Summary
Um protocolo para avaliar a morte quantitativa de células tumorais por células Jurkat expressando receptor de antígeno quimérico (CAR) visando antígeno único tumoral. Este protocolo pode ser usado como uma plataforma de triagem para otimização rápida de construções de dobradiças CAR antes da confirmação em células T derivadas do sangue periférico.
Abstract
As células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) estão na vanguarda da oncologia. Um CAR é construído de um domínio de alvo (geralmente um fragmento variável de cadeia única, scFv), com um elo intra-cadeia que o acompanha, seguido por uma dobradiça, transmembrana e domínio costimulatório. A modificação do domínio do elo intra-cadeia e da dobradiça pode ter um efeito significativo na matança mediada pelo CAR. Considerando as muitas opções diferentes para cada parte de uma construção CAR, há um grande número de permutações. Fazer células CAR-T é um processo demorado e caro, e fazer e testar muitas construções é um investimento pesado de tempo e material. Este protocolo descreve uma plataforma para avaliar rapidamente construções CAR otimizadas para dobradiças em células Jurkat (CAR-J). As células Jurkat são uma linhagem de células T imortalizadas com alta captação de lentivírus, permitindo uma transdução eficiente de CAR. Aqui, apresentamos uma plataforma para avaliar rapidamente o CAR-J usando um imageador fluorescente, seguido pela confirmação de citólise em células T derivadas do PBMC.
Introduction
A terapia celular CAR-T tem se mostrado uma grande promessa em neoplasias hematológicas, evidente a partir dos 6 produtos CAR-T aprovados pela FDA desde 2017, conforme relatado pelo Instituto Nacional do Câncer1. Existem numerosas células CAR-T em ensaios clínicos para atingir tumores sólidos. A engenharia de novos alvos CAR e a otimização da construção do CAR são vitais para a eficácia de uma célula CAR-T. A escolha da construção CAR ideal para cada aplicação é essencial para o direcionamento preciso de antígenos associados ao tumor (TAA), evitando baixos níveis de expressão de TAA em tecidos normais2.
Uma construção CAR é feita principalmente de cinco compartimentos: (1) domínio de fragmento variável de cadeia única extracelular (scFv) visando antígeno tumoral; (2) domínio da dobradiça; (3) domínio transmembrana; (4) domínio costimulatório de células T citoplasmáticas intracelulares; e (5) domínio da sinalização. A modificação de cada um desses domínios afeta a precisão do envolvimento da célula CAR-T com sua célula-alvo3. Assim, avaliar a citotoxicidade e a reatividade cruzada desses construtos CAR in vitro é fundamental para escolher o construto certo para progredir em direção a experimentos in vivo. Os métodos atuais de avaliação da citólise por células T incluem ensaio de liberação de 51Cr, ensaio de liberação de lactato desidrogenase, ensaio de imagem bioluminescente, análise celular baseada em impedância em tempo real e ensaio de citometria de fluxo baseado em células 4,5. A plataforma baseada em imagem fluorescente descrita aqui identifica o número de células vivas versus mortas, que é uma quantificação direta da citólise de células T em oposição a um método indireto de avaliação da citólise por células T.
Aqui está uma técnica fácil, econômica, rápida e de alto rendimento com intervenção mínima para avaliar a citotoxicidade de células Jurkat expressando o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) CAR contra células de câncer de mama triplo-negativo (TNBC) MDA-MB-231 e células EGFR CRISPR nocautear células MDA-MB-231. As células Jurkat são células de linfócitos T humanos imortalizadas6 que têm sido amplamente utilizadas para estudar os mecanismos de ativação e sinalização das células T7. Além disso, células Jurkat têm sido utilizadas para testes in vitro de CAR em múltiplos estudos 8,9,10,11. As células de Jurkat são facilmente transduzidas por lentivírus e têm proliferação sustentada, e este sistema foi aproveitado para otimizar o domínio da dobradiça de várias construções EGFR CAR.
