים להחזיק שנות ה -20
לשטוף 3	42 ° C, 10s תזרים להחזיק שנות ה -20

טבלה 1: הכלאה פרוטוקול

Discussion

אנו מציגים שיטה בו זמנית לקבוע את רמות טעינה היחסי של כל tRNAs בקנה מידה גנומי. הפרוטוקול המובא כאן כבר אופטימיזציה עבור ס cerevisiae, והוא גם שימש בהצלחה למדוד פרופילים tRNA טעינה ב E. coli ו בתרביות תאים אנושיים. זה יכול להיות שונה כדי להכיל את כל אורגניזם עם רצפי גנום ידוע (המאפשר ביאור של כל הגנים tRNA) כל עוד tRNA טעונים בסך הכל ניתן להשיג.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microspin G-25 columns	GE Healthcare	25-5325-01
E. coli tRNAPhe	Sigma-Aldrich	R3143
E. coli tRNATyr	Sigma-Aldrich	R0258
E. coli tRNALys	Sigma-Aldrich	R6018
E. coli aminoacyl-tRNA synthetases	Sigma-Aldrich	A3646
T4 DNA ligase	USB Corp., Affymetrix	70042X
PerfectHyb Plus	Sigma-Aldrich	H-7033
Hyb4 station	Digilab
GenePix 4000B scanner	Axon instruments
GenePix 6.0	Axon instruments