Summary
हम माइक्रोएरे विश्लेषण से सभी tRNAs के रिश्तेदार aminoacylation का स्तर निर्धारित करने के लिए एक विधि का वर्णन
Abstract
tRNA aminoacylation, या चार्ज, स्तर तेजी से [1] पर्यावरण के जवाब में एक कोशिका के भीतर बदल सकते हैं. TRNA दोनों prokaryotic और यूकेरियोटिक कोशिकाओं में चार्ज स्तर में परिवर्तन translational विनियमन है जो तनाव प्रतिक्रिया का एक प्रमुख सेलुलर तंत्र है सीसा. परिचित उदाहरण कड़े प्रतिक्रिया में हैं
Protocol
भाग 1: कुल चार्ज tRNA के अलगाव
- 5 मिनट के लिए आरएफसी 2000 में एक tabletop अपकेंद्रित्र में गोली कोशिकाओं. 1 की कोशिकाओं के 600 आयुध डिपो बराबर कुल शाही सेना के कम से कम 1μg उत्पादन और 30 μg की एक न्यूनतम प्रक्रिया के लिए सिफारिश की है चाहिए.
- Lysis बफर समाधान में Resuspend कोशिकाओं 0.3 एम के निर्वाचकगण (4.5 पीएच) + एसीटेट और 10 मिमी EDTA ना buffered. 30 एस के लिए एक ना संतृप्त + एसीटेट phenol क्लोरोफॉर्म / (4.5 पीएच) तीन बार प्रत्येक के बराबर मात्रा के साथ भंवर हमेशा बर्फ पर vortexing बीच नमूने रखने के लिए सुनिश्चित करें. Buffered एसीटेट NaOAC और HOAc से तैयार किया जा सकता है जबकि एसीटेट संतृप्त phenol / क्लोरोफॉर्म 9 / phenol क्लोरोफॉर्म भागों के साथ 1 5 भाग एम (4.5 पीएच) एसीटेट buffered मिश्रण से तैयार किया जा सकता है है.
नोट: कुल शाही सेना अलगाव हल्का अम्लीय शर्तों के तहत और बर्फ पर बाहर किया जाता है के लिए चार्ज tRNA के deacylation से बचने. - 4 में 15 मिनट के लिए 18,600 आरएफसी में अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस जलीय परत निकालें और दूसरे एसीटेट संतृप्त phenol / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण प्रदर्शन.
- दूसरा निष्कर्षण के बाद इथेनॉल के 2.7x मात्रा जोड़ने और 30 मिनट के लिए 18,600 आरएफसी में 4 डिग्री सेल्सियस centrifuging द्वारा शाही सेना वेग
- Resuspend lysis बफर समाधान में और फिर शाही सेना छर्रों इथेनॉल के साथ दूसरी बार वेग.
- अंत में, एक 10 मिमी बफर (4.5 पीएच) एसीटेट और बाद में इलाज के लिए 1 मिमी EDTA युक्त समाधान में शाही सेना resuspend. नमूना stably के बारे में दो सप्ताह के लिए -80 ° सी में संग्रहीत किया जा सकता है. अब भंडारण के रूप में कुछ चार्ज tRNA deacylate शुरू कर देंगे करने के लिए अनुशंसित नहीं है.
भाग 2: tRNA मानक की तैयारी
- हीट ई. कोलाई tRNA मानकों 10.5 सुक्ष्ममापी पर 85 डिग्री सेल्सियस में 2 मिनट के लिए 45 मिमी Tris-सीएल 7.5 पीएच. ट्यूब बाहर ले जाओ और 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें.
- 37 पर एक 20 मिमी और सेते के अंतिम एकाग्रता ° 5 मिनट के लिए सी 2 MgCl जोड़ें.
