Summary
Biz tüm tRNAs göreceli aminoacylation düzeylerini belirlemek için mikroarray analizi için bir yöntem tarif
Abstract
tRNA aminoacylation veya şarj seviyeleri hızla çevre [1] yanıt olarak bir hücre içinde değiştirebilirsiniz. Düzeyleri hem prokaryotik ve ökaryotik hücreler şarj tRNA değişiklikler, stres yanıtı önemli bir hücresel mekanizmadır translasyonel düzenlemeye neden olur. Benzer örnekler sıkı yanıt olarak
Protocol
Bölüm 1: toplam ücret tRNA İzolasyon
- 2000 RFC az 5 dakika boyunca bir masaüstü santrifüj Pelet hücreleri. OD 600 1 hücre eşdeğer toplam RNA'nın en az 1μg üretmek ve bir işlem için en az 30 mikrogram önerilir .
- +-Asetat (pH 4.5) ve 10 mM EDTA, 0.3 M oluşan lizis tampon çözelti içinde süspanse edin hücreleri Na tamponlu . 30 saniye, her biri üç kez (pH = 4.5), Na +-asetat-doymuş fenol / kloroform eşit hacmi ile girdap Vorteks arasında her zaman buz örnekleri tutmak için emin olun. Tamponlanmış asetat, asetat, fenol / kloroform, fenol kloroform / 9 parça M asetat tamponlu 1 kısım 5 (pH 4.5) karıştırılarak hazırlanmış olabilir doymuş ise NaOAC ve HOAc hazırlanabilir.
Not: toplam RNA izolasyonu ücret tRNA deacylation önlemek için hafif asidik koşullarda ve buz üzerinde yapılmaktadır. - 18.600 RFC santrifüjleyin az 15 dakika süreyle 4 ° C Sulu katman çıkarın ve başka bir asetat-doymuş fenol / kloroform ekstraksiyon gerçekleştirmek.
- Ikinci ekstraksiyon, etanol 2.7x hacim ekleme ve 4, 30 dakika boyunca 18.600 RFC santrifüj ° C RNA çökelmesine sonra
- Lizis tampon çözeltisi ve sonra yeniden süspanse RNA pelet etanol ile ikinci defa hızlandırabilir.
- Son olarak, 10 mM tamponlu asetat (pH 4.5) ve daha sonraki tedavi için 1 mM EDTA içeren bir çözüm RNA tekrar süspansiyon haline getirin. Örnek stably yaklaşık iki hafta -80 ° C'de saklanabilir. Bazı ücret tRNA deacylate başlayacak gibi uzun süreli saklama tavsiye edilmez.
Bölüm 2: tRNA Standartlarının Hazırlanması
- Isı E. 10.5 mcM az 85 coli tRNA standartları ° C 2 dakika süreyle 45 mM Tris-Cl pH 7.5. Tüp dışarı atın ve 3 dakika boyunca oda sıcaklığında bırakın.
- MgCl 2, 37, 20 mM ve inkübe bir final konsantrasyon ° C 5 dakika ekleyin.
- Nihai reaksiyon, 5 mcM tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7.5), 12.5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 3 mM dithiothreitol, 1.5 mM ATP, 1 mM spermin, 1 mM ilgili içerecek şekilde sentetaz reaksiyon karışımı ekleyin amino asit, ve 4.2 adet / ml E. coli Aminoasil-tRNA sentetaz karışımı. 37 ° C'de 15 dakika boyunca.
- 0.5 M asetat tamponlu (pH 4.5) eşit hacimde ekleyin ve pH 4.5 asetat-doymuş fenol CHCl / 3 ile ayıklayın.
- 4 30 dakika 18.600 RFC ° C, etanol ve santrifüj 2.7x hacimleri ile tRNA standartlarına çöktürün
- Bir ay kadar -80 az 1 mM EDTA ve mağaza ° C ile 50 mM tamponlu asetat (pH 4.5) standartlarına tekrar
Bölüm 3: tRNA Cy3/Cy5 etiketleme
- Ücret tRNA örnek için her E. 0,066 mcM ile 0.1 mikrogram / ml 'lik bir konsantrasyon toplam RNA inkübe coli tRNA standartları (yani pmole 0.67 mg total RNA başına her bir standart) ve 50 mM NaIO4 varlığında oda sıcaklığında 30 dakika süreyle 100 mM tamponlu asetat (pH 4.5). Kontrol toplam tRNA örnek kullanmak için 50 mM NaCl NaIO4 bir yerde. Sadece şarj korumak için tamponlu çözümleri ile RNA sulandırmak için unutmayın.
