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Cancer Research

रैपिड इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग करके जुर्काट व्यक्त चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर का मूल्यांकन

Published: October 27, 2023 doi: 10.3791/65560
Automatic Translation
*1,2,3, *1, 4, 2, 1, 4,5,6, 1,2,3
1Department of Radiation Oncology, University of Kansas Cancer Center, 2Department of Cancer Biology, University of Kansas Cancer Center, 3BioEngineering Program, University of Kansas, 4Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Kansas Medical Center, 5University of Kansas Cancer Center, 6Kansas Institute for Precision Medicine, University of Kansas Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

जुर्काट कोशिकाओं द्वारा मात्रात्मक ट्यूमर सेल हत्या का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल, जो एकल ट्यूमर एंटीजन को लक्षित करने वाले काइमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) को व्यक्त करता है". इस प्रोटोकॉल का उपयोग परिधीय रक्त-व्युत्पन्न टी कोशिकाओं में पुष्टि से पहले कार काज निर्माणों के तेजी से अनुकूलन के लिए एक स्क्रीनिंग प्लेटफॉर्म के रूप में किया जा सकता है।

Abstract

काइमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी कोशिकाएं ऑन्कोलॉजी में सबसे आगे हैं। एक सीएआर का निर्माण एक लक्ष्यीकरण डोमेन (आमतौर पर एक एकल श्रृंखला चर टुकड़ा, एससीएफवी) से किया जाता है, जिसमें एक इंट्रा-चेन लिंकर होता है, जिसके बाद एक काज, ट्रांसमेम्ब्रेन और कॉस्टिमुलेटरी डोमेन होता है। इंट्रा-चेन लिंकर और काज डोमेन के संशोधन से सीएआर-मध्यस्थता हत्या पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है। सीएआर निर्माण के प्रत्येक भाग के लिए कई अलग-अलग विकल्पों को ध्यान में रखते हुए, बड़ी संख्या में क्रमपरिवर्तन हैं। CAR-T सेल बनवणे हा एक वेळ घेतने आणि महँगी प्रक्रिया आहे, आणि अनेक निर्माणे करणे आणि चाचणी करणे एक भारी वेळ आणि मॅटेरियल गुंतवणूक आहे. यह प्रोटोकॉल जुर्काट कोशिकाओं (सीएआर-जे) में काज-अनुकूलित कार निर्माणों का तेजी से मूल्यांकन करने के लिए एक मंच का वर्णन करता है। जुर्काट कोशिकाएं उच्च लेंटवायरस तेज के साथ एक अमर टी सेल लाइन हैं, जो कुशल सीएआर पारगमन की अनुमति देती हैं। यहां, हम फ्लोरोसेंट इमेजर का उपयोग करके कार-जे का तेजी से मूल्यांकन करने के लिए एक मंच प्रस्तुत करते हैं, इसके बाद पीबीएमसी व्युत्पन्न टी कोशिकाओं में साइटोलिसिस की पुष्टि होती है।

Introduction

CAR-T सेल थेरापाईले हेमटोलॉजिकल विकृतींमध्ये खूप वादाखिलाफी दर्शविले आहे, 6 पासून स्पष्ट 2017 पासून FDA-मंजूर CAR-T उत्पादनांत, जैसा कि राष्ट्रीय कैंसर संस्थान1 द्वारा रिपोर्ट किया गया है. ठोस ट्यूमर को लक्षित करने के लिए नैदानिक परीक्षणों में कई CAR-T कोशिकाएं हैं। इंजीनियरिंग उपन्यास सीएआर लक्ष्य और कार निर्माण का अनुकूलन एक सीएआर-टी सेल की प्रभावकारिता के लिए महत्वपूर्ण है। प्रत्येक आवेदन के लिए आदर्श कार निर्माण का चयन ट्यूमर जुड़े एंटीजन (टीएए) के सटीक लक्ष्यीकरण के लिए आवश्यक है, जबकि सामान्य ऊतकों2 में टीएए अभिव्यक्ति के निम्न स्तर से परहेज.

एक सीएआर निर्माण मुख्य रूप से पांच डिब्बों से बना है: (1) बाह्य एकल श्रृंखला चर टुकड़ा (scFv) ट्यूमर प्रतिजन को लक्षित डोमेन; (2) काज डोमेन; (3) ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन; (4) इंट्रासेल्युलर साइटोप्लाज्मिक टी सेल कॉस्टिमुलेटरी डोमेन; और (5) सिग्नलिंग डोमेन। यी डोमेनहरू प्रत्येक संशोधन यसको लक्ष्य सेल3 सँग संलग्न CAR-T सेलको सटीकता प्रभावित गर्दछ। इसलिए, इन विट्रो में इन कार निर्माणों के साइटोटॉक्सिसिटी और क्रॉस-रिएक्टिविटी का मूल्यांकन विवो प्रयोगों में प्रगति के लिए सही निर्माण का चयन करना महत्वपूर्ण है। टी कोशिकाओं द्वारा साइटोलिसिस के मूल्यांकन के वर्तमान तरीकों में 51सीआर रिलीज परख, लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज रिलीज परख, बायोलुमिनसेंट इमेजिंग परख, वास्तविक समय प्रतिबाधा-आधारित सेल विश्लेषण और सेल-आधारित प्रवाह साइटोमेट्री परख 4,5 शामिल हैं। यहां वर्णित फ्लोरोसेंट इमेजिंग-आधारित प्लेटफॉर्म जीवित बनाम मृत कोशिकाओं की संख्या की पहचान करता है, जो टी कोशिकाओं द्वारा साइटोलिसिस के मूल्यांकन की अप्रत्यक्ष विधि के विपरीत टी सेल साइटोलिसिस का प्रत्यक्ष परिमाणीकरण है।