- Synthetase प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें ताकि अंतिम प्रतिक्रिया 5 सुक्ष्ममापी tRNA, 60 मिमी Tris एचसीएल (7.5 पीएच), 12.5 मिमी MgCl 2, 10 मिमी KCl, 3 मिमी dithiothreitol, 1.5 मिमी एटीपी, 1 मिमी spermine, 1 मिमी के संबंधित होता है अमीनो एसिड, और 4.2 इकाइयों / μl ई. कोलाई aminoacyl-tRNA synthetase मिश्रण. 37 में सेते ° C 15 मिनट के लिए.
- 0.5 एम बफर एसीटेट (4.5 पीएच) के एक समान मात्रा में जोड़ें और पीएच 4.5 पर एसीटेट संतृप्त / phenol CHCl 3 के साथ निकालने .
- 4 में 30 मिनट के लिए 18,600 आरएफसी डिग्री सेल्सियस पर और इथेनॉल centrifuging के 2.7x संस्करणों के साथ tRNA मानकों वेग
- 1 मिमी EDTA और दुकान -80 पर ° सी के साथ 50 मिमी बफर (4.5 पीएच) के लिए एक महीने के लिए लिए एसीटेट में मानकों Resuspend.
भाग 3: tRNA के Cy3/Cy5 लेबलिंग
- चार्ज tRNA नमूना के लिए 0.066 सुक्ष्ममापी के साथ 0.1 μg / μl के एक एकाग्रता में कुल शाही सेना प्रत्येक ई. सेते कोलाई tRNA (यानी 0.67 pmole कुल शाही सेना μg प्रति प्रत्येक मानक) मानकों और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 50 मिमी NaIO4 की उपस्थिति में 100 मिमी बफर एसीटेट (4.5 पीएच) . कुल tRNA नमूना उपयोग 50 मिमी NaIO4 की जगह में NaCl नियंत्रण के लिए. बफर करने के लिए चार्ज के संरक्षण समाधान के साथ ही शाही सेना को कमजोर करने के लिए याद रखें.
- प्रतिक्रिया बुझाने के लिए 100 मिमी के लिए ग्लूकोज जोड़ने और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- नमूना आदेश में से किसी भी शेष NaIO4 हटाने के लिए एक बफर एक G25 स्पिन स्तंभ का उपयोग विनिमय प्रदर्शन. सर्वोत्तम परिणामों के लिए कॉलम के माध्यम से इसे 200 मिमी एसीटेट बफर बफर (4.5 पीएच) पहले चलाने के लिए अपने नमूना आवेदन के द्वारा संतुलित है.
- 133 मिमी और NaCl के अंतिम एकाग्रता के लिए 66 मिमी और 2.7x मात्रा में इथेनॉल के अंतिम एकाग्रता के लिए बफर एसीटेट (4.5 पीएच) जोड़कर नमूना वेग. कभी कभी एक दूसरे वर्षण ऑक्सीकरण नमूने के लिए आवश्यक हो सकता है. यह आवश्यक है सिर्फ अगर गोली एक ही नमूने के नियंत्रण गोली से काफी अलग लग रहा है. एक काफी बड़ा या अधिक फैलाना गोली उदाहरण के लिए. यदि एक दूसरे इथेनॉल वर्षा 50 मिमी एसीटेट बफर 4.5 पीएच और 200 मिमी इथेनॉल के अलावा पहले NaCl में resuspend गोली की आवश्यकता है.
- TRNA नमूने deacylation के लिए 50 मिमी Tris - एचसीएल में resuspended हैं (9 पीएच) और 30 मिनट के लिए 37 ° C पर incubated. प्रतिक्रिया 50 मिमी बफर (4.5 पीएच) एसीटेट और 100 मिमी NaCl के एक बराबर मात्रा के अलावा द्वारा neutralized है. 2.7x मात्रा में इथेनॉल के साथ वेग. वर्षा के बाद, शाही सेना पानी में ~ / μg μl 1 में resuspended है. शाही सेना गुणवत्ता की जांच करने के लिए दोनों नियंत्रण और ऑक्सीकरण नमूने agarose जैल पर चलने होना चाहिए.
