Summary
Een protocol om kwantitatieve tumorceldoding te evalueren door Jurkat-cellen die chimere antigeenreceptor (CAR) tot expressie brengen die gericht zijn op een enkel tumorantigeen. Dit protocol kan worden gebruikt als een screeningsplatform voor snelle optimalisatie van CAR-scharnierconstructies voorafgaand aan bevestiging in perifere bloed-afgeleide T-cellen.
Abstract
Chimere antigeenreceptor (CAR) T-cellen lopen voorop in de oncologie. Een CAR is opgebouwd uit een targetingdomein (meestal een variabel fragment met één keten, scFv), met een bijbehorende intra-chain linker, gevolgd door een scharnier-, transmembraan- en costimulatoirdomein. Modificatie van het intra-chain linker- en scharnierdomein kan een significant effect hebben op CAR-gemedieerde doding. Gezien de vele verschillende opties voor elk onderdeel van een CAR-constructie, zijn er grote aantallen permutaties. Het maken van CAR-T-cellen is een tijdrovend en duur proces, en het maken en testen van veel constructies is een zware investering in tijd en materiaal. Dit protocol beschrijft een platform om snel scharnier-geoptimaliseerde CAR-constructies in Jurkat-cellen (CAR-J) te evalueren. Jurkat-cellen zijn een onsterfelijke T-cellijn met een hoge lentivirusopname, waardoor efficiënte CAR-transductie mogelijk is. Hier presenteren we een platform om CAR-J snel te evalueren met behulp van een fluorescerende imager, gevolgd door bevestiging van cytolyse in PBMC-afgeleide T-cellen.
Introduction
CAR-T-celtherapie is veelbelovend gebleken bij hematologische maligniteiten, zoals blijkt uit de 6 door de FDA goedgekeurde CAR-T-producten sinds 2017, zoals gerapporteerd door het National Cancer Institute1. Er zijn talloze CAR-T-cellen in klinische onderzoeken voor het aanpakken van solide tumoren. Het ontwikkelen van nieuwe CAR-doelen en het optimaliseren van het CAR-construct is van vitaal belang voor de werkzaamheid van een CAR-T-cel. Het kiezen van de ideale CAR-constructie voor elke toepassing is essentieel voor het nauwkeurig richten van tumorgeassocieerde antigenen (TAA) en het vermijden van lage niveaus van TAA-expressie in normale weefsels.
Een CAR-construct bestaat voornamelijk uit vijf compartimenten: (1) extracellulair enkelvoudig variabel fragment (scFv)-domein gericht op tumorantigeen; (2) scharnier domein; (3) transmembraan domein; (4) intracellulair cytoplasmatisch T-cel costimulatoir domein; en (5) signaleringsdomein. Het wijzigen van elk van deze domeinen beïnvloedt de precisie van de CAR-T-cel die in contact komt met zijn doelcel3. Daarom is het van cruciaal belang om de cytotoxiciteit en kruisreactiviteit van deze CAR-constructen in vitro te evalueren om het juiste construct te kiezen om door te gaan naar in vivo experimenten. De huidige methoden voor het evalueren van cytolyse door T-cellen omvatten 51Cr-afgiftetest, lactaatdehydrogenase-afgiftetest, bioluminescente beeldvormingstest, real-time impedantie-gebaseerde celanalyse en celgebaseerde flowcytometrie-assay 4,5. Het fluorescerende beeldvormingsplatform dat hier wordt beschreven, identificeert het aantal levende versus dode cellen, wat een directe kwantificering is van de cytolyse van T-cellen, in tegenstelling tot een indirecte methode om de cytolyse door T-cellen te evalueren.
Hier is een eenvoudige, kostenefficiënte, snelle en hoge doorvoertechniek met minimale interventie om de cytotoxiciteit te evalueren van Jurkat-cellen die epidermale groeifactorreceptor (EGFR) CAR tot expressie brengen tegen MDA-MB-231 triple-negatieve borstkankercellen (TNBC) en EGFR CRISPR knock-out MDA-MB-231-cellen. Jurkat-cellen zijn onsterfelijke menselijke T-lymfocytcellen6 die op grote schaal zijn gebruikt voor het bestuderen van T-celactiverings- en signaleringsmechanismen7. Bovendien zijn Jurkat-cellen gebruikt voor in vitro CAR-testen in meerdere onderzoeken 8,9,10,11. Jurkat-cellen worden gemakkelijk getransduceerd door lentivirus en hebben aanhoudende proliferatie, en dit systeem werd gebruikt om het scharnierdomein van verschillende EGFR CAR-constructies te optimaliseren.
