Summary
Se describe un método para el análisis de microarrays para determinar los niveles relativos de todos los tRNAs aminoacilación de
Abstract
aminoacilación del tRNA, o de carga, los niveles pueden cambiar con rapidez dentro de una célula en respuesta al medio ambiente [1]. Cambios en el tRNA niveles de carga tanto en las células procariotas y eucariotas llevar a la regulación de traducción que es un importante mecanismo de respuesta al estrés celular. Ejemplos conocidos son la respuesta estrictas en
Protocol
Parte 1: Aislamiento de tRNA total con cargo
- Pellet células en una centrífuga de mesa en 2000 RFC durante 5 minutos. El equivalente de 1 600 OD de las células deben producir por lo menos 1 g de ARN total y un mínimo de 30 mg se recomienda para el procedimiento.
- Resuspender las células en una solución tampón de lisis que consiste en 0,3 M tampón Na +-acetato (pH 4,5) y 10 mM EDTA. Vortex con un volumen igual de Na +-saturada de acetato de fenol / cloroformo (pH 4,5) tres veces cada uno por 30 s. Asegúrese de mantener siempre en hielo entre los vórtices. Acetato de buffer puede ser preparado a partir de NaOAc y HOAc mientras acetato saturado con fenol / cloroformo se puede preparar mezclando 1 parte 5 M tampón acetato (pH 4,5) con 9 partes de fenol / cloroformo.
Nota: el total aislamiento de ARN se lleva a cabo bajo condiciones ligeramente ácidas y hielo para evitar la desacilación de tRNA cargos. - Centrifugar a 18.600 RFC durante 15 minutos a 4 ° C. Eliminar la capa acuosa y realizar otra extracción saturada de acetato de fenol / cloroformo.
- Después de la segunda extracción precipitar el ARN mediante la adición de volúmenes de 2.7x de etanol y centrifugación a 18.600 RFC durante 30 minutos a 4 ° C.
- Resuspender pellets de ARN en solución tampón de lisis y precipitado con etanol por segunda vez.
- Por último, volver a suspender el ARN en una solución que contenía 10 mM de acetato tamponado (pH 4,5) y 1 mM EDTA para su posterior tratamiento. La muestra puede ser almacenada de forma estable a -80 ° C durante unas dos semanas. Un almacenamiento más prolongado, no se recomienda ya que algunos tRNA cargado comenzará a deacylate.
Parte 2: Preparación de las normas tRNA
- Calor E. coli normas tRNA en 10,5 M a 85 ° C en 45 mM Tris-Cl pH 7,5 durante 2 minutos. Tome el tubo y dejar a temperatura ambiente durante 3 minutos.
- Añadir MgCl2 a una concentración final de 20 mM y se incuba a 37 ° C durante 5 minutos.
- Añadir la mezcla de reacción sintetasa por lo que la reacción final contiene 5 M tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mM de MgCl2, 10 mM KCl, 3 mM ditiotreitol, 1,5 mM de ATP, 1 mM espermina, 1 mM de los respectivos aminoácidos, y las unidades de 4,2 / l E. coli aminoacil-tRNA-sintetasa mezcla. Se incuba a 37 ° C durante 15 minutos.
- Añadir un volumen equivalente de 0,5 M de acetato de buffer (pH 4.5) y extraer con acetato de fenol saturado / CHCl 3 a pH 4,5.
- Precipitar las normas tRNA con volúmenes de 2.7x de etanol y centrifugación a 18.600 RFC durante 30 minutos a 4 ° C.
- Volver a suspender las normas en acetato 50 mM tampón (pH 4,5) con 1 mM EDTA y almacenar a -80 ° C durante un máximo de un mes.
Parte 3: Cy3/Cy5 etiquetado de los tRNA
- Para la muestra se incuba tRNA cargado ARN total a una concentración de 0,1 mg / ml con 0,066 M de cada E. coli tRNA normas (es decir, 0,67 pmoles de cada estándar por g de ARN total) y 100 mM de acetato tamponado (pH 4,5) en presencia de 50 mM NaIO4 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para el control del uso total de la muestra tRNA 50 mM de NaCl en lugar de NaIO4. Recuerde que para diluir el ARN sólo con las soluciones tampón para conservar la carga.
