Summary
Un protocole pour évaluer la destruction quantitative des cellules tumorales par les cellules de Jurkat exprimant le récepteur de l’antigène chimérique (CAR) ciblant l’antigène tumoral unique. Ce protocole peut être utilisé comme plate-forme de criblage pour l’optimisation rapide des constructions de charnières CAR avant la confirmation dans les lymphocytes T dérivés du sang périphérique.
Abstract
Les lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) sont à l’avant-garde de l’oncologie. Un CAR est constitué d’un domaine de ciblage (généralement un fragment variable à chaîne unique, scFv), accompagné d’un linker intra-chaîne, suivi d’une charnière, d’une membrane et d’un domaine costimulateur. La modification du domaine de liaison intra-chaîne et de charnière peut avoir un effet significatif sur la destruction médiée par le CAR. Compte tenu des nombreuses options différentes pour chaque partie d’une construction CAR, il existe un grand nombre de permutations. La fabrication de cellules CAR-T est un processus long et coûteux, et la fabrication et le test de nombreuses constructions représentent un investissement important en temps et en matériel. Ce protocole décrit une plate-forme permettant d’évaluer rapidement les constructions CAR optimisées pour les charnières dans les cellules Jurkat (CAR-J). Les cellules Jurkat sont une lignée de lymphocytes T immortalisée avec une absorption élevée des lentivirus, permettant une transduction efficace du CAR. Nous présentons ici une plate-forme permettant d’évaluer rapidement CAR-J à l’aide d’un imageur fluorescent, suivie d’une confirmation de la cytolyse dans les lymphocytes T dérivés de PBMC.
Introduction
La thérapie cellulaire CAR-T s’est révélée très prometteuse dans les hémopathies malignes, comme en témoignent les 6 produits CAR-T approuvés par la FDA depuis 2017, comme l’a rapporté le National Cancer Institute1. Il existe de nombreuses cellules CAR-T dans les essais cliniques pour cibler les tumeurs solides. L’ingénierie de nouvelles cibles CAR et l’optimisation de la construction CAR sont essentielles à l’efficacité d’une cellule CAR-T. Le choix de la construction CAR idéale pour chaque application est essentiel pour cibler avec précision les antigènes associés à la tumeur (TAA) tout en évitant de faibles niveaux d’expression de TAA dans les tissus normaux2.
Une construction CAR est principalement constituée de cinq compartiments : (1) le domaine extracellulaire à fragment variable à chaîne unique (scFv) ciblant l’antigène tumoral ; (2) domaine de charnière ; (3) domaine transmembranaire ; (4) domaine costimulateur des lymphocytes T cytoplasmiques intracellulaires ; et (5) domaine de signalisation. La modification de chacun de ces domaines affecte la précision de l’engagement de la cellule CAR-T avec sa cellule cible3. Par conséquent, l’évaluation de la cytotoxicité et de la réactivité croisée de ces constructions CAR in vitro est essentielle pour choisir la bonne construction pour progresser vers des expériences in vivo. Les méthodes actuelles d’évaluation de la cytolyse par les lymphocytes T comprennent le test de libération de 51Cr, le test de libération de lactate déshydrogénase, le test d’imagerie bioluminescente, l’analyse cellulaire basée sur l’impédance en temps réel et le test de cytométrie en flux cellulaire 4,5. La plate-forme d’imagerie fluorescente décrite ici identifie le nombre de cellules vivantes par rapport aux cellules mortes, ce qui est une quantification directe de la cytolyse des lymphocytes T par opposition à une méthode indirecte d’évaluation de la cytolyse par les lymphocytes T.
Voici une technique simple, rentable, rapide et à haut débit avec une intervention minimale pour évaluer la cytotoxicité des cellules de Jurkat exprimant le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) CAR contre les cellules de cancer du sein triple négatif (TNBC) MDA-MB-231 et les cellules EGFR CRISPR knock out MDA-MB-231. Les cellules Jurkat sont des lymphocytes T humains immortalisés6 qui ont été largement utilisés pour étudier les mécanismes d’activation et de signalisation des lymphocytes T7. De plus, les cellules de Jurkat ont été utilisées pour des tests in vitro de CAR dans de multiples études 8,9,10,11. Les cellules de Jurkat sont facilement transduites par les lentivirus et ont une prolifération soutenue, et ce système a été exploité pour optimiser le domaine charnière de diverses constructions EGFR CAR.