- Reaksiyon gidermek için 100 mM şekeri ekleyin ve 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
- Örnek kalan NaIO4 kaldırmak G25 spin kolon kullanarak bir tampon değişimi gerçekleştirmek için. En iyi sonuçlar, örnek uygulamadan önce, 200 mM tamponlu asetat tamponu (pH 4.5) çalışan ilk sütun dengelenmesi için.
- Tamponlu asetat (pH 4.5) eklenerek nihai konsantrasyonu 133 mM NaCl, 66 mM ve 2.7x hacimlerde etanol bir final konsantrasyon örnek çöktürün. Bazen ikinci bir yağış okside örnekleri için gerekli olabilir. Pelet aynı örnek kontrolü pelet önemli ölçüde farklı görünüyor sadece bu gereklidir. Örneğin, önemli ölçüde daha büyük veya daha yaygın pelet. Ikinci bir etanol yağış 50 mM asetat tamponu pH 4,5 ve 200 mM NaCl etanol eklenmesi önce tekrar süspansiyon pelet gerekiyorsa.
- Deacylation için 50 mM Tris-HCl tRNA örnekleri yeniden süspanse (pH 9) ve 30 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe. Reaksiyon eşit hacmi 50 mM tamponlu asetat (pH 4.5) ve 100 mM NaCl ilavesi ile nötralize edilir. 2.7x hacimlerde etanol ile çöktürün. Yağış sonra, RNA ~ 1 mcg / ml su içinde yeniden süspanse. Kontrolü ve okside örnekleri de RNA kalitesini kontrol etmek için agaroz jel çalıştırmak olmalıdır.
- 1x ligaz tamponu,% 15 DMSO, 4 mcM Cy3 veya Cy5 içeren oligonükleotidler, 0.5 ünite / ml T4 DNA ligaz tRNA 0.1 mg / ml deacylated RNA üzerine floresan oligo etiketleri eklemek için inkübe ve maya exo-fosfataz (5.000 16 adet / ml) ° C gece (16 saat boyunca). Exo-fosfataz sadece maya alınan numuneler için gerekli olan ve omitte olabilird Bu protokol E. için kullanılır. coli ya da insan örnekleri.
- Ligasyonu örnekleri, sonra eşit miktarda fenol kloroform / çıkarılan 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM KCl ve 4 cilt karıştırılır sonra. RNA hazırlıkları, sulu faz ekstraksiyonu takiben etanol ile çöktürülür ve yaklaşık 0.1 mg / ml su içinde yeniden süspanse.
- Ligasyonu verimliliği% 12 poliakrilamid jeller 7M üre içeren örneklerin% 5-10 çalışan tarafından değerlendirilmeli ve bir floresan jel tarayıcı ile görüntülendi. Bu SAYFA analizi, okside ve mikroarray hibridizasyon için gerekli kontrol örnekleri miktarını belirlemek için de yararlıdır. ~ Cy3/Cy5 içeren oligonükleotid% 10 veya daha fazla tRNA bağlandı olmanın iyi bir ligasyonu sonucu göstermelidir. Iyi etiketleme verimliliği ile örnekler için, örnek başına 0.1-0.5 mg total RNA dizi hibridizasyon için kullanılır.
Bölüm 4: Mikroarray Hibridizasyon ve Analiz
- Hibridizasyon mikroarray slaytlar önce bağlanmamış oligonükleotidler kaldırmak için 1-2 dakika distile suda haşlanır.
- Cy3/Cy5 etiketli örnekleri hibridizasyon tamponu ve somon sperm DNA nihai konsantrasyonu 140 mg / ml ve 70 mcg / ml bir final konsantrasyon poli (A) 140 ul birleştirilir.
- Hibridizasyon programı, (Tablo 1), otomatik bir dizi hybridizer çalıştırılır. TRNA iş için son derece elle melezleme yüksek arka plan üretir beri otomatik hibridizasyon makinesi kullanılması tavsiye edilir.
- Programı tamamlandıktan sonra en az iki kez 50 ml konik bir tüp içerisinde 3-5 dakika hafifçe sallayarak elle yıkayın 3 çözüm slaytları yıkayın.