Deze test kan worden gebruikt voor het screenen van meerdere CAR-constructen gericht op verschillende tumorantigenen en kan worden gebruikt tegen meerdere aanhangende tumorcellijnen en in verschillende effector-tot-tumor (E:T)-verhoudingen. Bovendien kunnen meerdere tijdstippen worden geëvalueerd en kan het aantal replicaten worden aangepast om de beste moord onder de verschillende CAR-constructies te identificeren. De beste constructen moeten worden bevestigd met behulp van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) die afkomstig zijn van CD3 T-cellen. Het algemene doel achter de ontwikkeling van deze methode is om de CAR-scharniergeometrie snel te optimaliseren op een manier met een hoge doorvoer, waarbij barrières zoals een lage transductie-efficiëntie worden overwonnen, gevolgd door bevestiging in PBMC-afgeleide T-cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Al het celkweekwerk wordt gedaan in een bioveiligheidskast met een laboratoriumjas, handschoenen en volgens standaard aseptische technieken.
1. Het genereren van CAR die Jurkats uitdrukt (CAR-J)
- Koop Jurkat-cellen, kloon E6-1 van ATCC. Ontdooi 1 x 106 cellen in een T-75 kolf en kweek ze in T-75 kolven. Houd ze in suspensie op 0,6 x 106 cellen per ml met behulp van media van het Roswell Park Memorial Institute (RPMI) aangevuld met 10% FBS in een incubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Plaat 1 x 105 Jurkat-cellen per putje van een weefselkweek behandeld 24 putjes plaat in 500 μL RPMI-groeimedia met 4 μg/ml polybreen, wat de lentivirale efficiëntie verbetert. Tel cellen met behulp van een op laser gebaseerde fluorescerende detectie-tafelcelanalysator. Het aantal putten is afhankelijk van het aantal te evalueren constructies. In dit voorbeeld worden 4 constructen en een niet-getransduceerde besturing gebruikt. Het ontwerp van de CAR-constructie is weergegeven in tabel 1.
- Voeg 10 μL lentivirus/putje van elk CAR-construct toe. Het ontwerp van de CAR-constructie en de productie van het lentivirus werd uitgevoerd zoals eerder beschreven12.
- Voeg de volgende dag 1 ml groei-RPMI-media toe aan elk putje en ga verder met kweken in de incubator bij 37 °C met 5% CO2.
- Verzamel cellen 2 dagen later (totaal 72 uur na Jurkat-transductie) en tel ze.
- Neem 1 x 104 cellen voor het uitvoeren van de stroom om de CAR-expressie op de Jurkat-cellen te bevestigen. Was de cellen in het kort 2x met FACS-kleuroplossing (FSS) voordat u de CAR-J labelt met antilichamen die gericht zijn op de Flag-tag die wordt gebruikt om CAR-positiviteit te detecteren gedurende 30 minuten in het donker bij 4 °C. Was opnieuw 2x met FSS en laat de cellen door een flowcytometer lopen zoals eerder beschreven12. Gebruik de antilichaamconcentratie zoals aanbevolen door de fabrikant.
- Jurkat-cellen worden gemakkelijk getransduceerd en vertonen bijna altijd >90% CAR-expressie. Produceer CAR-J lang voor de co-cultuur cytotoxiciteitstest en vries het in voor later gebruik.
2. Plateren van CFSE-gelabelde tumorcellen
OPMERKING: MDA-MB-231 (van ATCC, HTB-26) cellen waren een geschenk van een medewerker en EGFR KO MDA-MB-231 zijn gemaakt zoals eerder beschreven12.
- Ontdooi 1 x 106 cellen in een T-75 kolf en kweek ze in T-75 kolven. Behoud MDA-MB-231 tumorcellen en CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 tumorcellen in 14 ml Dulbecco's gemodificeerde eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 en splits wanneer ongeveer 70% confluent.