Este ensaio pode ser usado para rastrear múltiplas construções CAR visando vários antígenos tumorais e usado contra múltiplas linhagens de células tumorais aderentes e em várias relações efetor para tumor (E:T). Além disso, vários pontos de tempo podem ser avaliados, e o número de réplicas pode ser modificado para identificar a melhor matança entre as várias construções do CAR. Os melhores construtos precisam ser confirmados usando células T CD3 derivadas de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). O objetivo geral por trás do desenvolvimento deste método é otimizar rapidamente a geometria da dobradiça CAR de uma maneira de alto rendimento, superando barreiras como baixa eficiência de transdução, seguida de confirmação em células T derivadas do PBMC.
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Protocol
NOTA: Todo o trabalho de cultura de células é feito em um gabinete de biossegurança com jaleco, luvas e seguindo técnicas assépticas padrão.
1. Gerando CAR expressando Jurkats (CAR-J)
- Compre células Jurkat, clone E6-1 da ATCC. Descongelar 1 x 106 células em frasco T-75 e cultivá-las em frascos T-75. Mantê-los em suspensão a 0,6 x 106 células por mL usando o meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementado com FBS a 10% em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2.
- Placa 1 x 105 células Jurkat por poço de uma cultura de tecidos tratada placa de 24 poços em 500 μL de meio de crescimento RPMI contendo 4 μg/mL de polibreno que aumenta a eficiência lentiviral. Conte células usando um analisador de células de bancada de detecção fluorescente baseado em laser. O número de poços depende do número de construtos a serem avaliados. Este exemplo usará 4 construções e um controle não transduzido. O desenho do construto CAR é mostrado na Tabela 1.
- Adicionar 10 μL de lentivírus/poço de cada construção CAR. O projeto de construção do CAR e a produção de lentivírus foram feitos conforme descrito anteriormente12.
- No dia seguinte, adicionar 1 mL de meio RPMI de crescimento a cada poço e continuar a cultura na incubadora a 37 °C com 5% de CO2.
- Coletar células 2 dias depois (total de 72 h após a transdução de Jurkat) e contá-las.
- Tome 1 x 104 células para fluxo de corrida para confirmar a expressão CAR nas células Jurkat. Resumidamente, lave as células 2x com solução de coloração FACS (FSS) antes de rotular o CAR-J com anticorpos direcionados à etiqueta Flag usada para detectar positividade de CAR por 30 minutos no escuro a 4 °C. Lavar novamente 2x com FSS e passar as células através de um citômetro de fluxo como descrito anteriormente12. Use a concentração de anticorpos conforme recomendado pelo fabricante.
- As células Jurkat são facilmente transduzidas e quase sempre apresentam expressão >90% do CAR. Produzir CAR-J muito antes do ensaio de citotoxicidade da co-cultura e congelar para uso posterior.
2. Plating CFSE células tumorais marcadas
NOTA: AS CÉLULAS MDA-MB-231 (da ATCC, HTB-26) foram um presente de um colaborador, e EGFR KO MDA-MB-231 foram criadas conforme descrito anteriormente12.
- Descongelar 1 x 106 células em frasco T-75 e cultivá-las em frascos T-75. Manter células tumorais MDA-MB-231 e células tumorais CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 em 14 mL de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em incubadora a 37 °C com 5% de CO2 e dividido quando aproximadamente 70% confluente.
- Observe células tumorais aderentes sob microscópio de campo claro regular para garantir quase 70% de confluência.
- Retirar o meio de crescimento do frasco com uma pipeta serológica. Adicionar 3 ml de tripsina ao balão T75 e colocar numa estufa a 37 °C com CO2 a 5% durante 3-5 minutos para separar as células do balão.
- Neutralizar a tripsina utilizando igual quantidade (3 mL) de meio de crescimento. Recolher a suspensão celular num tubo de centrifugação e girar as células a 400 x g durante 4 minutos para peletizar as células.
- Descarte o sobrenadante com pipeta e ressuspenda as células em 2 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Determine a concentração celular usando um contador de células.
- Transfira 8 x 105 células para outro tubo de 15 mL e adicione PBS para chegar a um volume de 1 mL.
- Adicionar 2 μL de éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE; concentração de estoque de 5 μM) em cada tubo e misturar bem usando uma pipeta de 1 mL.