- Para detener la reacción añadir glucosa a 100 mM e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Con el fin de eliminar cualquier resto de NaIO4 de la muestra de realizar un intercambio de buffer usando una columna de centrifugación G25. Para obtener los mejores resultados de la primera columna se equilibre mediante la ejecución de 200 mM tampón tampón de acetato (pH 4,5) a través de él antes de aplicar la muestra.
- Precipitar la muestra mediante la adición de acetato de buffer (pH 4.5) a una concentración final de 133 mM y NaCl a una concentración final de 66 mM y el volumen de 2.7x de etanol. De vez en cuando una segunda precipitación puede ser necesaria para las muestras oxidadas. Esto es necesario sólo si la bolita parece significativamente diferente de la pastilla de control de la misma muestra. Por ejemplo, una significativamente mayor o más difusa de pellets. Si una segunda precipitación con etanol es necesario volver a suspender el pellet en 50 mM pH 4,5 y acetato de 200 mM NaCl antes de la adición de etanol.
- Para desacilación las muestras tRNA se resuspendió en 50 mM Tris-HCl (pH 9) y se incuba a 37 ° C durante 30 min. La reacción es neutralizada por la adición de un volumen igual de acetato 50 mM buffer (pH 4.5) y 100 mM NaCl. Precipitado con volúmenes de 2.7x de etanol. Después de la precipitación, el ARN se vuelve a suspender en agua a aproximadamente 1 mg / l. Tanto el control y las muestras oxidadas se debe ejecutar en geles de agarosa para comprobar la calidad del ARN.
- Para colocar etiquetas fluorescentes oligo en el tRNA 0,1 mg / l desacilada ARN se incuba en 1x tampón ligasa, el 15% DMSO, 4 M-Cy3 o Cy5 que contienen oligonucleótidos, unidades de 0,5 / l de ADN ligasa T4, y la levadura de exo-fosfatasa (5.000 unidades / l) a 16 ° C durante la noche (más de 16 h). La exo-fosfatasa es necesaria sólo para las muestras obtenidas de la levadura y se puede omitted si se utiliza este protocolo para E. coli o muestras humanas.
- Después de la ligadura de las muestras se mezclan con 4 volúmenes de 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM KCl, y se extrae con un volumen igual de fenol / cloroformo. Tras la extracción de la fase acuosa, preparaciones de ARN se precipitó con etanol y se resuspendió en agua a aproximadamente 0,1 mg / l.
- La eficiencia de la ligadura puede ser evaluado mediante la ejecución de un 5-10% de las muestras en geles de poliacrilamida al 12% con urea 7M y se visualizaron con un escáner de gel fluorescente. Este análisis de página es también útil para determinar la cantidad de oxidación y las muestras de control necesarias para la hibridación de microarrays. El resultado debería mostrar una buena ligadura alrededor del 10% o más de los oligonucleótidos que contienen Cy3/Cy5 se ligó con el tRNA. Para muestras con el etiquetado de eficiencia bueno, 0,1-0,5 mg de ARN total por muestra se utiliza para la hibridación de la matriz.
Parte 4: Hibridación y análisis de los microarrays
- Antes de diapositivas de microarrays de hibridación se hierven en agua destilada durante 1-2 minutos para eliminar los oligonucleótidos no consolidados.
- Cy3/Cy5 muestras etiquetadas se combinan con 140 l de tampón de hibridación de ADN de esperma de salmón a una concentración final de 140 mg / ml y de poli (A) a una concentración final de 70 microgramos / ml.
- Un programa de hibridación, (tabla 1), se ejecuta en una serie de híbridos automática. Para el trabajo de tRNA, es altamente recomendable que una máquina automática de la hibridación se utiliza desde la hibridación manual de fabrica de fondo elevado.