Ce test peut être utilisé pour le criblage de plusieurs constructions CAR ciblant divers antigènes tumoraux et utilisé contre plusieurs lignées cellulaires tumorales adhérentes et dans divers rapports effecteur/tumeur (E :T). De plus, plusieurs points temporels peuvent être évalués et le nombre de répétitions peut être modifié pour identifier le meilleur abattage parmi les différentes constructions de CAR. Les meilleures constructions doivent être confirmées à l’aide de cellules T CD3 dérivées de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). L’objectif global derrière le développement de cette méthode est d’optimiser rapidement la géométrie de la charnière CAR à haut débit en surmontant des obstacles tels qu’une faible efficacité de transduction, suivie d’une confirmation dans les cellules T dérivées de PBMC.
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Protocol
REMARQUE : Tous les travaux de culture cellulaire sont effectués dans une enceinte de sécurité biologique avec une blouse de laboratoire, des gants et en suivant les techniques aseptiques standard.
1. Génération de Jurkats exprimant le CAR (CAR-J)
- Achetez des cellules Jurkat, clonez E6-1 auprès d’ATCC. Décongeler 1 x 106 cellules dans une fiole T-75 et les cultiver dans des fioles T-75. Maintenez-les en suspension à raison de 0,6 x 106 cellules par ml à l’aide d’un milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complété par 10 % de FBS dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Plaque 1 x 105 cellules de Jurkat par puits d’une plaque de 24 puits traitée par culture tissulaire dans 500 μL de milieu de culture RPMI contenant 4 μg/mL de polybrène qui améliore l’efficacité lentivirale. Comptez les cellules à l’aide d’un analyseur de cellules de paillasse à détection fluorescente à base de laser. Le nombre de puits dépend du nombre de constructions à évaluer. Cet exemple utilisera 4 constructions et un contrôle non transduit. Le tableau 1 présente la conception de la construction du RAC.
- Ajouter 10 μL de lentivirus/puits de chaque construction de CAR. La conception de la construction du CAR et la production de lentivirus ont été effectuées comme décrit précédemment12.
- Le lendemain, ajouter 1 mL de milieu de croissance RPMI dans chaque puits et poursuivre la culture dans l’incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Prélevez les cellules 2 jours plus tard (total 72 h après la transduction de Jurkat) et comptez-les.
- Prenez 1 x 104 cellules pour l’écoulement afin de confirmer l’expression de CAR sur les cellules de Jurkat. Brièvement, lavez les cellules 2 fois avec une solution de coloration FACS (FSS) avant de marquer le CAR-J avec des anticorps ciblant la balise Flag utilisée pour détecter la positivité CAR pendant 30 minutes dans l’obscurité à 4 °C. Laver à nouveau 2 fois avec FSS et faire passer les cellules dans un cytomètre en flux comme décrit précédemment12. Utilisez la concentration d’anticorps recommandée par le fabricant.
- Les cellules de Jurkat sont facilement transductibles et présentent presque toujours >90% d’expression de CAR. Produire du CAR-J longtemps avant l’essai de cytotoxicité en coculture et le congeler pour une utilisation ultérieure.
2. Placage des cellules tumorales marquées CFSE
NOTE : LES CELLULES MDA-MB-231 (de l’ATCC, HTB-26) ont été offertes par un collaborateur, et les cellules EGFR KO MDA-MB-231 ont été créées comme décrit précédemment12.
- Décongeler 1 x 106 cellules dans une fiole T-75 et les cultiver dans des fioles T-75. Maintenir les cellules tumorales MDA-MB-231 et les cellules tumorales CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 dans 14 mL de milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco, complétés par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 et divisés lorsqu’ils sont confluents à environ 70 %.
- Observez les cellules tumorales adhérentes au microscope à fond clair ordinaire pour assurer une confluence de près de 70 %.
