Summary
Un protocollo per valutare l'uccisione quantitativa delle cellule tumorali da parte delle cellule Jurkat che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CAR) mirato all'antigene tumorale singolo. Questo protocollo può essere utilizzato come piattaforma di screening per una rapida ottimizzazione dei costrutti di cerniera CAR prima della conferma nelle cellule T derivate dal sangue periferico.
Abstract
Le cellule T del recettore chimerico dell'antigene (CAR) sono all'avanguardia in oncologia. Una CAR è costituita da un dominio di targeting (di solito un frammento variabile a catena singola, scFv), con un linker intra-catena di accompagnamento, seguito da un dominio cerniera, transmembrana e costimolatorio. La modifica del linker intra-catena e del dominio della cerniera può avere un effetto significativo sull'uccisione mediata da CAR. Considerando le molte opzioni diverse per ogni parte di un costrutto CAR, esiste un gran numero di permutazioni. La produzione di celle CAR-T è un processo lungo e costoso e la realizzazione e il collaudo di molti costrutti richiede un notevole investimento in termini di tempo e materiali. Questo protocollo descrive una piattaforma per valutare rapidamente i costrutti CAR ottimizzati per cerniera nelle cellule Jurkat (CAR-J). Le cellule Jurkat sono una linea di cellule T immortalizzate con un elevato assorbimento di lentivirus, che consente un'efficiente trasduzione delle CAR. Qui, presentiamo una piattaforma per valutare rapidamente CAR-J utilizzando un imager fluorescente, seguito dalla conferma della citolisi nelle cellule T derivate da PBMC.
Introduction
La terapia cellulare CAR-T si è dimostrata molto promettente nelle neoplasie ematologiche, come evidenziato dai 6 prodotti CAR-T approvati dalla FDA dal 2017, come riportato dal National Cancer Institute1. Ci sono numerose cellule CAR-T negli studi clinici per colpire i tumori solidi. La progettazione di nuovi bersagli CAR e l'ottimizzazione del costrutto CAR sono fondamentali per l'efficacia di una cellula CAR-T. La scelta del costrutto CAR ideale per ogni applicazione è essenziale per un targeting accurato degli antigeni associati al tumore (TAA), evitando al contempo bassi livelli di espressione di TAA nei tessuti normali2.
Un costrutto CAR è costituito principalmente da cinque compartimenti: (1) dominio extracellulare a frammento variabile a catena singola (scFv) che ha come bersaglio l'antigene tumorale; (2) dominio cerniera; (3) dominio transmembrana; (4) dominio costimolatorio delle cellule T citoplasmatiche intracellulari; e (5) dominio di segnalazione. La modifica di ciascuno di questi domini influisce sulla precisione della cellula CAR-T che interagisce con la sua cellula bersaglio3. Pertanto, la valutazione della citotossicità e della cross-reattività di questi costrutti CAR in vitro è fondamentale per scegliere il costrutto giusto per progredire verso gli esperimenti in vivo. Gli attuali metodi di valutazione della citolisi da parte delle cellule T includono il test di rilascio di 51Cr, il test di rilascio della lattato deidrogenasi, il test di imaging bioluminescente, l'analisi cellulare basata sull'impedenza in tempo reale e il test di citometria a flusso cellulare 4,5. La piattaforma basata sull'imaging fluorescente qui descritta identifica il numero di cellule vive rispetto a quelle morte, che è una quantificazione diretta della citolisi delle cellule T in contrapposizione a un metodo indiretto di valutazione della citolisi da parte delle cellule T.
Ecco una tecnica semplice, economica, rapida e ad alto rendimento con un intervento minimo per valutare la citotossicità delle cellule Jurkat che esprimono il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) CAR contro le cellule di carcinoma mammario triplo negativo (TNBC) MDA-MB-231 e le cellule MDA-MB-231 knock out EGFR CRISPR. Le cellule Jurkat sono cellule dei linfociti T umani immortalizzate6 che sono state ampiamente utilizzate per studiare l'attivazione delle cellule T e i meccanismi di segnalazione7. Inoltre, le cellule Jurkat sono state utilizzate per test CAR in vitro in diversi studi 8,9,10,11. Le cellule Jurkat sono facilmente trasdotte dai lentivirus e hanno una proliferazione sostenuta, e questo sistema è stato sfruttato per ottimizzare il dominio cerniera di vari costrutti EGFR CAR.
