Summary
Мы опишем метод микрочипов анализ для определения относительного уровня аминоацилирования всех тРНК
Abstract
тРНК аминоацилирования или зарядки, уровни могут быстро меняться в клетке в ответ на окружающую среду [1]. Изменения в тРНК уровень заряда как в прокариотических и эукариотических клеток приводят к поступательным регулирования, которая является одним из основных сотовых механизм стресса. Знакомые примеры строгого ответа в
Protocol
Часть 1: Изоляция от общего числа заряженных тРНК
- Гранул клеток в настольной центрифуге при 2000 RFC течение 5 минут. Эквивалент 1 OD 600 из клетки должны производить не менее 1 мкг тотальной РНК и не менее 30 мкг рекомендуется для процедуры.
- Ресуспендируют лизис клеток в буферный раствор, состоящий из 0,3 М буфере Na +-ацетат (рН 4,5) и 10 мМ ЭДТА. Vortex с равным объемом Na +-ацетат-насыщенных фенол / хлороформ (рН 4,5) три раза в течение 30 сек Будьте уверены, чтобы всегда держать образцы на льду между вортексе. Буферизацией ацетат можно приготовить из NaOAc и HOAc в то время как ацетат насыщенных фенол / хлороформ можно приготовить, смешав 1 часть 5 М буфере ацетат (рН 4,5) с 9 частями фенол / хлороформ.
Примечание: полная изоляция РНК осуществляется при умеренно кислой среде и на льду, чтобы избежать деацилирования заряженных тРНК. - Центрифуга в RFC 18600 в течение 15 минут при 4 ° C. Удалить водный слой и совершать другие ацетат насыщенных фенол / хлороформ добычи.
- После второго добычи осадок РНК, добавив 2,7 раза объемов этанола и центрифугированием при 18600 RFC в течение 30 минут при 4 ° C.
- Ресуспендируют РНК гранул в лизис буферный раствор, а затем осадок с этанолом второй раз.
- Наконец, ресуспендируют РНК в растворе, содержащем 10 мМ буфере ацетата (рН 4,5) и 1 мМ ЭДТА для последующего лечения. Образец может быть стабильно хранится при температуре -80 ° С в течение около двух недель. Длительного хранения не рекомендуется, поскольку некоторые заряженных тРНК начнет deacylate.
Часть 2: Подготовка тРНК стандартам
- Тепло Е. кишечной тРНК стандартов на 10,5 мкМ до 85 ° С в 45 мМ Трис-Cl рН 7,5 в течение 2 минут. Возьмите трубку и оставить при комнатной температуре в течение 3 минут.
- Добавить MgCl 2 до конечной концентрации 20 мМ и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 5 минут.
- Добавить смесь синтетазы реакции так окончательной реакции содержит 5 мкМ тРНК, 60 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 12,5 мМ MgCl 2, 10 мМ KCl, 3 мМ дитиотреитол, 1,5 мМ АТФ, 1 мМ спермина, 1 мМ соответствующих аминокислоты, и 4,2 ЕД / мкл Е. кишечной аминоацил-тРНК-синтетазы смеси. Инкубировать при 37 ° С в течение 15 минут.
- Добавить равный объем 0,5 М буфере ацетат (рН 4,5) и экстракт с ацетат-насыщенных фенол / CHCl 3 при рН 4,5.
- Осадок тРНК стандартов с 2,7 раза объемов этанола и центрифугированием при 18600 RFC в течение 30 минут при 4 ° C.
- Ресуспендируют стандартов в 50 мМ буфере ацетата (рН 4,5) с 1 мМ ЭДТА и хранить при температуре -80 ° С на срок до одного месяца.