- Prélever le milieu de culture du flacon à l’aide d’une pipette sérologie. Ajouter 3 mL de trypsine dans le flacon T75 et placer dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 3 à 5 min pour détacher les cellules du flacon.
- Neutraliser la trypsine en utilisant une quantité égale (3 ml) de milieu de culture. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger et faire tourner les cellules à 400 x g pendant 4 min pour les granuler.
- Éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Déterminez la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire.
- Transférer 8 x 105 cellules dans un autre tube de 15 ml et ajouter du PBS pour obtenir un volume de 1 ml.
- Ajouter 2 μL d’ester de carboxyfluorescéine succinimidylique (CFSE ; concentration mère de 5 μM) dans chaque tube et bien mélanger à l’aide d’une pipette de 1 mL.
- Incuber les cellules avec CFSE pendant 20 min dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO2. Retirez les tubes de l’incubateur après 20 minutes et ajoutez 5 mL de milieu de culture dans le tube.
- Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 4 min pour les agglutiner dans les cellules marquées CFSE. Éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette et ajouter 1 mL de milieu frais pour remettre les cellules en suspension.
- Réévaluez la concentration cellulaire à l’aide d’un compteur cellulaire. Transférer 4 x 105 cellules dans un réservoir de réactif de 25 mL et ajouter le milieu pour un volume total de 8 mL.
- Pour assurer un volume suffisant pour ensemencer 5000 cellules tumorales / puits dans 100 μL de milieu, le volume devait pouvoir pipeter à l’aide de la pipette multicanal, et pour compenser la perte de quelques cellules au cours de l’étape 1.7, préparer 10% à 20% de cellules supplémentaires et un volume de milieu.
- Mélangez soigneusement la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL. À l’aide d’une pipette multicanaux de 100 μL, pipeter 100 μL de la suspension cellulaire dans chaque rangée de la plaque noire transparente à fond plat à 96 puits sur la moitié gauche. Un exemple de stratégie de placage se trouve dans le tableau 2.
- Pipeter les cellules EGFR KO de la même manière sur la moitié droite de la plaque. Une fois que toute la plaque est plaquée, faites glisser la plaque d’avant en arrière et d’un côté à l’autre sur la plate-forme de la hotte de culture tissulaire pour assurer une distribution uniforme des cellules tumorales dans les puits.
- Incuber la plaque pendant 4 h dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 pour que les cellules tumorales se fixent.
3. Co-culture de CAR exprimant des Jurkats avec des cellules tumorales marquées CFSE
- À l’aide du nombre de cellules Jurkat non transduites et exprimant le CAR, transférez 4 x 105 cellules de chaque CAR-J dans un réservoir de 25 ml. Ajouter le milieu de culture DMEM pour un volume total de 2 mL.
- Pour un E :T de 4 :1, 2 x 104 CAR-J ont été ajoutés par puits dans 100 μL de milieu à l’aide d’une pipette multicanal le long du côté de chaque puits afin de ne pas perturber les cellules tumorales attachées.
- Ajouter 100 μL supplémentaires de milieu de croissance à l’aide d’une pipette multicanal sur le côté des puits contenant des cellules tumorales et des cellules de Jurkat. Les groupes de tumeurs seulement reçoivent 200 μL de milieu, ce qui fait un total de 300 μL de milieux dans tous les puits.
- Faites glisser la plaque le long de la plate-forme d’avant en arrière et d’un mouvement latéral pour assurer une distribution uniforme des cellules Jurkat sur les cellules tumorales.
- Permettre la co-culture dans l’incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 pendant 48 h.
4. Préparation de la plaque pour l’imagerie
- Préparer une solution d’iodure de propidium (IP) à 1 μg/mL dans un milieu à faible fluorescence de fond en fonction du nombre de puits et de 100 μL de milieu chacun.
- Pour 84 puits, préparez 9 mL de milieu contenant de l’IP. Mélangez bien le milieu à l’aide d’une pipette.