Questo test può essere utilizzato per lo screening di più costrutti CAR mirati a vari antigeni tumorali e utilizzato contro più linee cellulari tumorali aderenti e in vari rapporti effettore/tumore (E:T). Inoltre, è possibile valutare più punti temporali e modificare il numero di repliche per identificare la migliore uccisione tra i vari costrutti CAR. I migliori costrutti devono essere confermati utilizzando cellule T CD3 derivate da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). L'obiettivo generale alla base dello sviluppo di questo metodo è quello di ottimizzare rapidamente la geometria della cerniera CAR in modo ad alto rendimento, superando barriere come la bassa efficienza di trasduzione, seguita dalla conferma nelle cellule T derivate da PBMC.
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Protocol
NOTA: Tutto il lavoro di coltura cellulare viene eseguito in una cabina di biosicurezza con camice da laboratorio, guanti e seguendo le tecniche asettiche standard.
1. Generazione di Jurkats che esprimono CAR (CAR-J)
- Acquista le celle Jurkat, clona E6-1 da ATCC. Scongelare 1 x 106 cellule in un pallone T-75 e coltivarle in un pallone T-75. Mantenerli in sospensione a 0,6 x 106 cellule per mL utilizzando terreni di trattamento Roswell Park Memorial Institute (RPMI) integrati con FBS al 10% in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 .
- Piastra 1 x 105 cellule Jurkat per pozzetto di una coltura tissutale trattata Piastra a 24 pozzetti in 500 μL di terreno di crescita RPMI contenente 4 μg/mL di polibrone che migliora l'efficienza lentivirale. Conta le cellule utilizzando un analizzatore di cellule da banco a rilevamento fluorescente basato su laser. Il numero di pozzetti dipende dal numero di costrutti da valutare. In questo esempio verranno utilizzati 4 costrutti e un controllo non trasdotto. Il progetto del costrutto CAR è mostrato nella Tabella 1.
- Aggiungere 10 μL di lentivirus/pozzetto di ciascun costrutto CAR. La progettazione del costrutto CAR e la produzione di lentivirus sono stati eseguiti come descritto in precedenza12.
- Il giorno successivo aggiungere 1 mL di terreno RPMI di crescita a ciascun pozzetto e continuare la coltura nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 .
- Raccogliere le cellule 2 giorni dopo (in totale 72 ore dopo la trasduzione di Jurkat) e contarle.
- Prelevare 1 x 104 celle per il flusso in esecuzione per confermare l'espressione di CAR sulle cellule Jurkat. Lavare brevemente le cellule 2 volte con la soluzione colorante FACS (FSS) prima di marcare la CAR-J con anticorpi mirati al tag Flag utilizzato per rilevare la positività alla CAR per 30 minuti al buio a 4 °C. Lavare di nuovo 2 volte con FSS e far passare le cellule attraverso un citometro a flusso come descritto in precedenza12. Utilizzare la concentrazione di anticorpi come raccomandato dal produttore.
- Le cellule Jurkat sono facilmente trasducibili e quasi sempre mostrano un'espressione di CAR del >90%. Produrre CAR-J molto prima del test di citotossicità in co-coltura e congelare per un uso successivo.
2. Placcatura di cellule tumorali marcate con CFSE
NOTA: Le celle MDA-MB-231 (da ATCC, HTB-26) sono state un regalo di un collaboratore e EGFR KO MDA-MB-231 sono state create come descritto in precedenza12.
- Scongelare 1 x 106 cellule in un pallone T-75 e coltivarle in un pallone T-75. Mantenere le cellule tumorali MDA-MB-231 e le cellule tumorali CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 in 14 mL di terreno alterato dell'aquila di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2 e diviso quando circa il 70% è confluente.