- Incubar as células com CFSE durante 20 min na estufa a 37 °C com 5% de CO2. Retire os tubos da incubadora após 20 min e adicione 5 mL de meio de crescimento ao tubo.
- Centrifugar os tubos a 400 x g por 4 min para pelar as células marcadas com CFSE. Eliminar o sobrenadante utilizando uma pipeta e adicionar 1 ml de meio fresco para ressuspender as células.
- Reavalie a concentração celular usando um contador de células. Transfira 4 x 105 células para um reservatório de reagente de 25 mL e adicione meios para um volume total de 8 mL.
- Para garantir volume suficiente para semear 5000 células tumorais/poço em 100 μL de meio, o volume necessário para ser capaz de pipetar usando a pipeta multicanal, e para compensar a perda de algumas células durante a etapa 1.7, preparar 10%-20% de células extras e volume de meio.
- Misturar bem a suspensão celular com uma pipeta serológica de 5 ml. Usando uma pipeta multicanal de 100 μL, pipete 100 μL da suspensão celular em cada fileira da placa preta preta de fundo plano transparente de 96 poços na metade esquerda. Uma estratégia de plaqueamento amostral pode ser encontrada na Tabela 2.
- Pipetar células EGFR KO de forma semelhante na metade direita da placa. Uma vez que toda a placa é plaqueada, arraste a placa para frente e para trás e de um lado para o outro na plataforma da capela de cultura de tecidos para garantir uma distribuição uniforme das células tumorais nos poços.
- Incubar a placa durante 4 h na incubadora a 37 °C com 5% de CO2 para que as células tumorais se fixem.
3. Co-cultivo de CAR expressando Jurkats com células tumorais marcadas com CFSE
- Usando as contagens de células Jurkat não transduzidas e CAR expressando, transfira 4 x 105 células de cada CAR-J para um reservatório de 25 mL. Adicionar meio de crescimento DMEM para um volume total de 2 mL.
- Para E:T de 4:1, 2 x 104 CAR-J foram adicionados por poço em 100 μL de meio usando uma pipeta multicanal suavemente ao longo da lateral de cada poço para não perturbar as células tumorais aderidas.
- Adicione mais 100 μL de meio de crescimento usando uma pipeta multicanal ao lado de poços contendo células tumorais e células Jurkat. Os grupos tumorais recebem apenas 200 μL de meio para totalizar 300 μL de meio em todos os poços.
- Arraste a placa ao longo da plataforma em movimento para frente e para trás e de um lado para o outro para garantir uma distribuição uniforme das células de Jurkat nas células tumorais.
- Permitir a cocultura na incubadora a 37 °C com 5% de CO2 durante 48 h.
4. Preparo da placa para aquisição de imagens
- Fazer uma solução de iodeto de propídio (PI) a 1 μg/mL em meios de fluorescência de fundo baixo com base no número de poços e cada um obtendo 100 μL de meio.
- Para 84 poços preparar 9 mL de meio contendo IP. Misture bem a mídia usando uma pipeta.
- Completar 10 ml de solução de Triton-X a 20% diluindo Triton-X com água deionizada. Após 48 h de cultivo de co, descarte o sobrenadante contendo CAR-J por uma única inversão da placa e toque em papel toalha.
- Agora adicione 100 μL do meio preparado acima (passo 4.2) contendo IP em cada poço usando uma pipeta multicanal suavemente para não perturbar as células tumorais aderidas.
- Adicionar 20 μL de solução de Triton-X a 20% ao primeiro poço de cada tipo de tumor que funcione como um controle morto total.
- Deixe a placa na incubadora por 20 min. Imagem da placa usando o citômetro de imagem fluorescente. Os dados são armazenados no computador e podem ser analisados posteriormente.
5. Análise de imagens fluorescentes
- Use um dos tumores apenas bem de células para definir o canal verde fluorescente.
- Diminua a máscara do poço para 98% para remover as células na borda do poço, pois o sinal não é perfeito na borda.
- Identificar células tumorais marcadas com CFSE no canal CFSE verde e fluorescente. Modifique o valor limite de intensidade de fluorescência para captar todas as células do poço.