- Observeer aanhangende tumorcellen onder een gewone helderveldmicroscoop om bijna 70% samenvloeiing te garanderen.
- Verwijder het groeimedium uit de kolf met behulp van een serologische pipet. Voeg 3 ml trypsine toe aan de T75-kolf en plaats deze gedurende 3-5 minuten in een incubator bij 37 °C met 5% CO2 om de cellen los te maken van de kolf.
- Neutraliseer de trypsine met een gelijke hoeveelheid (3 ml) groeimedia. Vang de celsuspensie op in een centrifugebuis en draai de cellen gedurende 4 minuten rond bij 400 x g om de cellen te pelleteren.
- Gooi het supernatans weg met behulp van een pipet en resuspendeer de cellen in 2 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Bepaal de celconcentratie met behulp van een celteller.
- Breng 8 x 105 cellen over in een andere buis van 15 ml en voeg PBS toe om een volume van 1 ml te bereiken.
- Voeg 2 μL carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE; 5 μM voorraadconcentratie) toe aan elk buisje en meng goed met een pipet van 1 ml.
- Incubeer de cellen met CFSE gedurende 20 minuten in de incubator bij 37 °C met 5% CO2. Haal de buisjes na 20 minuten uit de incubator en voeg 5 ml groeimedia toe aan het buisje.
- Centrifugeer de buisjes gedurende 4 minuten op 400 x g om de cellen met CFSE-label te pelleteren. Gooi het supernatans weg met behulp van een pipet en voeg 1 ml vers medium toe om de cellen opnieuw te suspenderen.
- Herwaardeer de celconcentratie met behulp van een celteller. Breng 4 x 10,5 cellen over in een reagensreservoir van 25 ml en voeg media toe voor een totaal volume van 8 ml.
- Om voldoende volume te garanderen om 5000 tumorcellen/putje in 100 μL media te zaaien, moest het volume kunnen worden gepipetteerd met behulp van de meerkanaalspipet, en om het verlies van enkele cellen tijdens stap 1.7 te compenseren, 10%-20% extra cellen en mediavolume voorbereiden.
- Meng de celsuspensie grondig met een serologische pipet van 5 ml. Gebruik een meerkanaalspipet van 100 μl om 100 μl van de celsuspensie in elke rij van de doorzichtige zwarte plaat met platte bodem van 96 putjes op de linkerhelft te pipetteren. Een voorbeeld van een beplatingsstrategie is te vinden in tabel 2.
- Pipetteer EGFR KO-cellen op dezelfde manier op de rechterhelft van de plaat. Zodra de hele plaat is geplateerd, sleept u de plaat heen en weer en van links naar rechts op het platform van de weefselkweekkap om een uniforme verdeling van de tumorcellen in de putjes te garanderen.
- Incubeer de plaat gedurende 4 uur in de incubator bij 37 °C met 5% CO2 zodat de tumorcellen zich kunnen hechten.
3. Co-culturing van CAR die Jurkats tot expressie brengt met CFSE-gelabelde tumorcellen
- Gebruik de tellingen van niet-getransduceerde en CAR-expressieve Jurkat-cellen, breng 4 x 105 cellen van elke CAR-J over in een reservoir van 25 ml. Voeg DMEM-groeimedia toe voor een totaal volume van 2 ml.
- Voor E:T van 4:1 werden 2 x 104 CAR-J per putje toegevoegd in 100 μL media met behulp van een meerkanaalspipet voorzichtig langs de zijkant van elk putje om de aangehechte tumorcellen niet te verstoren.
- Voeg nog eens 100 μL groeimedia toe met behulp van een meerkanaalspipet aan de zijkant van putjes met tumorcellen en Jurkat-cellen. De tumorgroepen krijgen alleen 200 μL media om het totaal van 300 μL media in alle putjes te maken.
- Sleep de plaat langs het platform heen en weer en van links naar rechts om een gelijkmatige verdeling van de Jurkat-cellen op de tumorcellen te garanderen.
- Laat co-cultuur in de incubator toe bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 48 uur.