एमडीए-एमबी -231 ट्रिपल-नेगेटिव स्तन कैंसर (टीएनबीसी) कोशिकाओं के खिलाफ एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) सीएआर व्यक्त करने वाली जुर्काट कोशिकाओं की साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन करने के लिए न्यूनतम हस्तक्षेप के साथ यहां एक आसान, लागत-कुशल, तेजी से और उच्च थ्रूपुट तकनीक है और ईजीएफआर सीआरआईएसपीआर एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं को खटखटाता है। जुर्काट कोशिकाएं अमर मानव टी लिम्फोसाइट कोशिकाएंहैं 6 जिनका व्यापक रूप से टी सेल सक्रियण और सिग्नलिंग तंत्र7 का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है। इसके अलावा, Jurkat कोशिकाओं कई अध्ययन 8,9,10,11 में इन विट्रो कार परीक्षण में के लिए इस्तेमाल किया गया है. जुर्काट कोशिकाओं को आसानी से लेंटवायरस द्वारा ट्रांसड्यूस किया जाता है और निरंतर प्रसार होता है, और इस प्रणाली का लाभ विभिन्न ईजीएफआर कार निर्माणों के काज डोमेन को अनुकूलित करने के लिए उठाया गया था।

इस परख स्क्रीनिंग कई कार विभिन्न ट्यूमर प्रतिजनों को लक्षित निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और कई पक्षपाती ट्यूमर सेल लाइनों के खिलाफ और ट्यूमर (ई: टी) अनुपात के लिए विभिन्न प्रभावक में इस्तेमाल किया. इसके अतिरिक्त, कई समय बिंदुओं का मूल्यांकन किया जा सकता है, और विभिन्न सीएआर निर्माणों के बीच सर्वश्रेष्ठ हत्या की पहचान करने के लिए प्रतिकृतियों की संख्या को संशोधित किया जा सकता है। परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMCs) व्युत्पन्न CD3 T कोशिकाओं का उपयोग करके सर्वोत्तम निर्माणों की पुष्टि करने की आवश्यकता है। इस पद्धति को विकसित करने के पीछे समग्र लक्ष्य कम पारगमन दक्षता जैसी बाधाओं पर काबू पाने के लिए उच्च थ्रूपुट तरीके से सीएआर काज ज्यामिति को तेजी से अनुकूलित करना है, इसके बाद पीबीएमसी व्युत्पन्न टी कोशिकाओं में पुष्टि होती है।

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Protocol

नोट: सभी सेल संस्कृति का काम एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और मानक सड़न रोकनेवाला तकनीकों के साथ जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाता है।

1. CAR व्यक्त Jurkats उत्पन्न (CAR-J)

  1. जुर्काट सेल खरीदें, एटीसीसी से ई 6-1 क्लोन करें। एक टी -75 फ्लास्क में 1 x 106 कोशिकाओं को पिघलाएं और उन्हें टी -75 फ्लास्क में संस्कृति दें। रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (आरपीएमआई) मीडिया का उपयोग करके एमएल प्रति 0.6 एक्स 106 कोशिकाओं पर निलंबन में उन्हें बनाए रखें, 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में 10% एफबीएस के साथ पूरक है।
  2. प्लेट 1 x 105 जुर्काट कोशिकाएं एक टिशू कल्चर के प्रति अच्छी तरह से आरपीएमआई ग्रोथ मीडिया के 500 माइक्रोन में 24 अच्छी प्लेट का इलाज करती हैं जिसमें 4 माइक्रोग्राम / एमएल पॉलीब्रेन होता है जो लेंटिवायरल दक्षता को बढ़ाता है। एक लेजर आधारित फ्लोरोसेंट डिटेक्शन बेंच टॉप सेल विश्लेषक का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। कुओं की संख्या मूल्यांकन किए जाने वाले निर्माणों की संख्या पर निर्भर करती है। यह उदाहरण 4 निर्माणों और एक अन-ट्रांसड्यूड नियंत्रण का उपयोग करेगा। कार निर्माण डिजाइन तालिका 1 में दिखाया गया है।
  3. प्रत्येक कार निर्माण के लेंटवायरस / कुएं के 10 माइक्रोन जोड़ें। कार निर्माण डिजाइन और लेंटवायरस उत्पादन पहलेवर्णित 12 के रूप में किया गया था।
  4. अगले दिन प्रत्येक अच्छी तरह से विकास RPMI मीडिया के 1 एमएल जोड़ने के लिए और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में संवर्धन जारी है.
  5. कोशिकाओं 2 दिन बाद (Jurkat पारगमन के बाद कुल 72 घंटे) ले लीजिए और उन्हें गिनती.
  6. जुर्काट कोशिकाओं पर सीएआर अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए प्रवाह चलाने के लिए 1 x 104 सेल लें। संक्षेप में, 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए कार सकारात्मकता का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले ध्वज टैग को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी के साथ कार-जे को लेबल करने से पहले एफएसीएस धुंधला समाधान (एफएसएस) के साथ कोशिकाओं को 2x धो लें। एफएसएस के साथ फिर से 2x धो लें और एक प्रवाह साइटोमीटर के माध्यम से कोशिकाओं को चलाने के रूप में पहले12 वर्णित है. निर्माता द्वारा अनुशंसित एंटीबॉडी एकाग्रता का उपयोग करें।
  7. जुर्काट कोशिकाओं को आसानी से ट्रांसड्यू किया जाता है और लगभग हमेशा > 90% कार अभिव्यक्ति दिखाते हैं। सह-संस्कृति साइटोटॉक्सिसिटी परख से पहले लंबे समय तक कार-जे का उत्पादन करें और बाद में उपयोग के लिए फ्रीज करें।

2. चढ़ाना CFSE लेबल ट्यूमर कोशिकाओं

नोट: एमडीए-एमबी -231 (एटीसीसी, एचटीबी -26 से) कोशिकाएं एक सहयोगी से एक उपहार थीं, और ईजीएफआर केओ एमडीए-एमबी -231 को पहले वर्णित12 के रूप में बनाया गया था।