- Defina o diâmetro mínimo da célula para 25 μm para remover quaisquer detritos detectados no canal CFSE. Isso varia de acordo com o tipo de célula analisada.
- Habilite Objetos de toque separados para identificar células individuais quando estiverem em contato umas com as outras.
- Selecione CFSE na exibição da imagem e observe a sobreposição gráfica para descobrir o que está sendo escolhido pelo sistema.
- Uma vez que as células marcadas com CFSE estão sendo adequadamente captadas, estabeleça portas para definir a população de células vivas versus mortas.
- Selecionando as células marcadas com CFSE, gere um histograma de contagens no eixo y versus intensidade média do IP no eixo x.
- Com base no poço onde adicionamos Triton-X (passo 4.5), desenhe um divisor para diferenciar células coradas com baixo IP versus células coradas com alto PI. Este poço deve ter a maioria das células em uma região corada por PI alto.
NOTA: O PI mostra o sinal basal em células vivas. Assim, a adição de Triton-X mata todas as células e elas ficam brilhantes no canal fluorescente vermelho. Isso facilita o desenho de portas para separar células mortas de células vivas. - Ajuste o valor do eixo x para poder visualizar melhor as células. Agora rotule as células coradas com baixo IP como células vivas.
- Selecionando as células vivas, defina outro histograma com área no eixo x e conte no eixo y.
- Desenhe outro divisor usando o tumor apenas bem para capturar células e não detritos. Os poços tratados com Jurkat começarão a acumular detritos que serão manchados e precisarão ser removidos das contagens. Os restantes não detritos são rotulados como "células grandes".
- Execute a análise em toda a chapa e exporte a planilha contendo os números.
- Plotar as contagens de Big para identificar o número de células tumorais vivas marcadas com CFSE remanescentes no poço após a exposição ao CAR-J. Determine estatísticas usando ANOVA unidirecional.
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Representative Results
Uma faixa de relação E:T entre 1:8 e 8:1 para CAR-J1 foi avaliada em 72 h que teve como alvo EGFR em células TNBC MDA-MB-231. As células Jurkat foram transduzidas com lentivírus CAR com polibreno para gerar células CAR-J conforme descrito na etapa 2. A citotoxicidade do CAR-J1 aumentou significativamente com maior relação E:T, sem diferença na morte na proporção de 1:8 (Figura 1). Mais de 50% de mortes foram observadas às 4:1 E:T ao longo de 72 h. Este E:T foi usado para experimentos subsequentes com duração reduzida para 48 h para avaliação rápida da citotoxicidade de múltiplas construções CAR. EGFR direcionado para construções CAR com o domínio da dobradiça modificado foram desenhados (Tabela 1). As 4 diferentes dobradiças utilizadas são IgG longa, IgG média, IgG curta e CD8a como descrito aqui13. Esses 3 construtos foram expressos em células Jurkat e a positividade para CAR determinada pela avaliação da porcentagem de células marcadas com Flag por citometria de fluxo (Figura 2A-D), conforme descrito aqui12. Células Jurkat não transduzidas foram usadas como grupo controle para determinar a expressão do CAR e a estratégia de gating é mostrada na (Figura 2E). A citotoxicidade dessas 4 construções CAR expressas em células Jurkat foi avaliada contra células EGFR expressando MDA-MB-231 e células CRISPR EGFR KO MDA-MB-231. A morte antígeno-específica foi observada por todos os construtos (Figura 3A), enquanto não houve morte significativa contra células KO EGFR (Figura 3B), sugerindo que a morte foi especificamente mediada apenas pelo scFv. Não houve morte pelas células Jurkat não transduzidas. Imagens representativas da morte tumoral também são mostradas, onde a sobreposição de células tumorais marcadas com CFSE com núcleo morto corado por PI as faz parecer amarelas (Figura 4). Os dados são representativos de 3 experimentos independentes com 6 réplicas técnicas por grupo.