- 1x ligase बफर, DMSO के 15%, 4 सुक्ष्ममापी Cy3 या Cy5 युक्त oligonucleotides, 0.5 इकाइयों / μl टी -4 डीएनए ligase में tRNA 0.1 / μg μl deacylated शाही सेना पर फ्लोरोसेंट oligo टैग देते incubated है, और खमीर exo-फॉस्फेट (5,000 / μl 16 पर यूनिट) डिग्री सेल्सियस रातोंरात (16 से अधिक घंटे). exo-फॉस्फेट केवल खमीर से प्राप्त नमूनों के लिए आवश्यक है और omitte किया जा सकता है हैघ अगर इस प्रोटोकॉल ई. के लिए प्रयोग किया जाता है कोलाई या मानव नमूनों.
- बाद ligation के नमूने 50 मिमी (7 पीएच) KOAc, 200 मिमी KCl, और तब / phenol क्लोरोफॉर्म के एक बराबर मात्रा के साथ निकाली 4 संस्करणों के साथ मिश्रित कर रहे हैं. जलीय चरण की निकासी के बाद, इथेनॉल के साथ शाही सेना की तैयारी उपजी हैं और पानी में लगभग μg μl / 0.1 resuspended.
- Ligation दक्षता 12% polyacrylamide 7m यूरिया युक्त जैल पर नमूनों की 5-10% चलाकर मूल्यांकन किया जा सकता है और एक फ्लोरोसेंट जेल स्कैनर के साथ कल्पना. इस पृष्ठ विश्लेषण भी ऑक्सीकरण और नियंत्रण नमूने माइक्रोएरे संकरण के लिए आवश्यक राशि का निर्धारण करने के लिए उपयोगी है. एक अच्छा ligation के परिणाम दिखाने चाहिए ~ 10% या Cy3/Cy5 युक्त oligonucleotide के tRNA के लिए और अधिक ligated जा रहा है. अच्छा लेबलिंग दक्षता के साथ नमूने के लिए, नमूना प्रति 0.1-0.5 μg कुल शाही सेना संकरण सरणी के लिए प्रयोग किया जाता है.
भाग 4: और माइक्रोएरे के संकरण और विश्लेषण
- संकरण माइक्रोएरे स्लाइड्स के लिए पहले आसुत जल में 1-2 करने के लिए अनबाउंड oligonucleotides हटाने मिनट के लिए उबला हुआ.
- Cy3/Cy5 लेबल नमूने संकरण बफर और 140 μg / एमएल और 70 μg / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए पाली (ए) के अंतिम एकाग्रता सामन शुक्राणु डीएनए के 140 μl के साथ संयुक्त कर रहे हैं.
- संकरण कार्यक्रम, (तालिका 1), एक स्वचालित सरणी hybridizer पर चलाया जाता है. TRNA काम के लिए, यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि एक स्वचालित संकरण मशीन पुस्तिका संकरण के बाद से उच्च पृष्ठभूमि उत्पादन में इस्तेमाल किया जा.
- कार्यक्रम के बाद पूरा हो गया है मैन्युअल रूप से धीरे से 3-5 मिनट के लिए एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में झटकों से धो 3 समाधान के साथ स्लाइड्स कम से कम दो बार धोने.
- स्लाइड्स पर 5-10 मिनट के लिए एक कम गति, कम से कम 200 आरएफसी, centrifuging द्वारा सुखाया जा सकता है है. स्लाइड्स बाहर रखने के प्रकाश के संपर्क fluorophores ब्लीच के बाद से प्रकाश की यह महत्वपूर्ण है.
- बाद स्लाइड्स सूख रहे हैं वे इष्टतम परिणामों के लिए तुरंत स्कैन चाहिए, यदि आवश्यक हो तो वे कमरे के तापमान पर एक सूखी अंधेरे जगह में कई दिनों के लिए बचाया जा सकता है है. स्लाइड छवि गुणवत्ता में उल्लेखनीय गिरावट के बिना 2-3 बार स्कैन कर सकते हैं.