- Osservare le cellule tumorali aderenti al normale microscopio in campo chiaro per garantire una confluenza di quasi il 70%.
- Rimuovere il terreno di coltura dal matraccio utilizzando una pipetta sierologica. Aggiungere 3 mL di tripsina nel matraccio T75 e porre in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 per 3-5 minuti per staccare le cellule dal pallone.
- Neutralizzare la tripsina utilizzando una quantità uguale (3 ml) di terreno di coltura. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga e centrifugare le cellule a 400 x g per 4 minuti per pellettizzare le cellule.
- Scartare il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere le cellule in 2 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Determinare la concentrazione cellulare utilizzando un contatore di cellule.
- Trasferire 8 x 105 cellule in un'altra provetta da 15 mL e aggiungere PBS per ottenere un volume di 1 mL.
- Aggiungere 2 μL di carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE; concentrazione madre 5 μM) in ciascuna provetta e mescolare bene utilizzando una pipetta da 1 mL.
- Incubare le cellule con CFSE per 20 minuti nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 . Rimuovere le provette dall'incubatrice dopo 20 minuti e aggiungere 5 ml di terreno di coltura alla provetta.
- Centrifugare le provette a 400 x g per 4 minuti per pellettizzare le cellule marcate con CFSE. Scartare il surnatante usando una pipetta e aggiungere 1 mL di terreno fresco per risospendere le cellule.
- Rivalutare la concentrazione cellulare utilizzando un contatore di cellule. Trasferire 4 x 105 cellule in un serbatoio di reagenti da 25 mL e aggiungere il terreno per un volume totale di 8 mL.
- Per garantire un volume sufficiente per seminare 5000 cellule tumorali/pozzetto in 100 μL di terreno, volume necessario per poter pipettare utilizzando la pipetta multicanale e per compensare la perdita di alcune cellule durante la fase 1.7, preparare il 10%-20% in più di cellule e volume del terreno.
- Miscelare accuratamente la sospensione cellulare utilizzando una pipetta sierologica da 5 ml. Utilizzando una pipetta multicanale da 100 μL, pipettare 100 μL di sospensione cellulare in ciascuna fila della piastra nera trasparente a fondo piatto da 96 pozzetti sulla metà sinistra. Un esempio di strategia di placcatura è riportato nella Tabella 2.
- Pipettare le cellule EGFR KO in modo simile sulla metà destra della piastra. Una volta che l'intera piastra è stata placcata, trascinarla avanti e indietro e da un lato all'altro sulla piattaforma della cappa di coltura tissutale per garantire una distribuzione uniforme delle cellule tumorali nei pozzetti.
- Incubare la piastra per 4 ore nell'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2 per consentire l'adesione delle cellule tumorali.
3. Co-coltura di Jurkats che esprimono CAR con cellule tumorali marcate con CFSE
- Utilizzando la conta delle cellule Jurkat non trasdotte ed esprimenti CAR, trasferire 4 x 105 cellule di ciascuna CAR-J in un serbatoio da 25 mL. Aggiungere il terreno di coltura DMEM per un volume totale di 2 ml.
- Per E:T di 4:1, sono stati aggiunti 2 x 104 CAR-J per pozzetto in 100 μL di terreno utilizzando una pipetta multicanale delicatamente lungo il lato di ciascun pozzetto in modo da non disturbare le cellule tumorali attaccate.
- Aggiungere altri 100 μL di terreno di coltura utilizzando una pipetta multicanale sul lato dei pozzetti contenenti cellule tumorali e cellule Jurkat. I gruppi tumorali ricevono solo 200 μL di terreno per un totale di 300 μL di terreno in tutti i pozzetti.
- Trascinare la piastra lungo la piattaforma avanti e indietro e con movimenti da un lato all'altro per garantire una distribuzione uniforme delle cellule Jurkat sulle cellule tumorali.
- Lasciare la cocoltura nell'incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 per 48 ore.