Часть 3: Cy3/Cy5 маркировки тРНК
- Для заряженных тРНК образец инкубировать общей РНК в концентрации 0,1 мкг / мкл 0,066 мкМ каждого E. кишечной тРНК стандартам (то есть 0,67 пмоль каждого стандарта на мкг тотальной РНК) и 100 мМ буфере ацетата (рН 4,5) в присутствии 50 мМ NaIO4 в течение 30 минут при комнатной температуре. Для управления общей выборки тРНК использовать 50 мМ NaCl вместо NaIO4. Не забудьте разбавить РНК только с буферных растворов для сохранения зарядки.
- Утолить реакция добавить глюкозу до 100 мм и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Для того, чтобы удалить все оставшиеся NaIO4 из образца выполняют буфер обмена использованием колонки G25 спина. Для достижения наилучших результатов равновесие колонке первым, выполнив 200 мМ буфером ацетатный буфер (рН 4,5) через него перед нанесением вашего образца.
- Осадок образца, добавив буфер ацетат (рН 4,5) до конечной концентрации 133 мМ NaCl и до конечной концентрации 66 мМ и 2,7 раза объемов этанола. Иногда второй осадков могут быть необходимы для окисленных образцов. Это необходимо, только если гранулы выглядит значительно отличается от управления гранул одного и того же образца. Например значительно больше или диффузный гранул. Если второй осадков этанола требуется ресуспендирования гранул в 50 мМ ацетатного буфера рН 4,5 и 200 мМ NaCl перед добавлением этанола.
- Для деацилирования тРНК образцы ресуспендируют в 50 мМ Трис-HCl (рН 9) и инкубировали при 37 ° С в течение 30 мин. Реакции нейтрализуется добавлением равного объема 50 мМ буфере ацетата (рН 4,5) и 100 мМ NaCl. Осадок с 2,7 раза объемов этанола. После осаждения РНК ресуспендировали в воде при температуре ~ 1 мкг / мкл. Оба контроля и окисленные образцы должны быть запущены на гелях агарозы и проверить РНК качества.
- Для присоединения флуоресцентных меток олиго на тРНК 0,1 мкг / мкл деацилированная РНК инкубировали в 1x лигазы буфера, 15% ДМСО, 4 мкМ Cy-3-или Cy5 олигонуклеотидов, 0,5 ед / мкл T4 ДНК-лигазы и дрожжи экзо-фосфатазы (5000 ед. / мкл) при 16 ° С в течение ночи (более 16 ч). Экзо-фосфатазы необходимо только для образцов, полученных из дрожжей и может быть omitteг, если этот протокол используется для E. палочки или человеческих образцов.
- После перевязки образцы смешиваются с 4-х томах 50 мМ KOAc (рН 7), 200 мМ KCl, а затем экстрагируют равным объемом фенол / хлороформ. После извлечения из водной фазы, РНК препараты осаждали этанолом и ресуспендировали в воде около 0,1 мкг / мкл.
- Лигирование эффективность можно оценить, запустив 5-10% образцов на 12% полиакриламидном гелей, содержащих 7М мочевина и визуализированы с люминесцентными сканер геля. Это СТРАНИЦА анализ также полезен для определения количества окисленных и контрольные образцы необходимых для гибридизации микрочипов. Хороший результат должен показать перевязки ~ 10% или более Cy3/Cy5 содержащие олигонуклеотидные быть лигировали с тРНК. Для образцов с высокой эффективностью маркировки, 0,1-0,5 мкг тотальной РНК в образце используется для массива гибридизации.
Часть 4: гибридизация и анализ Microarray
- До слайды гибридизации микрочипов кипятят в дистиллированной воде в течение 1-2 минут для удаления несвязанных олигонуклеотидов.
- Cy3/Cy5 меченых образцов в сочетании с 140 мкл буфера гибридизации и ДНК спермы лосося в конечной концентрации 140 мкг / мл и поли (А) до конечной концентрации 70 мкг / мл.
- Гибридизации программы (таблица 1), выполняется на автоматических гибридизатора массива. Для работы тРНК, настоятельно рекомендуется, чтобы автомат гибридизации быть использованы с ручной гибридизации производит высококачественные фоне.