4. Voorbereiding van de plaat voor beeldvorming
- Maak een oplossing van propidiumjodide (PI) met 1 μg/ml in lage achtergrondfluorescentiemedia op basis van het aantal putjes en elk 100 μL media.
- Bereid voor 84 putjes 9 ml media die PI bevatten. Meng het medium grondig met behulp van een pipet.
- Maak 10 ml 20% Triton-X-oplossing door Triton-X te verdunnen met gedeïoniseerd water. Gooi na 48 uur cocultuur het supernatans met CAR-J weg door een enkele omkering van de plaat en klop op keukenpapier.
- Voeg nu voorzichtig 100 μL van de hierboven voorbereide media (stap 4.2) met PI toe aan elk putje met behulp van een meerkanaalspipet om de aangehechte tumorcellen niet te verstoren.
- Voeg 20 μL 20% Triton-X-oplossing toe aan het eerste putje van elk tumortype, dat functioneert als een totale dode controle.
- Laat het bord 20 minuten in de broedstoof staan. Breng de plaat in beeld met behulp van de fluorescerende beeldvormingscytometer. Gegevens worden opgeslagen op de computer en kunnen op een later tijdstip worden geanalyseerd.
5. Fluorescerende beelden analyseren
- Gebruik een van de tumoren alleen goed van cellen om het groene fluorescerende kanaal in te stellen.
- Verlaag het putmasker tot 98% om de cellen aan de rand van de put te verwijderen, aangezien het signaal aan de rand niet perfect is.
- Identificeer CFSE-gelabelde tumorcellen op het groene, fluorescerende CFSE-kanaal. Wijzig de drempelwaarde van de fluorescentie-intensiteit om alle cellen op de put op te pikken.
- Stel de minimale celdiameter in op 25 μm om vuil te verwijderen dat op het CFSE-kanaal is gedetecteerd. Dit varieert afhankelijk van het celtype dat wordt geanalyseerd.
- Schakel afzonderlijke aanraakobjecten in om individuele cellen te identificeren wanneer ze met elkaar in contact staan.
- Selecteer CFSE op de afbeeldingsweergave en kijk naar de grafische overlay om erachter te komen wat er door het systeem wordt gekozen.
- Zodra CFSE-gelabelde cellen op de juiste manier worden opgepikt, stelt u poorten in om de populatie levende versus dode cellen te definiëren.
- Door de CFSE-gelabelde cellen te selecteren, genereert u een histogram van tellingen op de y-as versus de gemiddelde PI-intensiteit op de x-as.
- Op basis van het putje waar we Triton-X hebben toegevoegd (stap 4.5), teken je een splitter om onderscheid te maken tussen cellen met een lage PI-kleuring en cellen met een hoge PI-kleuring. Deze put zou de meeste cellen in een hoog PI-gekleurd gebied moeten hebben.
OPMERKING: PI toont basaal signaal op levende cellen. Daarom doodt het toevoegen van Triton-X alle cellen en kleuren ze helder in het rode fluorescerende kanaal. Dit vergemakkelijkt het tekenen van poorten om dode cellen van levende cellen te scheiden. - Pas de waarde van de x-as aan om de cellen beter te kunnen bekijken. Label nu de lage PI-gekleurde cellen als levende cellen.
- Als u de levende cellen selecteert, stelt u een ander histogram in met een gebied op de x-as en tellingen op de y-as.
- Teken een andere splitter met behulp van de tumor alleen goed om cellen te vangen en geen puin. Met Jurkat behandelde putten zullen puin gaan ophopen dat CFSE-gekleurd zal zijn en uit de tellingen moet worden verwijderd. De resterende niet-puin worden gelabeld als "Big cells".
- Voer de analyse uit op de hele plaat en exporteer de spreadsheet met de cijfers.