4. Preparazione della piastra per l'imaging
- Preparare una soluzione di ioduro di propidio (PI) a 1 μg/mL in terreni a fluorescenza a basso fondo in base al numero di pozzetti e ciascuno ottenendo 100 μL di terreno.
- Per 84 pozzetti preparare 9 mL di terreno contenente PI. Miscelare accuratamente il terreno con una pipetta.
- Preparare 10 mL di soluzione di Triton-X al 20% diluendo Triton-X con acqua deionizzata. Dopo 48 ore di cocoltura, scartare il surnatante contenente CAR-J con una singola inversione della piastra e picchiettando su carta assorbente.
- A questo punto, aggiungere 100 μL di terreno preparato sopra (passaggio 4.2) contenente PI in ciascun pozzetto utilizzando delicatamente una pipetta multicanale in modo da non disturbare le cellule tumorali aderenti.
- Aggiungere 20 μL di soluzione Triton-X al 20% al primo pozzetto di ciascun tipo di tumore che funziona come un controllo totale dei morti.
- Lasciare la piastra nell'incubatrice per 20 min. Eseguire l'imaging della piastra utilizzando il citometro a fluorescenza. I dati vengono memorizzati sul computer e possono essere analizzati in un secondo momento.
5. Analisi di immagini fluorescenti
- Utilizzare uno dei pozzi tumorali solo delle cellule per impostare il canale fluorescente verde.
- Diminuire la maschera del pozzetto al 98% per rimuovere le celle sul bordo del pozzetto poiché il segnale non è perfetto sul bordo.
- Identifica le cellule tumorali marcate con CFSE sul canale CFSE verde e fluorescente. Modificare il valore della soglia di intensità della fluorescenza per prelevare tutte le cellule sul pozzetto.
- Impostare il diametro minimo della cella su 25 μm per rimuovere eventuali detriti rilevati sul canale CFSE. Questo varia a seconda del tipo di cellula analizzata.
- Abilita Separa oggetti a contatto per identificare le singole celle quando sono in contatto tra loro.
- Selezionare CFSE nella visualizzazione dell'immagine e osservare la sovrapposizione grafica per capire cosa viene selezionato dal sistema.
- Una volta che le cellule marcate con CFSE vengono prelevate correttamente, impostare i cancelli per definire la popolazione di cellule vive rispetto a quelle morte.
- Selezionando le celle marcate CFSE, generare un istogramma di conteggi sull'asse y rispetto all'intensità PI media sull'asse x.
- Sulla base del pozzetto in cui abbiamo aggiunto Triton-X (passaggio 4.5), disegna uno splitter per differenziare le cellule colorate con PI basso da quelle colorate con PI alto. Questo pozzetto dovrebbe avere la maggior parte delle cellule in una regione ad alto PI colorato.
NOTA: PI mostra il segnale basale sulle cellule vive. Quindi, l'aggiunta di Triton-X uccide tutte le cellule e queste si colorano nel canale fluorescente rosso. Ciò facilita l'apertura di cancelli per separare le cellule morte dalle cellule vive. - Regolare il valore dell'asse x per visualizzare meglio le celle. Ora etichettare le cellule a basso PI come cellule vive.
- Selezionando le celle vive, imposta un altro istogramma con area sull'asse x e conteggi sull'asse y.
- Disegna un altro splitter usando bene solo il tumore per catturare le cellule e non i detriti. I pozzi trattati con Jurkat inizieranno ad accumulare detriti che saranno colorati con CFSE e dovranno essere rimossi dai conteggi. I rimanenti non detriti sono etichettati come "Big cells".
- Eseguire l'analisi sull'intera piastra ed esportare il foglio di calcolo contenente i numeri.
- Tracciare i conteggi Big per identificare il numero di cellule tumorali vive marcate con CFSE rimaste nel pozzetto dopo l'esposizione a CAR-J. Determinare le statistiche utilizzando l'ANOVA unidirezionale.