  1. एक टी -75 फ्लास्क में 1 x 106 कोशिकाओं को पिघलाएं और उन्हें टी -75 फ्लास्क में संस्कृति दें। एमडीए-एमबी -231 ट्यूमर कोशिकाओं और सीआरआईएसपीआर ईजीएफआर केओ एमडीए-एमबी -231 ट्यूमर कोशिकाओं को डुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के 14 एमएल में बनाए रखें, 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक और लगभग 70% संगम होने पर विभाजित करें।
  2. लगभग 70% संगम सुनिश्चित करने के लिए नियमित ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के तहत पक्षपाती ट्यूमर कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
  3. एक सीरोलॉजिकल विंदुक का उपयोग फ्लास्क से विकास मीडिया निकालें. T75 फ्लास्क में ट्रिप्सिन के 3 एमएल जोड़ें और फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग करने के लिए 3-5 मिनट के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें।
  4. विकास मीडिया के बराबर राशि (3 एमएल) का उपयोग करके ट्रिप्सिन को बेअसर करें। एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में सेल निलंबन लीजिए और कोशिकाओं नीचे गोली करने के लिए 4 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर कोशिकाओं नीचे स्पिन.
  5. एक विंदुक का उपयोग सतह पर तैरनेवाला त्यागें और फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 2 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। सेल काउंटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता का निर्धारण करें।
  6. 8 x 105 कोशिकाओं को एक और 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे 1 एमएल की मात्रा में बनाने के लिए पीबीएस जोड़ें।
  7. प्रत्येक ट्यूब में कार्बोक्सीफ्लोरेसिन सक्सिनिमिडिल एस्टर (सीएफएसई; 5 माइक्रोन स्टॉक एकाग्रता) के 2 माइक्रोन जोड़ें और 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह मिलाएं।
  8. 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में 20 मिनट के लिए सीएफएसई के साथ कोशिकाओं को सेते हैं। 20 मिनट के बाद इनक्यूबेटर से ट्यूबों निकालें और ट्यूब में विकास मीडिया के 5 एमएल जोड़ें।
  9. सीएफएसई लेबल कोशिकाओं नीचे गोली करने के लिए 4 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र. एक विंदुक का उपयोग सतह पर तैरनेवाला त्यागें और कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए ताजा मीडिया के 1 एमएल जोड़ें.
  10. एक सेल काउंटर का उपयोग सेल एकाग्रता का पुनर्मूल्यांकन. 4 x 105 कोशिकाओं को 25 एमएल अभिकर्मक जलाशय में स्थानांतरित करें और 8 एमएल की कुल मात्रा के लिए मीडिया जोड़ें।
    1. मीडिया के 100 माइक्रोन में बीज 5000 ट्यूमर कोशिकाओं/अच्छी तरह से करने के लिए पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने के लिए, मल्टीचैनल विंदुक का उपयोग कर विंदुक करने में सक्षम होने के लिए आवश्यक मात्रा, और चरण 1.7 के दौरान कुछ कोशिकाओं के नुकसान की भरपाई करने के लिए, 10% -20% अतिरिक्त कोशिकाओं और मीडिया मात्रा तैयार करें।
  11. अच्छी तरह से एक 5 एमएल सीरोलॉजिकल विंदुक का उपयोग सेल निलंबन मिश्रण. एक 100 माइक्रोन मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, बाएं आधे पर स्पष्ट फ्लैट नीचे काले 96 अच्छी तरह से प्लेट की प्रत्येक पंक्ति में सेल निलंबन के पिपेट 100 माइक्रोन। एक नमूना चढ़ाना रणनीति तालिका 2 में पाया जा सकता है.
  12. पिपेट ईजीएफआर केओ कोशिकाओं इसी तरह थाली के दाहिने आधे हिस्से पर. एक बार पूरी थाली चढ़ाया है, कुओं में ट्यूमर कोशिकाओं की एक समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए टिशू कल्चर हुड मंच पर आगे और पीछे और पक्ष करने के लिए थाली खींचें.
  13. ट्यूमर कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।

3. सह-संवर्धन कार CFSE लेबल ट्यूमर कोशिकाओं के साथ Jurkats व्यक्त

  1. संयुक्त राष्ट्र transduced और कार जुर्काट कोशिकाओं व्यक्त की गिनती का उपयोग करना, एक 25 एमएल जलाशय में प्रत्येक CAR-J के 4 x 105 कोशिकाओं हस्तांतरण. 2 एमएल की कुल मात्रा के लिए डीएमईएम विकास मीडिया जोड़ें।
  2. ई: टी के लिए 4: 1, 2 एक्स 104 सीएआर-जे को प्रत्येक कुएं के किनारे धीरे से मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके मीडिया के 100 माइक्रोन में अच्छी तरह से जोड़ा गया ताकि ट्यूमर कोशिकाओं को परेशान न किया जा सके।
  3. ट्यूमर कोशिकाओं और जुर्काट कोशिकाओं वाले कुओं के पक्ष में एक मल्टीचैनल विंदुक का उपयोग करके विकास मीडिया का एक और 100 माइक्रोन जोड़ें। ट्यूमर केवल समूहों को सभी कुओं में मीडिया के कुल 300 माइक्रोन बनाने के लिए मीडिया के 200 माइक्रोन मिलते हैं।
  4. ट्यूमर कोशिकाओं पर जुर्काट कोशिकाओं के समान वितरण को सुनिश्चित करने के लिए आगे और पीछे और साइड गति में मंच के साथ प्लेट खींचें।
  5. 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में सह संस्कृति की अनुमति दें।

4. इमेजिंग के लिए प्लेट की तैयारी

  1. कुओं की संख्या के आधार पर कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मीडिया में 1 माइक्रोग्राम / एमएल पर प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) का समाधान करें और प्रत्येक को मीडिया के 100 माइक्रोन प्राप्त करें।
  2. 84 कुओं के लिए पीआई युक्त मीडिया के 9 एमएल तैयार करते हैं। एक विंदुक का उपयोग कर मीडिया को अच्छी तरह मिलाएं।
  3. विआयनीकृत पानी के साथ ट्राइटन-एक्स को पतला करके 20% ट्राइटन-एक्स समाधान के 10 एमएल बनाएं। सह संस्कृति के 48 घंटे के बाद, थाली के एक भी उलटा और कागज तौलिया पर दोहन से CAR-J युक्त सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  4. अब ऊपर तैयार मीडिया (चरण 4.2) के 100 माइक्रोन जोड़ें जिसमें पीआई प्रत्येक अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल विंदुक का उपयोग करके धीरे से शामिल है ताकि पालन किए गए ट्यूमर कोशिकाओं को परेशान न करें।
  5. प्रत्येक ट्यूमर प्रकार के पहले कुएं में 20% ट्राइटन-एक्स समाधान के 20 माइक्रोन जोड़ें जो कुल मृत नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।
  6. 20 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में थाली छोड़ दें. फ्लोरोसेंट इमेजिंग साइटोमीटर का उपयोग करके प्लेट की छवि बनाएं। डेटा कंप्यूटर पर संग्रहीत किया जाता है और बाद में इसका विश्लेषण किया जा सकता है।