- Zet de grote tellingen uit om het aantal levende CFSE-gelabelde tumorcellen te identificeren dat in de put achterblijft na blootstelling aan CAR-J. Bepaal statistieken met behulp van eenrichtings-ANOVA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een bereik van E:T-verhouding tussen 1:8 en 8:1 voor CAR-J1 werd geëvalueerd na 72 uur, gericht op EGFR op TNBC MDA-MB-231-cellen. Jurkat-cellen werden getransduceerd met CAR-lentivirus met polybreen om CAR-J-cellen te genereren zoals beschreven in stap 2. De cytotoxiciteit van CAR-J1 nam significant toe met een hogere E:T-verhouding zonder verschil in doding bij een verhouding van 1:8 (Figuur 1). Meer dan 50% doden werd waargenomen bij 4:1 E:T gedurende 72 uur. Deze E:T werd gebruikt voor latere experimenten met een duur van 48 uur voor een snelle cytotoxiciteitsevaluatie van meerdere CAR-constructen. EGFR gericht op CAR-constructies waarvan het scharnierdomein is gewijzigd (tabel 1). De 4 verschillende scharnieren die worden gebruikt zijn IgG lang, IgG medium, IgG kort en CD8a zoals hier beschreven13. Deze 3 constructen werden tot expressie gebracht op Jurkat-cellen en CAR-positiviteit bepaald door het percentage vlaggelabelde cellen te evalueren door middel van flowcytometrie (Figuur 2A-D) zoals hier beschreven12. Niet-getransduceerde Jurkat-cellen werden gebruikt als controlegroep om de CAR-expressie te bepalen en de gating-strategie wordt weergegeven in (Figuur 2E). De cytotoxiciteit van deze 4 CAR-constructen die tot expressie werden gebracht op Jurkat-cellen werd geëvalueerd ten opzichte van EGFR-cellen die MDA-MB-231-cellen tot expressie brengen en CRISPR EGFR KO MDA-MB-231-cellen. Antigeenspecifieke doding werd waargenomen door alle constructen (Figuur 3A), terwijl er geen significante doding werd waargenomen tegen EGFR KO-cellen (Figuur 3B), wat suggereert dat het doden specifiek werd gemedieerd door alleen de scFv. Er werd niet gedood door de niet-getransduceerde Jurkat-cellen. Representatieve beelden van het doden van tumoren worden ook getoond waar de overlapping van CFSE-gelabelde tumorcellen met PI-gekleurde dode kern ze geel doet lijken (Figuur 4). De gegevens zijn representatief voor 3 onafhankelijke experimenten met 6 technische replicaten per groep.
Dit werd verder bevestigd door deze CAR-constructen tot expressie te brengen op PBMC-afgeleide CD3 T-cellen. Er is een lage expressie van CAR op CD3 T-cellen, die vervolgens worden verrijkt door steriele flowsortering (Figuur 5). Er was echter geen sprake van een CD8-scharnier dat EGFR CAR bevatte. Vandaar dat de andere 3 CAR-constructen met IgG lang, IgG medium en IgG kort werden geëvalueerd op hun cytotoxisch potentieel tegen MDA-MB-231-cellen. Er is een vergelijkbare trend van doden, waarbij IgG short de minste cytotoxische potentie heeft in vergelijking met de andere 2 constructen (Figuur 6). Om het beste construct tussen IgG lange en IgG medium CAR-T-cellen te identificeren, werd hun activering met en zonder blootstelling aan TNBC-tumorcellen geëvalueerd door intracellulaire kleuring van cytokines zoals eerder beschreven12. MDA-MB-436 heeft lage niveaus van EGFR en MDA-MB-468 heeft de hoogste EGFR-eiwitexpressie op basis van een western blot met een panel van 13 TNBC-cellijnen12. IgG lange CAR-T-cellen hadden de minste basale activeringsniveaus (TNFa, 4-1BB) en een lage afgifte van cytotoxische korrels (perforine en granzyme B)14 zonder enige blootstelling aan tumorcellen (Figuur 7). Bij blootstelling aan MDA-MB-468-cellen met een hoge EGFR-expressie, hadden IgG-lange CAR-T-cellen de hoogste activering op basis van TNFa en 4-1BB.