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Representative Results
È stato valutato un intervallo di rapporto E:T compreso tra 1:8 e 8:1 per CAR-J1 a 72 ore, che ha come target l'EGFR sulle cellule TNBC MDA-MB-231. Le cellule Jurkat sono state trasdotte con lentivirus CAR con polibrene per generare cellule CAR-J come descritto nella fase 2. La citotossicità di CAR-J1 è aumentata significativamente con un rapporto E:T più elevato senza alcuna differenza nell'uccisione con un rapporto 1:8 (Figura 1). Più del 50% delle uccisioni è stato osservato a 4:1 E:T in 72 ore. Questo E:T è stato utilizzato per esperimenti successivi con durata ridotta a 48 ore per una rapida valutazione della citotossicità di più costrutti CAR. Sono stati progettati costrutti CAR mirati all'EGFR con il dominio della cerniera modificato (Tabella 1). Le 4 diverse cerniere utilizzate sono IgG lunghe, IgG medie, IgG corte e CD8a come descritto qui13. Questi 3 costrutti sono stati espressi su cellule Jurkat e la positività CAR è stata determinata valutando la percentuale di cellule marcate con Flag mediante citometria a flusso (Figura 2A-D) come descritto qui12. Le cellule Jurkat non trasdotte sono state utilizzate come gruppo di controllo per determinare l'espressione di CAR e la strategia di gating è mostrata nella Figura 2E. La citotossicità di questi 4 costrutti CAR espressi sulle cellule Jurkat è stata valutata contro le cellule EGFR che esprimono MDA-MB-231 e le cellule CRISPR EGFR KO MDA-MB-231. L'uccisione specifica dell'antigene è stata osservata da tutti i costrutti (Figura 3A), mentre non è stata osservata alcuna uccisione significativa contro le cellule KO dell'EGFR (Figura 3B), suggerendo che l'uccisione è stata specificamente mediata solo attraverso l'scFv. Non c'è stata alcuna uccisione da parte delle cellule Jurkat non trasdotte. Vengono mostrate anche immagini rappresentative dell'uccisione del tumore in cui la sovrapposizione delle cellule tumorali marcate CFSE con il nucleo morto colorato con PI le fa apparire gialle (Figura 4). I dati sono rappresentativi di 3 esperimenti indipendenti con 6 repliche tecniche per gruppo.
Ciò è stato ulteriormente confermato dall'espressione di questi costrutti CAR su cellule T CD3 derivate da PBMC. C'è una bassa espressione di CAR sulle cellule T CD3 che vengono poi arricchite mediante smistamento a flusso sterile (Figura 5). Tuttavia, non c'è stata alcuna espressione della cerniera CD8 contenente EGFR CAR. Quindi gli altri 3 costrutti CAR contenenti IgG lunghe, IgG medie e IgG corte sono state valutate per il loro potenziale citotossico contro le cellule MDA-MB-231. C'è una tendenza simile all'uccisione con le IgG corte che hanno la minore potenza citotossica rispetto agli altri 2 costrutti (Figura 6). Per identificare il miglior costrutto tra le cellule CAR-T IgG lunghe e medie IgG, la loro attivazione con e senza esposizione alle cellule tumorali TNBC è stata valutata mediante colorazione intracellulare delle citochine come descritto in precedenza12. MDA-MB-436 ha bassi livelli di EGFR e MDA-MB-468 ha la più alta espressione della proteina EGFR basata su un western blot con un pannello di 13 linee cellulari TNBC12. Le cellule CAR-T lunghe IgG avevano i livelli minimi di attivazione basale (TNFa, 4-1BB) e un basso rilascio di granuli citotossici (perforina e granzima B)14 senza alcuna esposizione alle cellule tumorali (Figura 7). Dopo l'esposizione a cellule MDA-MB-468 ad alto contenuto di EGFR, le cellule CAR-T lunghe IgG hanno avuto la più alta attivazione basata su TNFa e 4-1BB.