5. फ्लोरोसेंट छवियों का विश्लेषण

  1. हरे फ्लोरोसेंट चैनल सेट करने के लिए कोशिकाओं के केवल अच्छी तरह से ट्यूमर में से एक का उपयोग करें.
  2. अच्छी तरह से अच्छी तरह से के किनारे पर कोशिकाओं को हटाने के लिए 98% करने के लिए अच्छी तरह से मुखौटा घटाएं क्योंकि संकेत किनारे पर सही नहीं है।
  3. हरे, फ्लोरोसेंट सीएफएसई चैनल पर सीएफएसई लेबल ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान करें। अच्छी तरह से पर सभी कोशिकाओं को लेने के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता सीमा मूल्य को संशोधित करें.
  4. सीएफएसई चैनल पर पाए गए किसी भी मलबे को हटाने के लिए न्यूनतम सेल व्यास को 25 माइक्रोन पर सेट करें। यह विश्लेषण किए गए सेल प्रकार के आधार पर भिन्न होता है।
  5. अलग-अलग कोशिकाओं की पहचान करने के लिए अलग-अलग स्पर्श वस्तुओं को सक्षम करें जब वे एक दूसरे के संपर्क में हों।
  6. छवि प्रदर्शन पर सीएफएसई का चयन करें और सिस्टम द्वारा क्या उठाया जा रहा है, यह पता लगाने के लिए ग्राफिक ओवरले देखें।
  7. एक बार सीएफएसई लेबल कोशिकाओं को ठीक से उठाया जा रहा है, लाइव बनाम मृत कोशिका आबादी को परिभाषित करने के लिए गेट्स सेट करें।
  8. सीएफएसई लेबल कोशिकाओं का चयन, वाई-अक्ष बनाम मतलब पीआई तीव्रता पर x-अक्ष पर मायने रखता है का एक हिस्टोग्राम उत्पन्न करें.
  9. अच्छी तरह से जहां हम ट्राइटन-एक्स (चरण 4.5) जोड़ा के आधार पर, कम पीआई दाग बनाम उच्च पीआई दाग कोशिकाओं अंतर करने के लिए एक फाड़नेवाला आकर्षित. इस अच्छी तरह से एक उच्च पीआई दाग क्षेत्र में कोशिकाओं के सबसे होना चाहिए.
    नोट: पीआई जीवित कोशिकाओं पर बेसल संकेत दिखाता है। इसलिए, ट्राइटन-एक्स जोड़ने से सभी कोशिकाएं मर जाती हैं और वे लाल फ्लोरोसेंट चैनल में उज्ज्वल हो जाते हैं। यह जीवित कोशिकाओं से मृत कोशिकाओं को अलग करने के लिए द्वार खींचने की सुविधा प्रदान करता है।
  10. कक्षों को देखने में बेहतर रूप से सक्षम होने के लिए x-अक्ष मान समायोजित करें. अब लाइव कोशिकाओं के रूप में कम पीआई सना हुआ कोशिकाओं लेबल.
  11. लाइव कोशिकाओं का चयन करते हुए, x-अक्ष पर क्षेत्र के साथ एक और हिस्टोग्राम सेट करें और y-अक्ष पर गिना जाता है।
  12. कोशिकाओं को पकड़ने के लिए केवल अच्छी तरह से ट्यूमर का उपयोग करके एक और फाड़नेवाला ड्रा करें और मलबे को नहीं। जुर्काट उपचारित कुएं मलबे को जमा करना शुरू कर देंगे जो सीएफएसई दाग होंगे और उन्हें गिनती से हटाने की आवश्यकता होगी। शेष गैर-मलबे को "बड़ी कोशिकाओं" के रूप में लेबल किया जाता है।
  13. पूरी प्लेट पर विश्लेषण चलाएं और संख्याओं वाली स्प्रेडशीट निर्यात करें।
  14. CAR-J के संपर्क में आने के बाद अच्छी तरह से शेष जीवित CFSE लेबल ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या की पहचान करने के लिए बिग मायने रखता है। वन-वे एनोवा का उपयोग करके आंकड़े निर्धारित करें।