- Después de que el programa se completa manualmente este lavado con solución de lavado 3 por lo menos dos veces agitando suavemente en un tubo cónico de 50 ml durante 3-5 minutos.
- Las diapositivas se pueden secar por centrifugación a baja velocidad, a menos de 200 RFC, durante 5-10 minutos. Es importante mantener las diapositivas de la luz ya la exposición a la luz de lejía los fluoróforos.
- Después de las diapositivas se secan que deben analizarse de inmediato para obtener resultados óptimos, si es necesario se pueden guardar por varios días en un lugar oscuro y seco a temperatura ambiente. Las diapositivas se pueden escanear 2-3 veces sin degradación perceptible en la calidad de imagen.
Parte 5: Resultados de Representante
Cuando se aíslan adecuadamente el total de la muestra de ARN debe producir un espectro muy limpio, con un 260 OD: OD 280 ratio de cerca de 2. No debe haber ninguna proteína detectable o la contaminación de fenol. Cuando se ejecuta en un 1% en geles de agarosa, una fuerte banda de tRNA deben ser observados con otros posibles bandas de ácidos nucleicos que oscilan entre los organismos. Después de la oxidación de una banda limpia tRNA deben ser observados. Si una muestra es notablemente más débil que otras muestras o manchas que se observa, las muestras no deben ser utilizados para microarrays. Microarrays debe tener de fondo muy bajo, lo que es un orden de magnitud menor que el más débil de la sonda tRNA. De fondo de alta suele ser debido a problemas durante las etapas de lavado. Esto generalmente se puede arreglar mediante la elaboración de nuevas soluciones de lavado y cuidado de lavar todo el equipo y la tubería para eliminar los restos y se precipitó SDS.
| Paso | Detalles |
| O-ring acondicionado | 75 ° C, 2 min |
| Introducir la muestra | 60 ° C |
| Desnaturalizar la muestra | 90 ° C, 5 min |
| Hibridación | 60 ° C, 16h |
| Lavado 1 | 50 ° C, 10 segundos de flujo de celebrar 20 años |
| Lavado 2 | 42 ° C, 10 segundos de flujo de celebrar 20 años |
| Lavar 3 | 42 ° C, 10 segundos de flujo de celebrar 20 años |
Tabla 1: La hibridación de protocolo
Discussion
Se presenta un método para determinar simultáneamente los niveles relativos de carga de todos los tRNAs en la escala genómica. El protocolo que aquí se presenta ha sido optimizado para S. cerevisiae, y también se ha utilizado con éxito para medir los perfiles de tRNA de carga en E. coli y cultivos de células humanas. Puede ser modificado para adaptarse a cualquier organismo con las secuencias genéticas conocidas (que permite la anotación de todos los genes tRNA), siempre y cuando tRNA total con cargo puede ser obtenida.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El trabajo de la levadura en el laboratorio de Pan fue financiado por una beca de Ajinomoto Japan, Inc. y los Institutos Nacionales de Salud de Formación subvención T32GM007183-33. Agradecemos al Dr. Ronald Wek en la Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana para la colaboración a largo plazo en los proyectos de la levadura. También agradecemos al Dr. Kimberly Dittmar para el desarrollo del método de carga tRNA microarrays.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microspin G-25 columns | GE Healthcare | 25-5325-01 | |
| E. coli tRNAPhe | Sigma-Aldrich | R3143 | |
| E. coli tRNATyr | Sigma-Aldrich | R0258 | |
| E. coli tRNALys | Sigma-Aldrich | R6018 | |
| E. coli aminoacyl-tRNA synthetases | Sigma-Aldrich | A3646 | |
| T4 DNA ligase | USB Corp., Affymetrix | 70042X | |
| PerfectHyb Plus | Sigma-Aldrich | H-7033 | |
| Hyb4 station | Digilab | ||
| GenePix 4000B scanner | Axon instruments | ||
| GenePix 6.0 | Axon instruments |
References
- Zaborske, J. M. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).
- Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids. Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).
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