Figura 1: Valutazione citotossica di EGFR CAR-J1 lungo un intervallo di E:T. Le cellule tumorali MDA-MB-231 marcate con CFSE sono state piastrate con cellule Jurkat non trasdotte o EGFR mirate a CAR-J1 con un rapporto E:T di 1:8, 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 e 8:1 mostrando una citotossicità crescente con cellule effettrici più elevate. I dati sono rappresentati come media ± SD e la significatività statistica è stata valutata utilizzando il test t di Student. 1:8 E:T non era significativo, 1:4 E:T aveva ***p<0,001 e il resto ****p<0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Produzione di EGFR CAR Jurkat per la valutazione citotossica in vitro . (A-D) Quasi il 90%-100% di espressione CAR di 4 diversi costrutti CAR IgG lunghi, CAR IgG medi, CAR IgG corti, CAR CD8a. (E) Strategia di gating per la determinazione della positività CAR: detriti esclusi nel grafico SSC-A vs FSC-A; Celle singole selezionate nel grafico FSC-H vs FSC-A; e cellule vive selezionate mediante gating negativo DAPI con colorante di vitalità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Valutazione della citotossicità in co-coltura di cellule tumorali marcate con CAR-J e CFSE. (A) Le cellule MDA MB 231 marcate con CFSE sono state piastrate con CAR-J con un rapporto E:T di 4:1 per 48 ore, mostrando un'efficacia variabile nell'uccisione delle cellule tumorali. (B) Le cellule CRISPR EGFR KO MDA MB 231 marcate con CFSE non hanno subito alcuna uccisione da parte di nessuna delle cellule CAR-J. I dati sono rappresentati come media ± SD e la significatività statistica è stata valutata utilizzando l'ANOVA unidirezionale. **P<0,01; p<0,0001; NS: Non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rappresentazione visiva delle immagini dopo 48 ore di co-coltura. (A) Gruppo solo tumorale con cellule tumorali marcate con CFSE (verde). (B) Aggiunta di cellule Jurkat non trasdotte con i globuli rossi che sono le cellule Jurkat morte e (C) sovrapposizione di verde e rosso che indica le cellule tumorali morte (giallo) come mostrato dalle frecce. Viene quantificato il numero di celle verdi che non sono gialle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Arricchimento di cellule CAR-T CD3 di EGFR. (A-B) Espressione di CAR valutata determinando la percentuale di cellule Flag positive e IgG positive prima dell'arricchimento e (C) dopo l'arricchimento mediante selezione a flusso sterile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Valutazione della citotossicità in co-coltura di cellule tumorali marcate con CD3 CAR-T e CFSE. Le cellule MDA MB 231 marcate con CFSE sono state piastrate con CAR-J con un rapporto E:T di 4:1 per 48 ore, mostrando un'efficacia variabile nell'uccisione delle cellule tumorali. I dati sono rappresentati come media ± SD e la significatività statistica è stata valutata utilizzando l'ANOVA unidirezionale. **P<0,01; p<0,0001; NS: Non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Attivazione delle cellule CAR-T CD3 dell'EGFR. Le cellule CAR-T sono state esposte alle cellule tumorali e sono stati valutati i livelli di citochine intracellulari per (A) TNFa, (B) 4-1BB, (C) perforina e (D) granzima B. I dati sono rappresentati come media ± SD e la significatività statistica è stata valutata utilizzando l'ANOVA unidirezionale *p<0,05; **P<0,01; **P<0,001; p<0,0001; NS: Non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| No. di PA EGFR806 scFv | Vh-Vl Linker | Cerniera/Distanziale | TM | Citoplasmica |
| CAR IgG Lungo | Whitlow (18 aa) | IgG4 EQ CH2 CH3 (229 aa) | CD4 | 4-1BB / CD3z |
| CAR IgG Medio | Patereccio | IgG4 CH3 (129 aa) | CD28 | 4-1BB / CD3z |
| CAR IgG Pantaloncini | Patereccio | IgG corte (12 aa) | CD4 | 4-1BB / CD3z |
| AUTO CD8a | Patereccio | CD8 (45 aa) | CD8a | 4-1BB / CD3z |
Tabella 1: Progetti di costrutti CAR. Abbreviazioni: aa = amminoacidi; TM = Transmembrana.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Un | Tritone-X | Solo MDA MB 231 | Tritone-X | Solo MDA MB 231 EGFR KO | ||||||||
| B | MB231 + Simulazione 4:1 | MB231 EGFR KO + Mock 4:1 | ||||||||||
| C | MB231 + EGFR IgG Lungo 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Lungo 4:1 | ||||||||||
| D | MB231 + EGFR IgG Medio 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Medio 4:1 | ||||||||||
| E | MB231 + EGFR IgG Corto 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Corto 4:1 | ||||||||||
| F | MB231 + EGFR CD8a 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR CD8a 4:1 | ||||||||||
| G | ||||||||||||
| H | ||||||||||||
Tabella 2: Strategia di placcatura del campione.