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Representative Results

CAR-J1 के लिए 1:8 और 8:1 के बीच E: T अनुपात की एक सीमा का मूल्यांकन 72 घंटे में किया गया था जिसने TNBC MDA-MB-231 कोशिकाओं पर EGFR को लक्षित किया था। Jurkat कोशिकाओं को चरण 2 में वर्णित CAR-J कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए पॉलीब्रेन के साथ CAR लेंटवायरस के साथ ट्रांसड्यू किया गया था। कार-जे 1 की साइटोटॉक्सिसिटी उच्च ई: टी अनुपात के साथ 1: 8 अनुपात (चित्रा 1) पर हत्या में कोई अंतर नहीं है। 50% से अधिक हत्या 4: 1 ई: टी 72 घंटे से अधिक देखी गई थी। इस ई: टी कई कार निर्माणों के तेजी से साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन के लिए 48 घंटे तक की अवधि के साथ बाद के प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था। संशोधित काज डोमेन के साथ सीएआर निर्माणों को लक्षित करने वाले ईजीएफआर को डिजाइन किया गया था (तालिका 1)। उपयोग किए जाने वाले 4 अलग-अलग टिका आईजीजी लंबे, आईजीजी माध्यम, आईजीजी लघु और सीडी 8 ए हैं जैसा कि यहांवर्णित है 13. इन 3 निर्माणों को जुर्काट कोशिकाओं और सीएआर सकारात्मकता पर व्यक्त किया गया था, जो प्रवाह साइटोमेट्री(चित्रा 2ए-डी)द्वारा फ्लैग टैग कोशिकाओं के प्रतिशत का मूल्यांकन करके निर्धारित किया गया था, जैसा कि यहां12 वर्णित है। संयुक्त राष्ट्र ट्रांसड्यूड जुर्काट कोशिकाओं को सीएआर अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए नियंत्रण समूह के रूप में इस्तेमाल किया गया था और गेटिंग रणनीति (चित्रा 2ई) में दिखाया गया है। जुर्काट कोशिकाओं पर व्यक्त इन 4 सीएआर निर्माणों की साइटोटॉक्सिसिटी का मूल्यांकन ईजीएफआर के खिलाफ एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं और सीआरआईएसपीआर ईजीएफआर केओ एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं के खिलाफ किया गया था। एंटीजन विशिष्ट हत्या सभी निर्माणों (चित्रा 3 ए) द्वारा देखी गई थी, जबकि ईजीएफआर केओ कोशिकाओं(चित्रा 3बी)के खिलाफ कोई महत्वपूर्ण हत्या नहीं देखी गई थी, यह सुझाव देते हुए कि हत्या विशेष रूप से केवल एससीएफवी के माध्यम से मध्यस्थता की गई थी। अन-ट्रांसड्यूस्ड जुर्कट कोशिकाओं द्वारा कोई हत्या नहीं की गई थी। ट्यूमर की हत्या की प्रतिनिधि छवियां भी दिखाई जाती हैं जहां पीआई-दाग वाले मृत नाभिक के साथ सीएफएसई लेबल ट्यूमर कोशिकाओं के ओवरलैप उन्हें पीले रंग (चित्रा 4) दिखाई देते हैं। डेटा प्रति समूह 6 तकनीकी प्रतिकृतियों के साथ 3 स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधि है।

पीबीएमसी व्युत्पन्न सीडी 3 टी कोशिकाओं पर इन सीएआर निर्माणों को व्यक्त करके इसकी पुष्टि की गई। सीडी 3 टी कोशिकाओं पर सीएआर की कम अभिव्यक्ति है जो तब बाँझ प्रवाह छँटाई (चित्रा 5) द्वारा समृद्ध होती है। हालांकि, ईजीएफआर कार युक्त सीडी 8 काज की कोई अभिव्यक्ति नहीं थी। इसलिए आईजीजी लंबे, आईजीजी माध्यम और आईजीजी शॉर्ट वाले अन्य 3 सीएआर निर्माणों का मूल्यांकन एमडीए-एमबी -231 कोशिकाओं के खिलाफ उनकी साइटोटोक्सिक क्षमता के लिए किया गया था। आईजीजी शॉर्ट के साथ मारने की एक समान प्रवृत्ति है जिसमें अन्य 2 निर्माणों (चित्रा 6) की तुलना में कम से कम साइटोटोक्सिक शक्ति होती है। आईजीजी लंबे और आईजीजी माध्यम सीएआर-टी कोशिकाओं के बीच सबसे अच्छा निर्माण की पहचान करने के लिए, टीएनबीसी ट्यूमर कोशिकाओं के संपर्क में और बिना उनकी सक्रियता का मूल्यांकन साइटोकिन्स के इंट्रासेल्युलर धुंधला द्वारा किया गया था जैसा कि पहले12 वर्णित है। एमडीए-एमबी-436 में ईजीएफआर का निम्न स्तर है और एमडीए-एमबी-468 में 13 टीएनबीसी सेल लाइनों12 के पैनल के साथ पश्चिमी धब्बा पर आधारित उच्चतम ईजीएफआर प्रोटीन अभिव्यक्ति है। आईजीजी लंबे सीएआर-टी कोशिकाओं में ट्यूमर कोशिकाओं(चित्रा 7)के किसी भी संपर्क के बिना कम से कम बेसल सक्रियण स्तर (टीएनएफए, 4-1बीबी) और साइटोटोक्सिक ग्रैन्यूल (पेरफोरिन और ग्रैनजाइम बी)14की कम रिलीज थी। उच्च ईजीएफआर व्यक्त एमडीए-एमबी -468 कोशिकाओं के संपर्क में, आईजीजी लंबी सीएआर-टी कोशिकाओं में टीएनएफए और 4-1 बीबी के आधार पर उच्चतम सक्रियण था।