Isso foi confirmado pela expressão dessas construções CAR em células T CD3 derivadas do PBMC. Há baixa expressão de CAR nas células T CD3, que são então enriquecidas por triagem de fluxo estéril (Figura 5). Entretanto, não houve expressão de dobradiça CD8 contendo EGFR CAR. Assim, as outras 3 construções CAR contendo IgG longa, IgG média e IgG curta foram avaliadas quanto ao seu potencial citotóxico contra células MDA-MB-231. Há uma tendência semelhante de matar com IgG curto tendo a menor potência citotóxica em comparação com os outros 2 construtos (Figura 6). Para identificar o melhor construto entre células CAR-T IgG longas e médias IgG, sua ativação com e sem exposição a células tumorais TNBC foi avaliada pela coloração intracelular de citocinas, conforme descritoanteriormente12. O MDA-MB-436 apresenta baixos níveis de EGFR e o MDA-MB-468 apresenta a maior expressão da proteína EGFR baseada em um western blot com um painel de 13 linhagens celulares deTNBC12. As células CAR-T longas de IgG apresentaram os menores níveis basais de ativação (TNFa, 4-1BB) e baixa liberação de grânulos citotóxicos (perforina e granzima B)14 , sem qualquer exposição às células tumorais (Figura 7). Após exposição a células de alto EGFR expressando MDA-MB-468, as células CAR-T longas de IgG tiveram a maior ativação baseada em TNFa e 4-1BB.
Figura 1: Avaliação citotóxica do EGFR CAR-J1 ao longo de uma faixa de E:T. Células tumorais MDA-MB-231 marcadas com CFSE foram plaqueadas com células Jurkat não transduzidas ou EGFR visando CAR-J1 na relação E:T de 1:8, 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 e 8:1, mostrando citotoxicidade crescente com células efetoras mais altas. Os dados são representados como média ± DP e a significância estatística foi avaliada pelo teste t de Student. 1:8 E:T não foi significativo, 1:4 E:T teve ***p<0,001 e resto ****p<0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Produção de EGFR CAR Jurkat para avaliação citotóxica in vitro . (A-D) Quase 90%-100% expressão CAR de 4 construções diferentes CAR IgG longo, CAR IgG médio, CAR IgG curto, CAR CD8a. (E) Estratégia de gating para determinação da positividade do CAR: Debris excluídos no gráfico SSC-A vs FSC-A; Células Únicas selecionadas no gráfico FSC-H vs FSC-A; e Células vivas selecionadas pelo corante de viabilidade DAPI negativo gating. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Avaliação da citotoxicidade em co-cultura de células tumorais marcadas com CAR-J e CFSE. (A) Células MDA MB marcadas com CFSE 231 foram plaqueadas com CAR-J na proporção E:T de 4:1 por 48 h, mostrando eficácia variável na morte de células tumorais. (B) As células CFSE rotuladas com CRISPR EGFR KO MDA MB 231 não sofreram qualquer morte por nenhuma das células CAR-J. Os dados são representados como média ± DP e a significância estatística foi avaliada por meio de ANOVA one-way. **p<0,01; p<0,0001; NS: Não significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Representação visual das imagens após 48 h de co-cultivo. (A) Grupo apenas de tumor com células tumorais marcadas com CFSE (verde). (B) Adição de células Jurkat não transduzidas com hemácias sendo as células Jurkat mortas e (C) sobreposição de células tumorais mortas em verde e vermelho indicando células tumorais mortas (amarelo) como mostrado pelas setas. O número de células verdes que não são amarelas são quantificadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Enriquecimento de células CAR-T CD3 EGFR. (A-B) Expressão de CAR avaliada pela determinação da porcentagem de células Flag positivas e IgG positivas antes do enriquecimento e (C) pós-enriquecimento por tipo de fluxo estéril. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Avaliação da citotoxicidade em co-cultura de células tumorais marcadas com CD3 CAR-T e CFSE. Células MDA MB 231 marcadas com CFSE foram plaqueadas com CAR-J na proporção E:T de 4:1 por 48 h, mostrando eficácia variável na morte de células tumorais. Os dados são representados como média ± DP e a significância estatística foi avaliada por meio de ANOVA one-way. **p<0,01; p<0,0001; NS: Não significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Ativação da célula CAR-T CD3 EGFR. Células CAR-T foram expostas a células tumorais e os níveis intracelulares de citocinas para (A) TNFa, (B) 4-1BB, (C) perforina e (D) granzima B foram avaliados. Os dados são representados como média ± DP e a significância estatística foi avaliada por meio de ANOVA one-way *p<0,05; **p<0,01; **p<0,001; p<0,0001; NS: Não significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Não. de PA EGFR806 scFv | Vh-Vl Linker | Dobradiça/Espaçador | TM | Citoplasmática |