Figuur 1: EGFR CAR-J1 cytotoxische evaluatie langs een bereik van E:T. CFSE-gelabelde MDA-MB-231 tumorcellen werden geplateerd met niet-getransduceerde Jurkat-cellen of EGFR gericht op CAR-J1 in een E:T-verhouding van 1:8, 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 en 8:1, wat een toenemende cytotoxiciteit met hogere effectorcellen aantoont. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD en statistische significantie werd geëvalueerd met behulp van de t-toets van de student. 1:8 E:T was niet significant, 1:4 E:T had ***p<0,001 en de rest ****p<0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: EGFR CAR Jurkat-productie voor in vitro cytotoxische evaluatie. (A-D) Bijna 90%-100% CAR-expressie van 4 verschillende constructen: CAR IgG lang, CAR IgG medium, CAR IgG kort, CAR CD8a. (E) Poortstrategie voor de bepaling van de positiviteit van de CAR: puin uitgesloten in SSC-A versus FSC-A-plot; Enkele cellen geselecteerd in FSC-H versus FSC-A-plot; en levende cellen geselecteerd op levensvatbaarheidskleurstof DAPI-negatieve gating. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Cytotoxiciteitsevaluatie in co-cultuur van CAR-J en CFSE gelabelde tumorcellen. (A) CFSE-gelabelde MDA MB 231-cellen werden gedurende 48 uur geplateerd met CAR-J in een E:T-verhouding van 4:1, wat een variërende werkzaamheid bij het doden van tumorcellen aantoont. (B) CFSE-gelabelde CRISPR, EGFR, KO, MDA, MB 231-cellen werden door geen van de CAR-J-cellen gedood. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD en statistische significantie werd geëvalueerd met behulp van eenrichtings-ANOVA. **blz<0,01; blz<0,0001; NS: Niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Visuele weergave van beelden na 48 uur co-cultuur. (A) Tumor only groep met CFSE (groen) gelabelde tumorcellen. (B) Toevoeging van niet-getransduceerde Jurkat-cellen met rode bloedcellen als dode Jurkat-cellen en (C) overlay van groen en rood die dode tumorcellen aangeeft (geel) zoals aangegeven door pijlen. Het aantal groene cellen dat niet geel is, wordt gekwantificeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: EGFR CD3 CAR-T-celverrijking. (A-B) CAR-expressie geëvalueerd door het percentage vlagpositieve en IgG-positieve cellen te bepalen vóór verrijking en (C) na verrijking door steriele flowsortering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Cytotoxiciteitsevaluatie in co-cultuur van CD3, CAR-T en CFSE-gelabelde tumorcellen. CFSE-gelabelde MDA MB 231-cellen werden gedurende 48 uur geplateerd met CAR-J in een E:T-verhouding van 4:1, wat een variërende werkzaamheid aantoonde bij het doden van tumorcellen. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD en statistische significantie werd geëvalueerd met behulp van eenrichtings-ANOVA. **blz<0,01; blz<0,0001; NS: Niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: EGFR CD3 CAR-T cel Activering. CAR-T-cellen werden blootgesteld aan tumorcellen en intracellulaire cytokinespiegels voor (A) TNFa, (B) 4-1BB, (C) perforine en (D) granzyme B werden geëvalueerd. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD en de statistische significantie werd geëvalueerd met behulp van eenrichtingsverkeer ANOVA *p<0,05; **blz<0,01; **blz<0,001; blz<0,0001; NS: Niet significant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Nee. van PA EGFR806 scFv | Vh-Vl Linker | Scharnier/afstandhouder | TM | Cytoplasmatisch |
| AUTO IgG Lang | Whitlow (18 aa) | IgG4 EQ CH2 CH3 (229 aa) | CD4 | 4-1BB / CD3Z |
| AUTO IgG Medium | Kanton Whitlow | IgG4 CH3 (129 aa) | CD28 | 4-1BB / CD3Z |
| AUTO IgG Kort | Kanton Whitlow | IgG kort (12 aa) | CD4 | 4-1BB / CD3Z |
| AUTO CD8a | Kanton Whitlow | CD8 (45 aa) | CD8a | 4-1BB / CD3Z |
Tabel 1: CAR-constructieontwerpen. Afkortingen: aa = aminozuren; TM = Transmembraan.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Een | Triton-X | Alleen MDA MB 231 | Triton-X | Alleen MDA MB 231 EGFR KO | ||||||||
| B | MB231 + Mock 4:1 | MB231 EGFR KO + Mock 4:1 | ||||||||||
| C | MB231 + EGFR IgG Lang 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Lang 4:1 | ||||||||||
| D | MB231 + EGFR IgG Medium 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Medium 4:1 | ||||||||||