- Préparez 10 mL de solution Triton-X à 20 % en diluant Triton-X avec de l’eau déminéralisée. Après 48 h de coculture, jeter le surnageant contenant le CAR-J par une seule inversion de la plaque et en tapotant sur du papier absorbant.
- Ajoutez maintenant 100 μL de milieux préparés ci-dessus (étape 4.2) contenant de l’IP dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal doucement afin de ne pas perturber les cellules tumorales adhérentes.
- Ajouter 20 μL de solution Triton-X à 20 % dans le premier puits de chaque type de tumeur, ce qui fonctionne comme un contrôle total mort.
- Laissez l’assiette dans l’incubateur pendant 20 min. Imagez la plaque à l’aide du cytomètre d’imagerie à fluorescence. Les données sont stockées sur l’ordinateur et peuvent être analysées ultérieurement.
5. Analyse d’images fluorescentes
- Utilisez l’un des seuls puits de cellules tumorales pour définir le canal fluorescent vert.
- Diminuez le masque du puits à 98% pour supprimer les cellules sur le bord du puits car le signal n’est pas parfait sur le bord.
- Identifier les cellules tumorales marquées CFSE sur le canal CFSE vert et fluorescent. Modifiez la valeur seuil de l’intensité de fluorescence pour récupérer toutes les cellules du puits.
- Réglez le diamètre minimal de la cellule sur 25 μm pour éliminer tous les débris détectés sur le canal CFSE. Cela varie en fonction du type de cellule analysé.
- Activez l’option Objets tactiles séparés pour identifier les cellules individuelles lorsqu’elles sont en contact les unes avec les autres.
- Sélectionnez CFSE sur l’affichage de l’image et examinez la superposition graphique pour déterminer ce qui est sélectionné par le système.
- Une fois que les cellules marquées CFSE sont correctement ramassées, définissez des portes pour définir la population de cellules vivantes par rapport à la population de cellules mortes.
- En sélectionnant les cellules marquées CFSE, générez un histogramme des comptages sur l’axe des ordonnées en fonction de l’intensité IP moyenne sur l’axe des abscisses.
- Sur la base du puits où nous avons ajouté Triton-X (étape 4.5), dessinez un séparateur pour différencier les cellules à faible PI colorées de celles à PI élevé. Ce puits devrait avoir la plupart des cellules dans une région fortement colorée par l’IP.
REMARQUE : PI montre le signal basal sur les cellules vivantes. Par conséquent, l’ajout de Triton-X tue toutes les cellules et elles se colorent vivement dans le canal fluorescent rouge. Cela facilite le dessin de portes pour séparer les cellules mortes des cellules vivantes. - Ajustez la valeur de l’axe des x pour mieux visualiser les cellules. Étiquetez maintenant les cellules faiblement colorées par l’IP comme des cellules vivantes.
- En sélectionnant les cellules dynamiques, définissez un autre histogramme avec une aire sur l’axe des x et des comptes sur l’axe des y.
- Dessinez un autre séparateur en utilisant uniquement la tumeur pour capturer les cellules et non les débris. Les puits traités par Jurkat commenceront à accumuler des débris qui seront tachés par le CFSE et devront être retirés des comptes. Les autres non-débris sont étiquetés comme « Grosses cellules ».
- Exécutez l’analyse sur l’ensemble de la plaque et exportez la feuille de calcul contenant les chiffres.
- Tracez les grands nombres pour identifier le nombre de cellules tumorales vivantes marquées au CFSE restant dans le puits après l’exposition au CAR-J. Déterminer les statistiques à l’aide de l’ANOVA à un facteur.