| CARRO IgG Longo | Whitlow (18 aa) | IgG4 EQ CH2 CH3 (229 aa) | CD4 | 4-1BB / CD3Z |
| CAR IgG Médio | Panarício | IgG4 CH3 (129 aa) | CD28 | 4-1BB / CD3Z |
| CAR IgG Curto | Panarício | IgG curto (12 aa) | CD4 | 4-1BB / CD3Z |
| CARRO CD8a | Panarício | CD8 (45 aa) | CD8a | 4-1BB / CD3Z |
Quadro 1: Desenhos de construção CAR. Abreviações: aa = aminoácidos; MT = Transmembrana.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Um | Tritão-X | MDA MB 231 Apenas | Tritão-X | MDA MB 231 EGFR KO Apenas | ||||||||
| B | MB231 + Simulado 4:1 | MB231 EGFR KO + Simulado 4:1 | ||||||||||
| C | MB231 + EGFR IgG Longo 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Longo 4:1 | ||||||||||
| D | MB231 + EGFR IgG Médio 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Médio 4:1 | ||||||||||
| E | MB231 + EGFR IgG Curto 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Curto 4:1 | ||||||||||
| F | MB231 + EGFR CD8a 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR CD8a 4:1 | ||||||||||
| G | ||||||||||||
| H | ||||||||||||
Tabela 2: Estratégia de plaqueamento amostral.
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Discussion
Aqui nós propusemos um método rápido para avaliar eficientemente a atividade citolítica alvo-específica induzida pela expressão de CAR em células Jurkat. Todas as construções CAR têm o mesmo scFv, mas diferentes domínios de dobradiça e transmembrana que demonstraram afetar a potência das células CAR-T13. Uma avaliação mais aprofundada da morte inespecífica por esses CAR-J foi feita cultivando-os com células de nocaute de antígeno (KO). Isso demonstra que a morte é antígeno tumoral específico e não devido à ativação basal pelo CAR-J. O potencial citotóxico de uma gama de razões E:T pode ser facilmente determinado identificando o menor número de células efetoras necessárias para eliminar células tumorais em momentos específicos. Múltiplas linhagens celulares de um mesmo tipo ou de câncer diferente e células normais também podem ser usadas para avaliar a especificidade desses construtos. Os candidatos mais potentes identificados pela plataforma CAR-J podem então ser caracterizados por expressar CAR em células T CD3 derivadas do PBMC e realizar ensaios de morte semelhantes e avaliar a exaustão e ativação após a exposição a células tumorais positivas e negativas de antígeno.
Deve-se ressaltar que as células Jurkat são células CD4+ com uma via de sinalização alterada do receptor de células T (TCR)15. Assim, a otimização do domínio de sinalização intracelular de construções CAR idealmente deve ser feita com células T CD316 e pode não funcionar melhor com células Jurkat. Curiosamente, as células T CD4 apresentam citotoxicidade, como demonstrado em uma publicação anterior, onde EGFR visando células CAR-T CD4 com dobradiça longa de IgG são capazes de erradicar completamente os tumores TNBC em um modelo de tumorintracraniano12. Além disso, as células T CD4 CAR apresentam potência a longo prazo e melhor matança em comparação com a mistura de células T CD4 e CD8 ou células T CD8 isoladamente no modelo tumoral GBM, tornando-as subconjunto de células T clinicamente importantes para uma terapia eficaz com CAR-T17.
As células Jurkat produzem IL2 e regulam positivamente CD69 após a ativação, embora não secretem todas as citocinas da ativação primária das células T 8,18. No entanto, a avaliação dos níveis de IL2 e CD69 informa sobre a ativação das células Jurkat e não sobre a citólise direta das células-alvo que estão sendo quantificadas em números absolutos de células tumorais por essa abordagem. No entanto, a avaliação da citotoxicidade e ativação é importante para compreender completamente os efeitos de novas moléculas de CAR.