| E | MB231 + EGFR IgG Kort 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Kort 4:1 | ||||||||||
| F | MB231 + EGFR CD8a 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR CD8a 4:1 | ||||||||||
| G | ||||||||||||
| H | ||||||||||||
Tabel 2: Voorbeeld van een beplatingsstrategie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we een snelle methode voorgesteld om de doelspecifieke cytolytische activiteit geïnduceerd door CAR-expressie in Jurkat-cellen efficiënt te evalueren. Alle CAR-constructen hebben dezelfde scFv, maar verschillende scharnier- en transmembraandomeinen waarvan is aangetoond dat ze de potentie van CAR-T-cellen beïnvloeden13. Verdere evaluatie van niet-specifieke doding door deze CAR-J werd gedaan door ze te kweken met antigeen knock-out (KO) cellen. Dit toont aan dat het doden tumorantigeenspecifiek is en niet het gevolg is van basale activering door de CAR-J. Het cytotoxische potentieel van een reeks E:T-verhoudingen kan eenvoudig worden bepaald, waarbij het minste aantal effectorcellen wordt geïdentificeerd dat nodig is voor het elimineren van tumorcellen op specifieke tijdstippen. Meerdere cellijnen van hetzelfde of een ander kankertype en normale cellen kunnen ook worden gebruikt om de specificiteit van deze constructen te evalueren. De krachtigste kandidaten die door het CAR-J-platform worden geïdentificeerd, kunnen vervolgens verder worden gekarakteriseerd door CAR tot expressie te brengen op PBMC-afgeleide CD3 T-cellen en vergelijkbare dodingstests uit te voeren en uitputting en activering te evalueren bij blootstelling aan antigeenpositieve en negatieve tumorcellen.
Opgemerkt moet worden dat Jurkat-cellen CD4+-cellen zijn met een veranderde T-celreceptor (TCR)-signaleringsroute15. Daarom zou intracellulaire signaaldomeinoptimalisatie van CAR-constructen idealiter moeten worden gedaan met CD3 T-cellen16 en werkt dit mogelijk niet het beste met Jurkat-cellen. Interessant is dat CD4 T-cellen cytotoxiciteit vertonen, zoals aangetoond in een eerdere publicatie waarin EGFR gericht op CD4 CAR-T-cellen met een lang IgG-scharnier in staat zijn om TNBC-tumoren volledig uit te roeien in een intracraniaal tumormodel12. Bovendien vertonen CD4 CAR T-cellen een langdurige potentie en een betere doding in vergelijking met een mengsel van CD4- en CD8-T-cellen of CD8 T-cellen alleen in het GBM-tumormodel, waardoor ze klinisch belangrijke T-cellen subset zijn voor effectieve CAR-T-therapie17.
Jurkat-cellen produceren IL2 en reguleren CD69 bij activering, hoewel ze niet alle cytokines van primaire T-celactivering afscheiden 8,18. Het evalueren van IL2- en CD69-niveaus informeert echter over de activering van de Jurkat-cellen en niet over de directe cytolyse van doelcellen die met deze benadering worden gekwantificeerd in absolute tumorcelaantallen. Evaluatie van cytotoxiciteit en activering is echter belangrijk om de effecten van nieuwe CAR-moleculen volledig te begrijpen.
De duur van de co-cultuur in dit experiment kan worden aangepast op basis van de gebruikte constructen. CFSE-etikettering op tumorcellen bleek detecteerbaar te zijn tot 4 dagen na plating. Om een hoge signaal-ruisverhouding te bereiken, werden daarom binnen 72 uur experimenten uitgevoerd. Aangezien de intensiteit van CFSE afneemt bij de deling van tumorcellen, kan het nodig zijn om de hoeveelheid gebruikte CFSE en de duur te veranderen volgens de gebruikte tumorcellen. Aangezien dit een experiment met hoge doorvoer is om meerdere constructen tegelijk te analyseren, moet ook de zaaidichtheid van doelcellen in een plaat met 96 putjes worden geoptimaliseerd. Doelcellen moeten zo worden onderhouden dat ze aan het einde van de test niet overconfluent groeien of een competitieve groeibeperking hebben zonder dat van medium hoeft te worden gewisseld om elke interventie tot een minimum te beperken. Grotere putplaten kunnen worden gebruikt om meer cellen te huisvesten en de levensduur van het experiment te verlengen. De afbeeldingen moeten echter worden samengevoegd om een volledig beeld van de put te krijgen en elke put moet afzonderlijk worden bewerkt, waardoor het mogelijk niet snel en hoog is.