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Representative Results
Une plage de rapport E :T comprise entre 1 :8 et 8 :1 pour CAR-J1 a été évaluée à 72 h et ciblait l’EGFR sur les cellules TNBC MDA-MB-231. Les cellules Jurkat ont été transduites avec le lentivirus CAR avec du polybrène pour générer des cellules CAR-J comme décrit à l’étape 2. La cytotoxicité du CAR-J1 augmentait significativement avec un rapport E :T plus élevé, sans différence dans la destruction à un rapport de 1 :8 (Figure 1). Plus de 50 % des abattages ont été observés à 4 :1 E :T sur 72 h. Cet E :T a été utilisé pour des expériences ultérieures d’une durée réduite à 48 h pour l’évaluation rapide de la cytotoxicité de plusieurs constructions CAR. Des constructions EGFR ciblant le CAR avec le domaine de charnière modifié ont été conçues (Tableau 1). Les 4 charnières différentes utilisées sont les IgG longues, les IgG moyennes, les IgG courtes et les CD8a comme décrit ici13. Ces 3 constructions ont été exprimées sur les cellules de Jurkat et la positivité CAR a été déterminée en évaluant le pourcentage de cellules marquées Flag par cytométrie en flux (Figure 2A-D) comme décrit ici12. Des cellules Jurkat non transduites ont été utilisées comme groupe témoin pour déterminer l’expression du CAR et la stratégie de déclenchement est illustrée à la figure 2E. La cytotoxicité de ces 4 constructions CAR exprimées sur les cellules Jurkat a été évaluée par rapport aux cellules MDA-MB-231 exprimant l’EGFR et aux cellules CRISPR EGFR KO MDA-MB-231. La destruction spécifique de l’antigène a été observée par tous les concepts (Figure 3A), alors qu’il n’y a pas eu de destruction significative observée contre les cellules KO de l’EGFR (Figure 3B), ce qui suggère que la destruction a été spécifiquement médiée par le scFv uniquement. Il n’y a pas eu de meurtre par les cellules Jurkat non transduites. Des images représentatives de la destruction tumorale sont également montrées où le chevauchement de cellules tumorales marquées CFSE avec un noyau mort coloré par PI les fait apparaître en jaune (Figure 4). Les données sont représentatives de 3 expériences indépendantes avec 6 répétitions techniques par groupe.
Ceci a été confirmé par l’expression de ces constructions CAR sur des lymphocytes T CD3 dérivés de PBMC. Il y a une faible expression de CAR sur les lymphocytes T CD3 qui sont ensuite enrichis par tri en flux stérile (Figure 5). Cependant, il n’y avait pas d’expression de charnière CD8 contenant EGFR CAR. Par conséquent, les 3 autres constructions CAR contenant des IgG longues, des IgG moyennes et des IgG courtes ont été évaluées pour leur potentiel cytotoxique contre les cellules MDA-MB-231. Il y a une tendance similaire à tuer, les IgG courtes ayant le pouvoir cytotoxique le moins élevé par rapport aux 2 autres constructions (Figure 6). Afin d’identifier la meilleure construction parmi les cellules CAR-T IgG longues et IgG moyennes, leur activation avec et sans exposition aux cellules tumorales TNBC a été évaluée par coloration intracellulaire des cytokines comme décrit précédemment12. MDA-MB-436 a de faibles niveaux d’EGFR et MDA-MB-468 a l’expression de protéine EGFR la plus élevée sur la base d’un transfert Western avec un panel de 13 lignées cellulaires TNBC12. Les cellules IgG CAR-T longues présentaient les niveaux d’activation basale les plus faibles (TNFa, 4-1BB) et une faible libération de granules cytotoxiques (perforine et granzyme B)14 sans aucune exposition aux cellules tumorales (Figure 7). Lors de l’exposition à des cellules MDA-MB-468 exprimant un taux élevé d’EGFR, les cellules CAR-T longues IgG ont eu l’activation la plus élevée sur la base du TNFa et du 4-1BB.