Figure 1
चित्रा 1: ईजीएफआर सीएआर-जे 1 साइटोटोक्सिक मूल्यांकन ई: टी की एक सीमा के साथ। CFSE MDA-MB-231 ट्यूमर कोशिकाओं लेबल संयुक्त राष्ट्र transduced जुरकाट कोशिकाओं या ई: 1 के टी अनुपात में CAR-J1 लक्ष्यीकरण EGFR के साथ चढ़ाया गया: 8, 1: 4, 1: 2, 1: 1, 2: 1, 4: 1 और 8: 1 उच्च प्रभावक कोशिकाओं के साथ बढ़ती cytotoxicity दिखा रहा है. डेटा को एसडी ± मतलब के रूप में दर्शाया गया है और छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन किया गया था। 1:8 ई: टी गैर-महत्वपूर्ण था, 1: 4 ई: टी में *** पी<0.001 था, और बाकी **** पी<0.0001। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: इन विट्रो साइटोटॉक्सिक मूल्यांकन के लिए ईजीएफआर कार जुर्काट उत्पादन। (ए-डी) 4 अलग-अलग निर्माणों की लगभग 90% -100% CAR अभिव्यक्ति CAR IgG लांग, CAR IgG माध्यम, CAR IgG लघु, CAR CD8a। (ई) सीएआर सकारात्मकता निर्धारण के लिए गेटिंग रणनीति: एसएससी-ए बनाम एफएससी-ए प्लॉट में मलबे को बाहर रखा गया है; FSC-H बनाम FSC-A प्लॉट में चयनित एकल सेल; और व्यवहार्यता डाई DAPI नकारात्मक गेटिंग द्वारा चयनित लाइव कोशिकाएं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सीएआर-जे और सीएफएसई लेबल ट्यूमर कोशिकाओं के सह-संस्कृति में साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन। (ए) सीएफएसई लेबल एमडीए एमबी 231 कोशिकाओं को 4: 1 ई: टी अनुपात में 48 घंटे के लिए कार-जे के साथ चढ़ाया गया था, जो ट्यूमर सेल की हत्या में अलग-अलग प्रभावकारिता दिखा रहा था। (बी) सीएफएसई लेबल सीआरआईएसपीआर ईजीएफआर केओ एमडीए एमबी 231 कोशिकाओं ने सीएआर-जे कोशिकाओं में से किसी भी हत्या का अनुभव नहीं किया। डेटा को एसडी ± मतलब के रूप में दर्शाया गया है और सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके किया गया था। **पी<0.01; पी<0.0001; नसीर: महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सह-संस्कृति के 48 घंटे के बाद छवियों का दृश्य प्रतिनिधित्व। (ए) ट्यूमर केवल समूह सीएफएसई (हरा) लेबल ट्यूमर कोशिकाओं के साथ। (बी) लाल कोशिकाओं के साथ अन-ट्रांसड्यूड जुर्काट कोशिकाओं का जोड़ मृत जुर्कट कोशिकाएं हैं और (सी) हरे और लाल रंग के ओवरले मृत ट्यूमर कोशिकाओं (पीले) को दर्शाते हैं जैसा कि तीर द्वारा दिखाया गया है। हरे रंग की कोशिकाओं की संख्या जो पीले नहीं हैं, मात्रा निर्धारित की जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: ईजीएफआर सीडी 3 सीएआर-टी सेल संवर्धन। (ए-बी) सीएआर अभिव्यक्ति का मूल्यांकन संवर्धन से पहले फ्लैग पॉजिटिव और आईजीजी पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत का निर्धारण करके किया गया और (सी) बाँझ प्रवाह प्रकार द्वारा संवर्धन के बाद। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: सीडी 3 सीएआर-टी और सीएफएसई लेबल ट्यूमर कोशिकाओं के सह-संस्कृति में साइटोटॉक्सिसिटी मूल्यांकन। सीएफएसई लेबल एमडीए एमबी 231 कोशिकाओं को 4: 1 ई: टी अनुपात में 48 घंटे के लिए कार-जे के साथ चढ़ाया गया था, जो ट्यूमर सेल की हत्या में अलग-अलग प्रभावकारिता दिखा रहा था। डेटा को एसडी ± मतलब के रूप में दर्शाया गया है और सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके किया गया था। **पी<0.01; पी<0.0001; नसीर: महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: EGFR CD3 CAR-T सेल सक्रियण। CAR-T कोशिकाओं को ट्यूमर कोशिकाओं और इंट्रासेल्युलर साइटोकिन स्तरों के संपर्क में लाया गया (A) TNFa, (B) 4-1BB, (C) पेरफोरिन, और (D) ग्रैनजाइम B का मूल्यांकन किया गया। डेटा को एसडी ± मतलब के रूप में दर्शाया जाता है और सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन एक तरफा एनोवा * पी < 0.05 का उपयोग करके किया गया था; **पी<0.01; **पी<0.001; पी<0.0001; नसीर: महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नहीं। पीए का EGFR806 scFv वीएच-वीएल लिंकर काज/स्पेसर टीएम साइटोप्लाज्मिक
कार आईजीजी लांग व्हिटलो (18 एए) आईजीजी 4 ईक्यू सीएच 2 सीएच 3 (229 एए) सीडी4 4-1BB/CD3z
कार आईजीजी मीडियम व्हिटलो आईजीजी 4 सीएच 3 (129 एए) सीडी28 4-1BB/CD3z
कार आईजीजी शॉर्ट व्हिटलो आईजीजी लघु (12 एए) सीडी4 4-1BB/CD3z
कार सीडी8ए व्हिटलो सीडी 8 (45 एए) सीडी8ए 4-1BB/CD3z

तालिका 1: कार निर्माण डिजाइन। संक्षिप्ताक्षर: एए = अमीनो एसिड; TM = ट्रांसमेम्ब्रेन।

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
एक ट्राइटन-एक्स एमडीए एमबी 231 केवल ट्राइटन-एक्स एमडीए एमबी 231 ईजीएफआर केओ केवल
जन्‍म एमबी231 + मॉक 4:1 एमबी231 ईजीएफआर केओ + मॉक 4:1
के आसपास एमबी231 + ईजीएफआर आईजीजी लॉन्ग 4:1 एमबी 231 ईजीएफआर केओ + ईजीएफआर आईजीजी लॉन्ग 4: 1
D एमबी231 + ईजीएफआर आईजीजी मीडियम 4:1 MB231 ईजीएफआर केओ + ईजीएफआर आईजीजी मीडियम 4: 1
ई एमबी231 + ईजीएफआर आईजीजी शॉर्ट 4:1 एमबी 231 ईजीएफआर केओ + ईजीएफआर आईजीजी शॉर्ट 4: 1
स्‍त्री-विषयक एमबी231 + ईजीएफआर सीडी8ए 4:1 एमबी231 ईजीएफआर केओ + ईजीएफआर सीडी8ए 4:1
ग्राम
H