A duração do co-cultivo neste experimento pode ser modificada com base nos construtos utilizados. A marcação de CFSE em células tumorais mostrou-se detectável até 4 dias após o plaqueamento. Assim, para atingir uma alta relação sinal/ruído, os experimentos foram realizados em até 72 h. Uma vez que a intensidade da CFSE diminui na divisão das células tumorais, a quantidade de CFSE usada e a duração podem precisar mudar de acordo com as células tumorais usadas. Como este é um experimento de alto rendimento para analisar várias construções ao mesmo tempo, a densidade de semeadura de células-alvo em uma placa de 96 poços também precisa ser otimizada. As células-alvo devem ser mantidas para que não cresçam excessivamente confluentes ou tenham restrição competitiva de crescimento ao final do ensaio, sem a necessidade de troca de meios para minimizar qualquer intervenção. Placas de poço maiores podem ser usadas para acomodar mais células e aumentar a longevidade do experimento. No entanto, as imagens precisam ser costuradas para obter uma imagem completa do poço e cada poço tem que ser trabalhado individualmente, o que pode não torná-lo rápido e de alto rendimento.
Outra abordagem de marcação fluorescente de longo prazo de células tumorais é por transdução lentiviral com proteína fluorescente verde (GFP) ou proteína fluorescente vermelha (RFP). A seleção clonal adequada deve ser feita para selecionar colônias altamente enriquecidas (quase 100%) mais brilhantes para a melhor relação sinal/ruído. O corante de viabilidade precisa ser adequadamente selecionado com base nos detectores fluorescentes no instrumento de imagem.
A fluorescência de fundo depende da mídia que está sendo usada e, portanto, deve ser verificada para evitar a perda de sinal durante a aquisição de imagens. As mídias comuns contêm componentes que emitem fluorescência significativa quando excitadas. Recomenda-se o uso de uma mídia de fundo baixo19. O PBS pode ser usado, mas pode afetar as células durante a aquisição de imagens, pois leva cerca de 20 minutos para adquirir imagens, dependendo das configurações definidas para capturar imagens.
Uma das limitações deste ensaio é não ser capaz de tirar imagens em vários pontos de tempo da mesma placa de 96 poços após a adição de um corante de viabilidade. O efeito da adição de IP por longo tempo prolongado não foi avaliado para esta publicação. No entanto, seria ideal ser capaz de detectar células-alvo vivas e mortas/moribundas durante um período usando a mesma placa. Pode ser difícil segregar células individuais se as células se tornarem mais confluentes. A área de monocamada celular e a intensidade da fluorescência podem ser usadas para comparar a porcentagem de células vivas/mortas conforme descrito20.
Métodos alternativos usados para detectar citólise por células CAR-T não medem diretamente o número absoluto de células mortas e vivas, mas avaliam a potência por métodos indiretos que são descritos em detalhes em outra publicação 4,5. Assim, este método dá uma conta absoluta das células efetoras e pode ser usado em co-cultura de 3 tipos de células, dependendo da capacidade do instrumento de imagem. Há muito poucas células necessárias (5000 por poço) que podem mudar juntamente com a liberdade de escolher um ponto de tempo que são enormes vantagens de usar este ensaio. Células-alvo em suspensão e em cultura esferoide tridimensional também podem ser utilizadas em cultura com células efetoras e citólise determinadas conforme descrito anteriormente21. Além disso, esta plataforma pode ser usada para selecionar grandes bibliotecas de pequenas moléculas e compostos para delinear as moléculas mais eficazes e múltiplas dosagens podem ser feitas em vários pontos de tempo.
Além da rapidez e da flexibilidade do sistema, o benefício final é o custo. A máquina de imagem fluorescente, placas e reagentes são todos comuns e acessíveis de comprar, especialmente quando comparados a dispositivos que são mais sofisticados e podem até usar metais preciosos em suas placas de uso único.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
MDA-MB-231 foram um presente gentil do Dr. Shane Stecklein. Os autores agradecem o financiamento do Centro de Câncer da Universidade do Kansas para realizar esta pesquisa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
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