Summary
우리는 모든 tRNAs의 상대 aminoacylation 수준을 결정하기 위해 microarray 분석을위한 방법을 설명
Abstract
tRNA의 aminoacylation, 또는 충전, 레벨 빠르게 환경 [1]에 대한 응답으로 세포 내에서 변경할 수 있습니다. prokaryotic와 진핵 세포 모두에서 수준을 충전 tRNA의 변화는 스트레스 반응의 주요 세포 메커니즘입니다 translational 규제로 이어집니다. 친숙한 예제는 엄격한 응답에
Protocol
1 부 : 총 청구 tRNA의 분리
- 오분 2000 RFC에서 탁상 원심 분리기의 펠렛 세포. 세포의 OD 600 1 동등 총 RNA의 적어도 1μg을 생산해야 30 μg 최소가 절차를 권장합니다.
- 0.3 M 구성된 용해 버퍼 용액에 Resuspend 세포가 + - 아세테이트 (산도 4.5) 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 나 버퍼. 30 S. 세 번 각 (산도 4.5) 나 + - 아세테이트 - 포화 페놀 / 클로로포름의 동일한 볼륨 소용돌이 항상 vortexing 사이의 얼음에 샘플을 보관해야합니다. 아세트산은 페놀 / 클로로포름은 클로로포름 / 페놀 구 부분 M은 아세테이트를 버퍼 한 부분 5 (산도 4.5) 혼합하여 준비할 수 포화 동안 버퍼 아세테이트는 NaOAC와 HOAc에서 준비하실 수 있습니다.
참고 : 총 RNA의 분리가 부과 tRNA의 deacylation을 피하기 위해 약간 산성 조건 하에서 얼음에 수행됩니다. - 4 15 분 동안 18,600 RFC에서 원심 분리기 ° C. 수성 층을 제거하고 다른 아세테이트 - 포화 페놀 / 클로로포름 추출을 수행합니다.
- 두 번째 추출 에탄올의 2.7x 볼륨을 추가하고 4 30 분 18,600 RFC에 centrifuging ° C.를하여 RNA를 침전 후
- 용해 버퍼 용액에 다음 Resuspend RNA 알약은 에탄올과 함께 두 번째 시간을 촉진.
- 마지막으로, 10 MM 버퍼 아세테이트 (산도 4.5) 및 후속 치료를 위해 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 솔루션에서 RNA를 resuspend. 예제는 안정에 대한 두 주 동안 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. 일부 청구 tRNA가 deacylate 시작되므로 더 이상 보관하지 않는 것이 좋습니다.
2 부 : tRNA 표준의 작성
- 히트 E. 10.5 μm의에서 85 대장균 tRNA 표준 ° C 2 분 45 MM 트리스 - CL의 산도 7.5 인치 튜브를 타고 3 분 상온에서 둡니다.
- 37 20 MM과 부화의 최종 농도 ° 5 분 C로 MgCl 2를 추가합니다.
- 최종 반응 5 μm의 tRNA, 60 MM 트리스 - HCL (산도 7.5), 12.5 MM MgCl 2, 10 MM KCl, 3 MM dithiothreitol, 1.5 MM ATP, 1 ㎜ spermine, 각각의 1 ㎜를 포함하므로 synthetase 반응 믹스 추가 아미노산, 그리고 4.2 단위 / μl E. 대장균 aminoacyl - tRNA synthetase의 믹스. 37 품어 ° C를 15 분.
- 0.5 M 버퍼 아세테이트 (산도 4.5)의 동일한 볼륨을 추가하고 산도 4.5에서 아세테이트 - 포화 CHCl / 페놀 3 압축을 풉니다.
- 4 30 분 18,600 RFC ° C.에서 에탄올과 centrifuging의 2.7x 볼륨과 tRNA 기준을 촉진
- 최대 1 개월에 대해 -80 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 저장 ° C와 50 MM 버퍼 아세테이트 (산도 4.5)의 기준에 Resuspend.
파트 3 : tRNA의 Cy3/Cy5 라벨링
- 청구 tRNA 샘플 각 E.는 0.066 μm의와 0.1 μg / μl의 농도에서 총 RNA를 품어 대장균 tRNA 기준 (예 : 0.67 pmole μg 총 RNA마다 각각의 표준)과 실온에서 30 분 50 MM NaIO4의 존재 100 MM 버퍼 아세테이트 (산도 4.5). 컨트롤 전체 tRNA 샘플 사용 NaIO4 대신에 NaCl 50 MM하십시오. 전용 충전 보존하기 위해 버퍼 솔루션 RNA를 희석 것을 잊지 마십시오.