Figure 1 : Évaluation cytotoxique de l’EGFR CAR-J1 le long d’une gamme E :T. Les cellules tumorales MDA-MB-231 marquées au CFSE ont été plaquées avec des cellules Jurkat non transduites ou EGFR ciblant CAR-J1 à un rapport E :T de 1 :8, 1 :4, 1 :2, 1 :1, 2 :1, 4 :1 et 8 :1 montrant une cytotoxicité croissante avec des cellules effectrices plus élevées. Les données sont représentées par la moyenne ±écart-type et la signification statistique a été évaluée à l’aide du test t de Student. 1 :8 E :T n’était pas significatif, 1 :4 E :T avait ***p<0,001 et le reste ****p<0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Production de l’EGFR CAR Jurkat pour l’évaluation cytotoxique in vitro. (A-D) Près de 90 % à 100 % d’expression CAR de 4 constructions différentes : CAR IgG long, CAR IgG moyen, CAR IgG court, CAR CD8a. (E) Stratégie de contrôle pour la détermination de la positivité du CAR : Débris exclus dans le tracé SSC-A par rapport au FSC-A ; Cellules individuelles sélectionnées dans le tracé FSC-H vs FSC-A ; et les cellules vivantes sélectionnées par colorant de viabilité DAPI negative gating. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Évaluation de la cytotoxicité en co-culture de cellules tumorales marquées CAR-J et CFSE. (A) Des cellules MDA MB 231 marquées au CFSE ont été plaquées avec du CAR-J à un rapport E :T de 4 :1 pendant 48 h, montrant une efficacité variable dans la destruction des cellules tumorales. (B) Les cellules CRISPR EGFR KO MDA MB 231 marquées par le CFSE n’ont subi aucune destruction par l’une ou l’autre des cellules CAR-J. Les données sont représentées par la moyenne ±écart-type et la signification statistique a été évaluée à l’aide d’une ANOVA à un facteur. **p<0,01 ; p<0,0001 ; NS : Pas significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Représentation visuelle des images après 48 h de co-culture. (A) Groupe de tumeurs uniquement avec des cellules tumorales marquées CFSE (en vert). (B) Addition de cellules Jurkat non transduites, les globules rouges étant les cellules Jurkat mortes et (C) superposition de cellules tumorales mortes (jaune) indiquant les cellules tumorales mortes (jaunes) comme indiqué par des flèches. Le nombre de cases vertes qui ne sont pas jaunes est quantifié. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Enrichissement des cellules CAR-T CD3 de l’EGFR. (A-B) Expression de CAR évaluée en déterminant le pourcentage de cellules Flag positives et d’IgG positives avant l’enrichissement et (C) post-enrichissement par tri en flux stérile. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Évaluation de la cytotoxicité en co-culture de cellules tumorales marquées CD3 CAR-T et CFSE. Les cellules MDA MB 231 marquées au CFSE ont été plaquées avec CAR-J à un rapport E :T de 4 :1 pendant 48 h, montrant une efficacité variable dans la destruction des cellules tumorales. Les données sont représentées par la moyenne ±écart-type et la signification statistique a été évaluée à l’aide d’une ANOVA à un facteur. **p<0,01 ; p<0,0001 ; NS : Pas significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Activation des cellules CAR-T CD3 de l’EGFR. Les cellules CAR-T ont été exposées à des cellules tumorales et les niveaux intracellulaires de cytokines pour (A) TNFa, (B) 4-1BB, (C) perforine et (D) granzyme B ont été évalués. Les données sont représentées par la moyenne ± l’écart-type et la signification statistique a été évaluée à l’aide d’une ANOVA à un facteur *p<0,05 ; **p<0,01 ; **p<0,001 ; p<0,0001 ; NS : Pas significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Non. de PA EGFR806 scFv | Vh-Vl Linker | Charnière/entretoise | TM | Cytoplasmique |
| CAR IgG Long | Whitlow (18 aa) | Égaliseur IgG4 CH2 CH3 (229 aa) | Disques d’art.4 | 4-1BB / CD3z |
| IgG CAR Moyenne | Panaris | IgG4 CH3 (129 aa) | Le CD28 | 4-1BB / CD3z |
| CAR IgG Short | Panaris | IgG courtes (12 aa) | Disques d’art.4 | 4-1BB / CD3z |
| VOITURE CD8a | Panaris | CD8 (45 aa) | CD8a | 4-1BB / CD3z |
Tableau 1 : Plans de construction du RAC. Abréviations : aa = acides aminés ; TM = Transmembranaire.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Un | Triton-X | MDA MB 231 uniquement | Triton-X | MDA MB 231 EGFR KO uniquement | ||||||||
| B | MB231 + Simulacre 4 :1 | MB231 EGFR KO + Mock 4 :1 | ||||||||||
| C | MB231 + EGFR IgG Long 4 :1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Long 4 :1 | ||||||||||
| D | MB231 + EGFR IgG Moyen 4 :1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Moyen 4 :1 | ||||||||||
| E | MB231 + EGFR IgG court 4 :1 | MB231 KO EGFR + EGFR IgG Short 4 :1 | ||||||||||
| F | MB231 + EGFR CD8a 4 :1 | MB231 EGFR KO + EGFR CD8a 4 :1 | ||||||||||
| G | ||||||||||||
| H | ||||||||||||
Tableau 2 : Exemple de stratégie de placage.