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Discussion
Qui abbiamo proposto un metodo rapido per valutare in modo efficiente l'attività citolitica target-specifica indotta dall'espressione di CAR nelle cellule Jurkat. Tutti i costrutti CAR hanno lo stesso scFv ma diversi domini cerniera e transmembrana che hanno dimostrato di influenzare la potenza delle cellule CAR-T13. Un'ulteriore valutazione dell'uccisione non specifica da parte di queste CAR-J è stata effettuata coltivandole con cellule knock out dell'antigene (KO). Ciò dimostra che l'uccisione è specifica dell'antigene tumorale e non è dovuta all'attivazione basale da parte della CAR-J. Il potenziale citotossico di una serie di rapporti E:T può essere facilmente determinato identificando il minor numero di cellule effettrici necessarie per eliminare le cellule tumorali in punti temporali specifici. Per valutare la specificità di questi costrutti possono essere utilizzate anche linee cellulari multiple dello stesso tipo o di cellule normali o di tipo diverso. I candidati più potenti identificati dalla piattaforma CAR-J possono quindi essere ulteriormente caratterizzati esprimendo CAR su cellule T CD3 derivate da PBMC ed eseguendo saggi di uccisione simili e valutando l'esaurimento e l'attivazione in seguito all'esposizione a cellule tumorali positive e negative per l'antigene.
Va notato che le cellule Jurkat sono cellule CD4+ con una via di segnalazione alterata del recettore delle cellule T (TCR)15. Quindi, l'ottimizzazione del dominio di segnalazione intracellulare dei costrutti CAR dovrebbe idealmente essere eseguita con le cellule T CD316 e potrebbe non funzionare meglio con le cellule Jurkat. È interessante notare che le cellule T CD4 mostrano citotossicità, come dimostrato in una precedente pubblicazione in cui le cellule CAR-T CD4 mirate all'EGFR con cerniera lunga IgG sono in grado di sradicare completamente i tumori TNBC in un modello tumorale intracranico12. Inoltre, le cellule CAR T CD4 mostrano una potenza a lungo termine e una migliore uccisione rispetto alla miscela di cellule T CD4 e CD8 o alle cellule T CD8 da sole nel modello tumorale GBM, rendendole sottoinsieme di cellule T clinicamente importanti per un'efficace terapia CAR-T17.
Le cellule Jurkat producono IL2 e sovraregolano CD69 al momento dell'attivazione, sebbene non secernano tutte le citochine dell'attivazione primaria delle cellule T 8,18. Tuttavia, la valutazione dei livelli di IL2 e CD69 informa sull'attivazione delle cellule Jurkat e non sulla citolisi diretta delle cellule bersaglio, che vengono quantificate in numero assoluto di cellule tumorali con questo approccio. Tuttavia, la valutazione della citotossicità e dell'attivazione è importante per comprendere appieno gli effetti delle nuove molecole CAR.