- 반응을 담금질하기 위해서는 100 mm까지 포도당을 추가하고 5 분 실온에서 알을 품다.
- 샘플로부터 남아 NaIO4를 제거 G25의 스핀 컬럼을 사용하여 버퍼 교환을 수행하기 위해서는. 최상의 결과를 귀하의 샘플을 적용하기 전에 그것을 통해 200 MM 버퍼 아세테이트 버퍼 (산도 4.5)를 실행하여 먼저 열을 평형하십시오.
- 66 MM과 에탄올의 2.7x 볼륨의 최종 농도 133 MM과 NaCl의 최종 농도 버퍼 아세테이트 (산도 4.5)을 추가하여 샘플을 촉진. 때때로 두 번째 강수량은 산화 샘플에 필요한 수 있습니다. 펠렛 같은 샘플의 통제 펠렛보다 훨씬 달라 보이는 경우에만이 필요합니다. 예를 들어 훨씬 더 이상의 확산 펠릿하십시오. 두 번째 에탄올 침전은 50 MM 아세테이트 버퍼 산도 4.5과 에탄올의 추가되기 전에 NaCl 200 MM에 resuspend 펠렛을 필요한 경우.
- deacylation에 대한 tRNA 샘플은 50 MM 트리스 - HCL에 resuspended 아르 (산도 9) 30 분 37 ° C에서 incubated. 반응 50 MM 버퍼 아세테이트 (산도 4.5) 100 MM NaCl의 동일한 볼륨의 추가에 의해 무력화됩니다. 에탄올의 2.7x 볼륨 침전물. 강수량 후, RNA는 ~ 1 μg / μl에서 물에 resuspended 있습니다. 제어 및 산화 샘플 모두 RNA의 품질을 확인하는 아가로 오스의 젤에서 실행해야합니다.
- tRNA 0.1 μg / μl deacylated RNA에 형광 oligo 태그를 첨부하는 것은 1X ligase 버퍼, 15% DMSO, 4 μm의 Cy3 또는 Cy5 함유 oligonucleotides, 0.5 단위 / μl T4의 DNA ligase에 incubated, 그리고 효모 엑소 - 인산 가수 분해 효소 (5,000 16 단위 / μl) ° C 숙박 (16 이상 H). 엑소 - 인산 가수 분해 효소는 효모에서 얻은 샘플에 필요한이며 omitte 수 있습니다D이 프로토콜은 E. 사용하는 경우 대장균이나 인간의 샘플.
- 내고 샘플 / 페놀 클로로포름의 동일한 볼륨 압축을 푼 다음 50 MM KOAc (산도 7), 200 MM KCl, 그리고 4 권과 혼합 후. 수성 단계의 추출에 따라 RNA 준비는 에탄올로 시켰던하고 약 0.1 μg / μl로 물에 resuspended.
- 결합 효율은 7m 요소를 포함하는 12 % polyacrylamide의 젤의 샘플 5~10%를 실행하여 평가하고 형광 젤 스캐너와 시각하실 수 있습니다. 이 페이지 분석은 산화 및 컨트롤 샘플 microarray의 하이브리드화에 필요한 금액을 결정하는 것도 유용합니다. 좋은 내고 결과 ~ Cy3/Cy5 포함된 oligonucleotide의 10 % 이상이 tRNA에 출혈도 잡았되고 표시됩니다. 좋은 라벨 효율 샘플, 샘플 당 0.1-0.5 μg의 총 RNA는 배열 하이브 리다이 제이션에 사용됩니다.
파트 4 : Microarray의 하이브리드화 분석
- 하이브 리다이 제이션 microarray 슬라이드 전에는 언바운드 oligonucleotides를 제거하는 1~2분 위해 증류수 삶은 있습니다.
- Cy3/Cy5 라벨 샘플은 140 μg / ML 70 μg / ML의 최종 농도 폴리 (A)의 최종 농도 하이브 리다이 제이션 버퍼와 연어 정자 DNA의 140 μl와 결합됩니다.
- 하이브 리다이 제이션 프로그램 (표 1), 자동 배열 hybridizer에서 실행됩니다. tRNA 작업에, 그것은 매우 수동으로 하이브리드화 높은 배경을 생산하고 이후 자동으로 하이브리드화 시스템을 사용하는 것이 좋습니다.