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Discussion
Nous avons proposé ici une méthode rapide pour évaluer efficacement l’activité cytolytique spécifique à la cible induite par l’expression de CAR dans les cellules de Jurkat. Toutes les constructions CAR ont le même scFv mais des domaines de charnière et de transmembrane différents dont il a été démontré qu’ils affectent la puissance des cellules CAR-T13. Une évaluation plus poussée de la destruction non spécifique par ces CAR-J a été effectuée en les cultivant avec des cellules knock-out antigéniques (KO). Cela démontre que la destruction est spécifique de l’antigène tumoral et non due à l’activation basale par le CAR-J. Le potentiel cytotoxique d’une gamme de rapports E :T peut être facilement déterminé en identifiant le plus petit nombre de cellules effectrices nécessaires pour éliminer les cellules tumorales à des moments précis. Plusieurs lignées cellulaires de type de cancer identique ou différent et des cellules normales peuvent également être utilisées pour évaluer la spécificité de ces constructions. Les candidats les plus puissants identifiés par la plate-forme CAR-J peuvent ensuite être caractérisés en exprimant CAR sur des lymphocytes T CD3 dérivés de PBMC et en effectuant des tests de destruction similaires et en évaluant l’épuisement et l’activation lors de l’exposition à des cellules tumorales positives et négatives à l’antigène.
Il convient de noter que les cellules de Jurkat sont des cellules CD4+ dont la voie de signalisation15 du récepteur des lymphocytes T (TCR) est altérée. Par conséquent, l’optimisation du domaine de signalisation intracellulaire des constructions CAR devrait idéalement être effectuée avec les lymphocytes T CD316 et peut ne pas fonctionner mieux avec les cellules Jurkat. Il est intéressant de noter que les lymphocytes T CD4 présentent une cytotoxicité, comme cela a été démontré dans une publication précédente où l’EGFR ciblant les cellules CAR-T CD4 à charnière longue IgG est capable d’éradiquer complètement les tumeurs TNBC dans un modèle de tumeur intracrânienne12. De plus, les cellules CAR-T CD4 montrent une puissance à long terme et une meilleure destruction par rapport au mélange de cellules T CD4 et CD8 ou de cellules T CD8 seules dans le modèle de tumeur GBM, ce qui en fait un sous-ensemble de cellules T cliniquement important pour une thérapie CAR-T efficace17.
Les cellules Jurkat produisent de l’IL2 et régulent à la hausse CD69 lors de l’activation, bien qu’elles ne sécrètent pas toutes les cytokines de l’activation des lymphocytes T primaires 8,18. Cependant, l’évaluation des niveaux d’IL2 et de CD69 renseigne sur l’activation des cellules Jurkat et non sur la cytolyse directe des cellules cibles, qui sont quantifiées en nombre absolu de cellules tumorales par cette approche. Cependant, l’évaluation de la cytotoxicité et de l’activation est importante pour bien comprendre les effets des nouvelles molécules de CAR.