- После завершения программы вручную мыть слайды с Вымойте 3 Решение по крайней мере дважды, осторожно встряхивая в 50 мл коническую трубку в течение 3-5 минут.
- Слайды можно сушить центрифугированием при низкой скорости, менее 200 RFC, в течение 5-10 минут. Важно сохранить слайды из света с воздействием света будет отбеливатель флуорофоров.
- После слайды сушатся они должны быть отсканированы сразу для достижения оптимального результата, при необходимости они могут быть сохранены в течение нескольких дней в сухом темном месте при комнатной температуре. Слайды могут быть отсканированы в 2-3 раза без заметного ухудшения качества изображения.
Часть 5: Представитель Результаты
При изолированной должным образом общая выборка РНК должна производить очень чистый спектр с OD 260: диаметр 280 соотношение около 2. Там должно быть не обнаруживается белок или фенол загрязнения. При запуске на 1% агарозном гелях, сильная полоса тРНК должны быть соблюдены с другими возможными нуклеиновые кислоты полос различной между организмами. После окисления чистой группы тРНК должны быть соблюдены. Если образец заметно слабее, чем у других образцов или размытие наблюдается, образцы не должны использоваться для микрочипов. Microarrays должны иметь очень низкий фон которая на порядок ниже, чем слабые зонд тРНК. Высокий фон, как правило, из-за проблем во время промывки. Обычно это может быть установлена путем подготовки свежие решения и тщательно мыть стиральную все оборудование и трубопроводы для удаления остатков и осаждают SDS.
| Шаг | Детали |
| Уплотнительное кольцо кондиционирования | 75 ° C, 2 мин |
| Ввести образца | 60 ° C |
| Пример денатурировать | 90 ° C, 5 мин |
| Гибридизация | 60 ° С, 16 ч |
| Промыть 1 | 50 ° С, расход 10 секунд удерживать 20-е годы |
| Вымойте 2 | 42 ° С, расход 10 секунд удерживать 20-е годы |
| Вымойте 3 | 42 ° С, расход 10 секунд удерживать 20-е годы |
Таблица 1: гибридизация протокола
Discussion
Мы представляем метод одновременного определения относительного уровня зарядки всех тРНК в геномной шкале. Протокол, представленные здесь была оптимизирована для S. CEREVISIAE, и она также успешно используется для измерения тРНК зарядки профилей в E. палочки и человеческих клеточных культурах. Она может быть изменена, чтобы приспособить любой организм, известный геномных последовательностей (с учетом аннотации всех генов тРНК) до тех пор, как общее заряженных тРНК может быть получена.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Дрожжи работать в лаборатории Пан был профинансирован за счет гранта Ajinomoto, Inc Японии и Национального института здоровья Обучение Грант T32GM007183-33. Мы благодарим д-ра Рональда Век школы Университета Индианы медицины для долгосрочного сотрудничества по дрожжей проектов. Мы также благодарим доктора Кимберли Диттмар для разработки тРНК зарядки микрочипов метод.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microspin G-25 columns | GE Healthcare | 25-5325-01 | |
| E. coli tRNAPhe | Sigma-Aldrich | R3143 | |
| E. coli tRNATyr | Sigma-Aldrich | R0258 | |
| E. coli tRNALys | Sigma-Aldrich | R6018 | |
| E. coli aminoacyl-tRNA synthetases | Sigma-Aldrich | A3646 | |
| T4 DNA ligase | USB Corp., Affymetrix | 70042X | |
| PerfectHyb Plus | Sigma-Aldrich | H-7033 | |
| Hyb4 station | Digilab | ||
| GenePix 4000B scanner | Axon instruments | ||
| GenePix 6.0 | Axon instruments |
References
- Zaborske, J. M. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).
- Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids. Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).
- Hinnebusch, A. G. Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast. Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).
- Braeken, K. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Dong, J. Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain. Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).
- Cashel, M. The Stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).
- Dittmar, K. A. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
- Zhou, Y. High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma. Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).