तालिका 2: नमूना चढ़ाना रणनीति।

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Discussion

यहां हमने जुर्काट कोशिकाओं में सीएआर अभिव्यक्ति द्वारा प्रेरित लक्ष्य-विशिष्ट साइटोलाइटिक गतिविधि का कुशलतापूर्वक मूल्यांकन करने के लिए एक तीव्र विधि का प्रस्ताव दिया है। सबै CAR निर्माणहरूमा समान scFv लेकिन विभिन्न काज र transmembrane डोमेन छ जुन CAR-T कोशिकाहरू शक्ति13लाई प्रभावित गर्न दिखाया गरिएको छ। इन सीएआर-जे द्वारा गैर-विशिष्ट हत्या का आगे मूल्यांकन उन्हें एंटीजन नॉक आउट (केओ) कोशिकाओं के साथ संवर्धन करके किया गया था। यह दर्शाता है कि हत्या ट्यूमर प्रतिजन विशिष्ट है और CAR-J द्वारा बेसल सक्रियण के कारण नहीं है। ई: टी अनुपात की एक सीमा की साइटोटोक्सिक क्षमता को आसानी से निर्धारित किया जा सकता है, विशिष्ट समय बिंदुओं पर ट्यूमर कोशिकाओं को खत्म करने के लिए आवश्यक प्रभावक कोशिकाओं की कम से कम संख्या की पहचान करना। इन निर्माणों की विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए एक ही या अलग-अलग कैंसर प्रकार और सामान्य कोशिकाओं से कई सेल लाइनों का भी उपयोग किया जा सकता है। CAR-J प्लेटफॉर्म द्वारा पहचाने जाने वाले सबसे शक्तिशाली उम्मीदवारों को PBMC व्युत्पन्न CD3 T कोशिकाओं पर CAR व्यक्त करके और समान हत्या परख करके और एंटीजन पॉजिटिव और नकारात्मक ट्यूमर कोशिकाओं के संपर्क में आने पर थकावट और सक्रियण का मूल्यांकन करके आगे की विशेषता हो सकती है।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जुर्काट कोशिकाएं सीडी 4 + कोशिकाएं हैं जिनमें एक परिवर्तित टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) सिग्नलिंग मार्ग15 है। इसलिए, कार निर्माणों के इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग डोमेन अनुकूलन आदर्श रूप से सीडी 3 टी कोशिकाओं16 के साथ किया जाना चाहिए और जुर्काट कोशिकाओं के साथ सबसे अच्छा काम नहीं कर सकता है। दिलचस्प बात यह है कि सीडी 4 टी कोशिकाएं साइटोटॉक्सिसिटी का प्रदर्शन करती हैं जैसा कि पिछले प्रकाशन में दिखाया गया है जहां आईजीजी लंबे काज के साथ सीडी 4 सीएआर-टी कोशिकाओं को लक्षित करने वाले ईजीएफआर इंट्राक्रैनील ट्यूमर मॉडल12 में टीएनबीसी ट्यूमर को पूरी तरह से खत्म करने में सक्षम हैं। इसके अतिरिक्त, सीडी 4 कार टी कोशिकाओं जीबीएम ट्यूमर मॉडल में अकेले सीडी 4 और सीडी 8 टी कोशिकाओं या सीडी 8 टी कोशिकाओं के मिश्रण की तुलना में दीर्घकालिक शक्ति और बेहतर हत्या दिखाते हैं, जिससे उन्हें प्रभावी सीएआर-टी थेरेपी17 के लिए चिकित्सकीय रूप से महत्वपूर्ण टी कोशिकाएं सबसेट बनाती हैं।

जुर्काट कोशिकाएं आईएल 2 का उत्पादन करती हैं और सक्रियण पर सीडी 69 को अपग्रेड करती हैं, हालांकि वे प्राथमिक टी सेल सक्रियण 8,18के सभी साइटोकिन्स का स्राव नहीं करते हैं। हालांकि, IL2 और CD69 स्तरों का मूल्यांकन जुर्काट कोशिकाओं के सक्रिय होने के बारे में सूचित करता है और लक्ष्य कोशिकाओं के प्रत्यक्ष साइटोलिसिस के बारे में नहीं जो इस दृष्टिकोण से पूर्ण ट्यूमर सेल संख्याओं में मात्रा निर्धारित की जा रही है। हालांकि, साइटोटॉक्सिसिटी और सक्रियण का मूल्यांकन उपन्यास कार अणुओं के प्रभावों को पूरी तरह से समझने के लिए महत्वपूर्ण है।

इस प्रयोग में सह-संस्कृति की अवधि का उपयोग किए जा रहे निर्माणों के आधार पर संशोधित किया जा सकता है। ट्यूमर कोशिकाओं पर सीएफएसई लेबलिंग चढ़ाना के बाद 4 दिनों तक पता लगाने योग्य पाया गया था। इसलिए, शोर अनुपात के लिए एक उच्च संकेत प्राप्त करने के लिए, प्रयोगों 72 घंटे के भीतर प्रदर्शन किया गया. चूंकि ट्यूमर कोशिकाओं के विभाजन पर सीएफएसई तीव्रता कम हो जाती है, इसलिए सीएफएसई की मात्रा और उपयोग की जाने वाली ट्यूमर कोशिकाओं के अनुसार अवधि को बदलने की आवश्यकता हो सकती है। चूंकि यह एक समय में कई निर्माणों का विश्लेषण करने के लिए एक उच्च थ्रूपुट प्रयोग है, इसलिए 96 अच्छी तरह से प्लेट में लक्ष्य कोशिकाओं के बीजारोपण घनत्व को भी अनुकूलित करने की आवश्यकता है। लक्ष्य कोशिकाओं को बनाए रखा जाना चाहिए ताकि वे overconfluent विकसित नहीं है या किसी भी हस्तक्षेप को कम करने के लिए मीडिया को बदलने की आवश्यकता के बिना परख के अंत तक प्रतिस्पर्धी विकास प्रतिबंध है. बड़ी अच्छी तरह से प्लेटों अधिक कोशिकाओं को समायोजित करने और प्रयोग की दीर्घायु बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, छवियों को कुएं की पूरी तस्वीर प्राप्त करने के लिए सिले जाने की आवश्यकता होती है और प्रत्येक कुएं पर व्यक्तिगत रूप से काम करना पड़ता है, जो इसे त्वरित और उच्च थ्रूपुट नहीं बना सकता है।

लंबे समय तक फ्लोरोसेंट लेबलिंग ट्यूमर कोशिकाओं का एक अन्य दृष्टिकोण हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) या लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) के साथ लेंटिवायरल पारगमन द्वारा है। उचित क्लोनल चयन शोर अनुपात के लिए सबसे अच्छा संकेत के लिए अत्यधिक समृद्ध (लगभग 100%) प्रतिभाशाली कालोनियों का चयन करने के लिए किया जाना चाहिए. व्यवहार्यता डाई उचित इमेजिंग उपकरण में फ्लोरोसेंट डिटेक्टरों के आधार पर चुना जाना चाहिए.

पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मीडिया का उपयोग किया जा रहा है पर निर्भर करता है और इसलिए छवियों को प्राप्त करते समय सिग्नल के नुकसान से बचने के लिए जाँच की जानी चाहिए। नियमित मीडिया में ऐसे घटक होते हैं जो उत्साहित होने पर महत्वपूर्ण प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करते हैं। यह एक कम पृष्ठभूमि मीडिया19 का उपयोग करने की सिफारिश की है. पीबीएस का उपयोग किया जा सकता है लेकिन यह छवियों को प्राप्त करने के दौरान कोशिकाओं को प्रभावित कर सकता है क्योंकि छवियों को कैप्चर करने के लिए निर्धारित सेटिंग्स के आधार पर छवियों को प्राप्त करने में लगभग 20 मिनट लगते हैं।

इस परख की सीमाओं में से एक व्यवहार्यता डाई जोड़ने के बाद एक ही 96 अच्छी तरह से थाली के कई समय बिंदुओं पर छवियों को लेने में सक्षम नहीं होना है. इस प्रकाशन के लिए लंबे समय तक पीआई को जोड़ने के प्रभाव का मूल्यांकन नहीं किया गया था। हालांकि, एक ही प्लेट का उपयोग करके एक अवधि में जीवित और मृत/मरने वाले लक्ष्य कोशिकाओं का पता लगाने में सक्षम होना आदर्श होगा। यदि कोशिकाएं अधिक संगम हो जाती हैं तो व्यक्तिगत कोशिकाओं को अलग करना मुश्किल हो सकता है। सेल मोनोलेयर और प्रतिदीप्ति तीव्रता के क्षेत्र का उपयोग20 वर्णित कोशिकाओं के जीवित / मृत प्रतिशत की तुलना करने के लिए किया जा सकता है।

CAR-T कोशिकाओं द्वारा साइटोलिसिस का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले वैकल्पिक तरीके सीधे मृत और जीवित कोशिकाओं की पूर्ण संख्या को नहीं मापते हैं, बल्कि अप्रत्यक्ष तरीकों से शक्ति का मूल्यांकन करते हैं जो कहीं और 4,5 में विस्तार से वर्णित हैं। तो, इस विधि प्रभावकारी कोशिकाओं का एक निरपेक्ष खाता देता है और इमेजिंग उपकरण की क्षमता के आधार पर के रूप में अच्छी तरह से 3 सेल प्रकार के सह-संस्कृति में इस्तेमाल किया जा सकता है. वहाँ बहुत कुछ कोशिकाओं की आवश्यकता है (5000 अच्छी तरह से प्रति 5000) जो एक समय बिंदु जो इस परख का उपयोग करने के बहुत बड़े फायदे हैं चुनने के लिए स्वतंत्रता के साथ बदल सकते हैं. निलंबन में लक्ष्य कोशिकाओं और 3 आयामी अंडाकार आकृति संस्कृति में भी प्रभावकारी कोशिकाओं और cytolysis के रूप में कहीं और21 वर्णित निर्धारित के साथ संस्कृति में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, इस मंच का उपयोग सबसे प्रभावी अणुओं को चित्रित करने के लिए छोटे अणुओं और यौगिकों के बड़े पुस्तकालयों को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है और कई समय बिंदुओं पर कई खुराक की जा सकती है।

सिस्टम की गति और लचीलेपन के अलावा, अंतिम लाभ लागत का है। फ्लोरोसेंट इमेजिंग मशीन, प्लेटें, और अभिकर्मक सभी आम और खरीदने के लिए सस्ती हैं, खासकर जब उन उपकरणों की तुलना में जो अधिक परिष्कृत हैं और यहां तक कि अपने एकल उपयोग प्लेटों में कीमती धातुओं का उपयोग कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

एमडीए-एमबी -231 डॉ शेन स्टेक्लेन से एक तरह का उपहार था। लेखक इस शोध का संचालन करने के लिए कैनसस कैंसर सेंटर विश्वविद्यालय से वित्त पोषण स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Conical Tube (Sterile) Midwest Scientific #C15B Any similar will work
50 mL Conical Tube (Sterile) Thermo Scientific 339652 Any similar will work
Black/Clear 96 well plate Falcon 353219 Celligo has a list of compatible plates
Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter Nexcelcom Bioscience 200-BFFL-5C Any similar will work
Celigo Software Nexcelcom Bioscience Version 5.3.0.0 Any similar will work
Cell Culture Incubator Thermo Scientific HeraCell 160i Any similar will work
Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) TPP 90076 Any similar will work
CFSE Tonbo 13-0850-U500 Any similar will work
Cytek Muse Cell Analyzer Cytek 0500-3115 Any similar will work
DMEM Gibco 11995-040 Any similar will work
FBS Gemini bio-products 900-108 Any similar will work
Flow Cytometer Cytek, BD, etc Aurora, LSR II, etc Any similar will work
FlowJo Sortware Becton Dickinson & Company  Version 10.7.1 Any similar will work
Fluorobrite DMEM Gibco A18967-01 Any similar will work
GraphPad Software GraphPad Version 9.3.1 (471) Any similar will work
Multichanel Pipette Thermo Scientific Finnpipette F2 Any similar will work
PBS Gibco 10010-031 Any similar will work
PenStrep Gibco 15070-063 Any similar will work
Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) Pr1ma PR-1250RK-FL, etc Any similar will work
Pipettors  Thermo Scientific Finnpipette F2 Any similar will work
Propidium Iodide Invitrogen P1304MP Any similar will work
RPMI Corning 10-041-cv Any similar will work
Serological Pipette Aid Drummond Scientific 4-000-105 Any similar will work
Serological Pipettes (Sterile, various sizes) Pr1ma PR-SERO-25, etc Any similar will work
Sodium Pyruvate Corning 25-000-CI Any similar will work
Sterile Reservoirs Midwest Scientific RESE-2000 Any similar will work
Table top centrifuge Eppendorf 5810R Any similar will work

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References

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