La durée de la co-culture dans cette expérience peut être modifiée en fonction des concepts utilisés. Le marquage CFSE sur les cellules tumorales s’est avéré détectable jusqu’à 4 jours après le placage. Par conséquent, pour obtenir un rapport signal sur bruit élevé, des expériences ont été réalisées dans les 72 heures. Étant donné que l’intensité du CFSE diminue lors de la division des cellules tumorales, la quantité de CFSE utilisée et la durée peuvent devoir changer en fonction des cellules tumorales utilisées. Étant donné qu’il s’agit d’une expérience à haut débit permettant d’analyser plusieurs constructions à la fois, la densité d’ensemencement des cellules cibles dans une plaque à 96 puits doit également être optimisée. Les cellules cibles doivent être maintenues de manière à ce qu’elles ne deviennent pas trop confluentes ou qu’elles ne présentent pas de restriction de croissance compétitive à la fin de l’essai sans qu’il soit nécessaire de changer de milieu pour minimiser toute intervention. Des plaques de puits plus grandes peuvent être utilisées pour accueillir plus de cellules et augmenter la longévité de l’expérience. Cependant, les images doivent être assemblées pour obtenir une image complète du puits et chaque puits doit être travaillé individuellement, ce qui peut ne pas le rendre rapide et à haut débit.
Une autre approche de marquage fluorescent à long terme des cellules tumorales consiste à transduction lentivirale avec une protéine fluorescente verte (GFP) ou une protéine fluorescente rouge (RFP). Une sélection clonale appropriée doit être effectuée pour sélectionner les colonies les plus brillantes hautement enrichies (près de 100 %) afin d’obtenir le meilleur rapport signal/bruit. Le colorant de viabilité doit être sélectionné de manière appropriée en fonction des détecteurs fluorescents de l’instrument d’imagerie.
La fluorescence de fond dépend du support utilisé et doit donc être vérifiée pour éviter la perte de signal lors de l’acquisition d’images. Les milieux ordinaires contiennent des composants qui émettent une fluorescence importante lorsqu’ils sont excités. Il est recommandé d’utiliser un média à faible arrière-plan19. Le PBS peut être utilisé, mais il peut affecter les cellules lors de l’acquisition d’images, car il faut environ 20 minutes pour acquérir des images, en fonction des paramètres définis pour la capture d’images.
L’une des limites de ce test est de ne pas pouvoir prendre d’images à plusieurs points de temps de la même plaque à 96 puits après l’ajout d’un colorant de viabilité. L’effet de l’ajout d’IP sur une longue période n’a pas été évalué pour cette publication. Cependant, l’idéal serait de pouvoir détecter les cellules cibles vivantes et mortes/mourantes sur une période donnée en utilisant la même plaque. Il peut être difficile de séparer des cellules individuelles si les cellules deviennent trop confluentes. La surface de la monocouche cellulaire et l’intensité de fluorescence peuvent être utilisées pour comparer le pourcentage de cellules vivantes/mortes comme décrit20.
Les autres méthodes utilisées pour détecter la cytolyse par les cellules CAR-T ne mesurent pas directement le nombre absolu de cellules mortes et vivantes, mais évaluent plutôt la puissance par des méthodes indirectes qui sont décrites en détail ailleurs 4,5. Ainsi, cette méthode donne un compte rendu absolu des cellules effectrices et peut également être utilisée en co-culture de 3 types de cellules en fonction de la capacité de l’instrument d’imagerie. Il y a très peu de cellules requises (5000 par puits) qui peuvent changer avec la liberté de choisir un point de temps, ce qui est d’énormes avantages de l’utilisation de ce test. Les cellules cibles en suspension et en culture sphéroïdale tridimensionnelle peuvent également être utilisées en culture avec des cellules effectrices et la cytolyse déterminée comme décrit ailleurs21. De plus, cette plate-forme peut être utilisée pour cribler de grandes bibliothèques de petites molécules et de composés afin de délimiter les molécules les plus efficaces et des dosages multiples peuvent être effectués à plusieurs moments.
Outre la rapidité et la flexibilité du système, l’avantage final est celui du coût. L’appareil d’imagerie fluorescente, les plaques et les réactifs sont tous courants et abordables à l’achat, en particulier par rapport aux appareils plus sophistiqués qui peuvent même utiliser des métaux précieux dans leurs plaques à usage unique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
MDA-MB-231 était un cadeau aimable du Dr Shane Stecklein. Les auteurs reconnaissent le financement du Centre de cancérologie de l’Université du Kansas pour mener cette recherche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
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