- 프로그램이 완료되면 수동으로 부드럽게 3-5분에 대한 50 ML 원뿔 튜브 흔들어하여 적어도 두 번 씻으 3 솔루션과 함께 슬라이드를 씻으십시오.
- 슬라이드는 50~10분 들어, 저속 200보다 낮고, RFC에서 centrifuging에 의해 건조하실 수 있습니다. 그것은 빛에 노출 표백 fluorophores을하므로 빛의 슬라이드를 유지하는 것이 중요합니다.
- 슬라이드가 건조되면 그들은 최적의 결과를 즉시 검사해야합니다, 필요한 경우 그들은 상온에서 건조한 어두운 장소에서 몇 일 동안 저장할 수 있습니다. 슬라이드는 이미지 품질을 눈에 띄게 저하없이 2-3 시간을 스캔하실 수 있습니다.
제 5 부 : 대표 결과
니어 2 OD 280 비율이 적절히 격리하면 총 RNA 샘플은 OD 260로 매우 깨끗한 스펙트럼을 생산해야합니다. 전혀 감지 단백질이나 페놀 오염이 없어야합니다. 1퍼센트 아가로 오스 젤에서 실행하면, 강력한 tRNA 밴드는 생물 사이 변화 다른 가능한 핵산 밴드 관찰해야합니다. 산화 후 깨끗한 tRNA 밴드가 관찰해야합니다. 샘플 다른 샘플이나 번짐을 관찰보다 눈에 띄게 약한 경우, 샘플은 microarrays에 사용해서는 안됩니다. Microarrays 가장 약한 tRNA 프로브보다 낮은 크기의 순서는 매우 낮은 배경이 있어야합니다. 높은 배경은 일반적으로 세척 단계 도중 문제로 인해 발생합니다. 이것은 일반적으로 신선한 씻어 솔루션을 준비하고 철저하게 잔류하고 시켰던 SDS를 제거하기 위해 모든 장비와 튜브를 세척하여 해결하실 수 있습니다.
| 단계 | 세부 |
| O - 링 에어컨 | 75 ° C, 2 분 |
| 샘플 소개 | 60 ° C |
| 변성 샘플 | 90 ° C, 5 분 |
| 이종 교잡 | 60 ° C, 16h |
| 1 와시 | 50 ° C, 10 초 흐름은 20 대 시절을 보유 |
| 2 와시 | 42 ° C, 10 초 흐름은 20 대 시절을 보유 |
| 3 와시 | 42 ° C, 10 초 흐름은 20 대 시절을 보유 |
표 1 : 하이브리드화 프로토콜
Discussion
우리는 동시에 게놈 규모의 모든 tRNAs의 상대적 충전 레벨을 결정하기위한 방법을 제시한다. 여기에 제시 프로토콜은 S.에 최적화된되었습니다 cerevisiae가 있으며, 또한 성공적으로 E.에있는 tRNA 충전 프로파일을 측정하는 데 사용되었습니다 대장균과 인간의 세포 문화. 총 청구 tRNA를 얻을 수 있듯이 이것은 알려진 게놈 시퀀스 (모든 tRNA 유전자의 주석에 대한 허용) 한있는 모든 생물을 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
판 실험실에 효모 작품 아지 노 모토 (주) 일본 건강 교육 그랜트 T32GM007183 - 33 국립 연구소에서 교부금에 의해 투자되었다. 우리는 효모 프로젝트에 장기 협력에 대한 의학의 인디애나 대학 대학원에서 박사 로널드 Wek 감사합니다. 우리는 또한 microarray 방법을 충전 tRNA 개발을위한 박사 킴벌리 디트마 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microspin G-25 columns | GE Healthcare | 25-5325-01 | |
| E. coli tRNAPhe | Sigma-Aldrich | R3143 | |
| E. coli tRNATyr | Sigma-Aldrich | R0258 | |
| E. coli tRNALys | Sigma-Aldrich | R6018 | |
| E. coli aminoacyl-tRNA synthetases | Sigma-Aldrich | A3646 | |
| T4 DNA ligase | USB Corp., Affymetrix | 70042X | |
| PerfectHyb Plus | Sigma-Aldrich | H-7033 | |
| Hyb4 station | Digilab | ||
| GenePix 4000B scanner | Axon instruments | ||
| GenePix 6.0 | Axon instruments |
References
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