- Slaytlar, düşük hız, 200 RFC az 5-10 dakika santrifüj kurulanmalıdır. Bu ışığa maruz çamaşır suyu fluorophores beri ışık slaytlar dışarıda tutmak için önemlidir.
- Slaytlar kurutulur sonra en iyi sonuçlar için hemen taranabilir; gerekirse, oda sıcaklığında, kuru bir karanlık bir yerde birkaç gün saklanabilir. Slaytlar 2-3 kat görüntü kalitesinde gözle görülür bir bozulma olmadan taranabilir.
Bölüm 5: Temsilci Sonuçlar
2 civarındaki OD 280 oranı: düzgün bir şekilde izole edilen total RNA örnek bir OD 260 ile çok temiz bir spektrum üretmek gerekir. Saptanabilir bir protein ya da fenol kirlenme olmamalıdır. % 1 agaroz jel üzerinde çalıştırdığınızda, güçlü bir tRNA bandı organizmalar arasında değişen diğer olası nükleik asit bantları ile dikkat edilmelidir. Oksidasyon sonra temiz bir tRNA bant dikkat edilmelidir. Bir örnek, diğer örnekleri veya bulaşması görülmektedir göre belirgin zayıf ise, numuneler mikroarray'ler için kullanılan olmamalıdır. Mikroarray'ler çok düşük arka plan zayıf tRNA prob daha düşük büyüklükte bir düzen olmalıdır. Yüksek arka plan genellikle yıkama işlemleri sırasında sorunlar nedeniyle. Bu genellikle taze yıkama çözümler hazırlanması ve kalan ve çöktürülmüş SDS kaldırmak için her türlü ekipman ve boru iyice yıkama ile tespit edilebilir.
| Adım | Ayrıntılar |
| O-halka Klima | 75 ° C, 2 dak |
| Örnek tanıtın | 60 ° C |
| Denatüre Örnek | 90 ° C, 5 dak. |
| Melezleme | 60 ° C, 16h |
| 1 yıkayın | 50 ° C, akış 10s 20s tutun |
| 2 yıkayın | 42 ° C, akış 10s 20s tutun |
| 3 Yıkama | 42 ° C, akış 10s 20s tutun |
Tablo 1: Hibridizasyon protokol
Discussion
Biz aynı anda genomik ölçekte tüm tRNAs göreli şarj seviyelerini belirlemek için bir yöntem mevcut. Burada sunulan protokol S. için optimize edilmiştir cerevisiae, ve aynı zamanda başarılı bir şekilde E. tRNA şarj profilleri ölçmek için kullanılır olmuştur coli ve insan hücre kültürleri. Toplam ücret tRNA elde edilebilir olarak bilinen genom dizileri (tRNA genleri ek açıklama için izin) sürece herhangi bir organizmanın karşılamak için modifiye edilebilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Pan laboratuarda maya iş Ajinomoto, Inc Japonya ve Sağlık Eğitimi Hibe T32GM007183-33 Ulusal Sağlık Enstitüleri bir hibe ile finanse edildi. Maya projelerin uzun vadeli işbirliği için Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi Dr Ronald Wek teşekkür ederim. Ayrıca şarj tRNA mikroarray yöntemi geliştirmek için Dr. Kimberly Dittmar teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microspin G-25 columns | GE Healthcare | 25-5325-01 | |
| E. coli tRNAPhe | Sigma-Aldrich | R3143 | |
| E. coli tRNATyr | Sigma-Aldrich | R0258 | |
| E. coli tRNALys | Sigma-Aldrich | R6018 | |
| E. coli aminoacyl-tRNA synthetases | Sigma-Aldrich | A3646 | |
| T4 DNA ligase | USB Corp., Affymetrix | 70042X | |
| PerfectHyb Plus | Sigma-Aldrich | H-7033 | |
| Hyb4 station | Digilab | ||
| GenePix 4000B scanner | Axon instruments | ||
| GenePix 6.0 | Axon instruments |
References
- Zaborske, J. M. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).
- Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids. Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).
- Hinnebusch, A. G. Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast. Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).
- Braeken, K. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Dong, J. Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain. Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).
- Cashel, M. The Stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).
- Dittmar, K. A. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
- Zhou, Y. High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma. Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).