La durata della co-coltura in questo esperimento può essere modificata in base ai costrutti utilizzati. La marcatura CFSE sulle cellule tumorali è risultata rilevabile fino a 4 giorni dopo la placcatura. Quindi, per ottenere un elevato rapporto segnale/rumore, gli esperimenti sono stati eseguiti entro 72 ore. Poiché l'intensità del CFSE diminuisce con la divisione delle cellule tumorali, la quantità di CFSE utilizzata e la durata possono dover cambiare in base alle cellule tumorali utilizzate. Poiché si tratta di un esperimento ad alto rendimento per analizzare più costrutti alla volta, è necessario ottimizzare anche la densità di semina delle cellule bersaglio in una piastra a 96 pozzetti. Le cellule bersaglio devono essere mantenute in modo che non crescano in modo eccessivo o abbiano una restrizione di crescita competitiva entro la fine del test senza la necessità di cambiare terreno per ridurre al minimo qualsiasi intervento. Piastre a pozzetti più grandi possono essere utilizzate per ospitare più cellule e aumentare la longevità dell'esperimento. Tuttavia, le immagini devono essere unite per ottenere un quadro completo del pozzo e ogni pozzetto deve essere lavorato individualmente, il che potrebbe non renderlo rapido e ad alta produttività.
Un altro approccio di marcatura fluorescente a lungo termine delle cellule tumorali è la trasduzione lentivirale con proteina fluorescente verde (GFP) o proteina fluorescente rossa (RFP). È necessario effettuare un'adeguata selezione clonale per selezionare le colonie più luminose altamente arricchite (quasi il 100%) per ottenere il miglior rapporto segnale/rumore. Il colorante di vitalità deve essere selezionato in modo appropriato in base ai rivelatori fluorescenti nello strumento di imaging.
La fluorescenza di fondo dipende dal supporto utilizzato e quindi deve essere controllata per evitare la perdita di segnale durante l'acquisizione delle immagini. I normali supporti contengono componenti che emettono una fluorescenza significativa quando vengono eccitati. Si consiglia di utilizzare un supporto a basso sfondo19. È possibile utilizzare il PBS, ma può influire sulle celle durante l'acquisizione delle immagini, poiché l'acquisizione delle immagini richiede circa 20 minuti, a seconda delle impostazioni impostate per l'acquisizione delle immagini.
Uno dei limiti di questo test è quello di non essere in grado di acquisire immagini in più punti temporali della stessa piastra a 96 pozzetti dopo l'aggiunta di un colorante di vitalità. L'effetto dell'aggiunta di PI nel lungo periodo di tempo non è stato valutato per questa pubblicazione. Tuttavia, l'ideale sarebbe essere in grado di rilevare cellule bersaglio vive e morte/morenti per un periodo utilizzando la stessa piastra. Può essere difficile segregare le singole cellule se le cellule diventano troppo confluenti. L'area del monostrato cellulare e l'intensità della fluorescenza possono essere utilizzate per confrontare la percentuale di cellule vive/morte come descritto20.
I metodi alternativi utilizzati per rilevare la citolisi da parte delle cellule CAR-T non misurano direttamente il numero assoluto di cellule morte e vive, ma valutano la potenza con metodi indiretti che sono descritti in dettaglio altrove 4,5. Quindi, questo metodo fornisce un conto assoluto delle cellule effettrici e può essere utilizzato anche in co-coltura di 3 tipi di cellule a seconda della capacità dello strumento di imaging. Sono necessarie pochissime cellule (5000 per pozzetto) che possono cambiare insieme alla libertà di scegliere un punto temporale, che sono enormi vantaggi dell'utilizzo di questo test. Le cellule bersaglio in sospensione e in coltura sferoidale tridimensionale possono essere utilizzate anche in coltura con cellule effettrici e citolisi determinata come descritto altrove21. Inoltre, questa piattaforma può essere utilizzata per lo screening di grandi librerie di piccole molecole e composti per delineare le molecole più efficaci e il dosaggio multiplo può essere eseguito in più punti temporali.
Oltre alla velocità e alla flessibilità del sistema, il vantaggio finale è quello del costo. La macchina per l'imaging fluorescente, le piastre e i reagenti sono tutti comuni e convenienti da acquistare, soprattutto se confrontati con dispositivi più sofisticati e che possono persino utilizzare metalli preziosi nelle loro lastre monouso.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
MDA-MB-231 è stato un gentile regalo del Dr. Shane Stecklein. Gli autori riconoscono il finanziamento da parte dell'Università del Kansas Cancer Center per condurre questa ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
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