Een andere benadering van het langdurig fluorescerend labelen van tumorcellen is door lentivirale transductie met groen fluorescerend eiwit (GFP) of rood fluorescerend eiwit (RFP). De juiste klonale selectie moet worden gedaan om sterk verrijkte (bijna 100%) helderste kolonies te selecteren voor de beste signaal-ruisverhouding. De levensvatbaarheidskleurstof moet op de juiste manier worden geselecteerd op basis van de fluorescentiedetectoren in het beeldvormingsinstrument.
Achtergrondfluorescentie is afhankelijk van het gebruikte medium en moet daarom worden gecontroleerd om signaalverlies tijdens het verkrijgen van beelden te voorkomen. Gewone media bevatten componenten die bij opwinding een aanzienlijke fluorescentie uitzenden. Het wordt aanbevolen om media met een lage achtergrondte gebruiken 19. PBS kan worden gebruikt, maar het kan de cellen beïnvloeden tijdens het verkrijgen van afbeeldingen, aangezien het ongeveer 20 minuten duurt om afbeeldingen te verkrijgen, afhankelijk van de instellingen die zijn ingesteld voor het vastleggen van afbeeldingen.
Een van de beperkingen van deze test is dat het niet mogelijk is om op meerdere tijdstippen beelden te maken van dezelfde plaat met 96 putjes na het toevoegen van een levensvatbaarheidskleurstof. Het effect van toevoeging van PI over lange tijd werd niet geëvalueerd voor deze publicatie. Het zou echter ideaal zijn om levende en dode/stervende doelcellen gedurende een periode te kunnen detecteren met behulp van dezelfde plaat. Het kan moeilijk zijn om individuele cellen te scheiden als cellen te veel samenvloeien. Het gebied van de monolaag van de cel en de fluorescentie-intensiteit kunnen worden gebruikt om het percentage levende/dode cellen te vergelijken, zoals beschreven20.
Alternatieve methoden die worden gebruikt om cytolyse door CAR-T-cellen te detecteren, meten niet rechtstreeks het absolute aantal dode en levende cellen, maar evalueren de potentie met behulp van indirecte methoden die elders in detail worden beschreven 4,5. Deze methode geeft dus een absoluut overzicht van effectorcellen en kan ook worden gebruikt in co-kweek van 3 celtypen, afhankelijk van de capaciteit van het beeldvormingsinstrument. Er zijn maar heel weinig cellen nodig (5000 per putje) die kunnen veranderen, samen met de vrijheid om een tijdstip te kiezen, wat enorme voordelen zijn van het gebruik van deze test. Doelcellen in suspensie en in 3-dimensionale sferoïde cultuur kunnen ook worden gebruikt in kweek met effectorcellen en cytolyse bepaald zoals elders beschreven21. Bovendien kan dit platform worden gebruikt om grote bibliotheken van kleine moleculen en verbindingen te screenen om de meest effectieve moleculen af te bakenen en kunnen meerdere doseringen op meerdere tijdstippen worden gedaan.
Naast de snelheid en de flexibiliteit van het systeem, is het uiteindelijke voordeel dat van de kosten. De fluorescerende beeldvormingsmachine, platen en reagentia zijn allemaal gebruikelijk en betaalbaar om aan te schaffen, vooral in vergelijking met apparaten die geavanceerder zijn en zelfs edelmetalen kunnen gebruiken in hun platen voor eenmalig gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
MDA-MB-231 was een vriendelijk geschenk van Dr. Shane Stecklein. De auteurs erkennen financiering van het University of Kansas Cancer Center om dit onderzoek uit te voeren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Methods in Cell Biology. 167, Academic Press. 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D. Jr, Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis. , https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023).
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