भाग 5: प्रतिनिधि परिणाम
आयुध डिपो के पास 280 अनुपात 2: जब ठीक से पृथक कुल शाही सेना नमूना एक आयुध डिपो 260 के साथ एक बहुत साफ स्पेक्ट्रम का उत्पादन करना चाहिए. वहाँ कोई detectable प्रोटीन या phenol के संदूषण होना चाहिए. जब 1% agarose जैल पर चलने, एक मजबूत tRNA बैंड अन्य संभावित न्यूक्लिक एसिड जीवों के बीच अलग बैंड के साथ मनाया जाना चाहिए. ऑक्सीकरण के बाद एक स्वच्छ tRNA बैंड मनाया जाना चाहिए. यदि एक नमूना अन्य नमूने या smearing मनाया जाता है की तुलना में काफ़ी कमजोर है, नमूने के प्रोटीन के लिए नहीं इस्तेमाल किया जाना चाहिए. प्रोटीन बहुत कम पृष्ठभूमि है जो कमजोर tRNA जांच की तुलना में कम परिमाण के एक आदेश है होना चाहिए. उच्च पृष्ठभूमि आमतौर पर वाशिंग चरणों के दौरान समस्याओं के कारण है. यह आमतौर पर ताजा धोने के समाधान की तैयारी करने और अच्छी तरह से सभी उपकरणों और टयूबिंग अवशिष्ट और उपजी एसडीएस हटाने धोने द्वारा तय किया जा सकता है.
| चरण | विवरण |
| हे - अंगूठी कंडीशनिंग | 75 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट |
| नमूना का परिचय | 60 डिग्री सेंटीग्रेड |
| Denature नमूना | 90 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट |
| वर्ण - संकर करना | 60 डिग्री सेंटीग्रेड, 16h |
| 1 धो | 50 डिग्री सेल्सियस, प्रवाह 10s 20s पकड़ |
| 2 धो | 42 डिग्री सेल्सियस, प्रवाह 10s 20s पकड़ |
| 3 धो | 42 डिग्री सेल्सियस, प्रवाह 10s 20s पकड़ |
तालिका 1: संकरण प्रोटोकॉल
Discussion
हम एक साथ जीनोमिक पैमाने पर सभी tRNAs के सापेक्ष चार्ज स्तर निर्धारित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एस के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है cerevisiae, और यह भी सफलतापूर्वक किया गया है ई. में tRNA चार्ज प्रोफाइल को मापने के लिए इस्तेमाल किया कोलाई और मानव सेल संस्कृतियों. यह जाना जाता जीनोम अनुक्रम (सभी tRNA जीन की एनोटेशन के लिए अनुमति देता है) के रूप में लंबे समय के साथ किसी भी जीव को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है के रूप में कुल चार्ज tRNA प्राप्त किया जा सकता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
पान प्रयोगशाला में खमीर काम Ajinomoto, इंक जापान और स्वास्थ्य प्रशिक्षण अनुदान T32GM007183 33-के राष्ट्रीय संस्थानों से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था. हम खमीर परियोजनाओं पर दीर्घकालिक सहयोग के लिए इंडियाना विश्वविद्यालय के मेडिसिन स्कूल में डॉ. रोनाल्ड Wek धन्यवाद. हम भी डा. Kimberly Dittmar माइक्रोएरे विधि चार्ज tRNA के विकास के लिए धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microspin G-25 columns | GE Healthcare | 25-5325-01 | |
| E. coli tRNAPhe | Sigma-Aldrich | R3143 | |
| E. coli tRNATyr | Sigma-Aldrich | R0258 | |
| E. coli tRNALys | Sigma-Aldrich | R6018 | |
| E. coli aminoacyl-tRNA synthetases | Sigma-Aldrich | A3646 | |
| T4 DNA ligase | USB Corp., Affymetrix | 70042X | |
| PerfectHyb Plus | Sigma-Aldrich | H-7033 | |
| Hyb4 station | Digilab | ||
| GenePix 4000B scanner | Axon instruments | ||
| GenePix 6.0 | Axon instruments |
References
- Zaborske, J. M. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).
- Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids. Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).
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