Summary
بروتوكول لتقييم القتل الكمي للخلايا السرطانية بواسطة خلايا جوركات التي تعبر عن مستقبلات المستضد الخيمري (CAR) التي تستهدف مستضد الورم المفرد. يمكن استخدام هذا البروتوكول كمنصة فحص للتحسين السريع لتركيبات مفصلات CAR قبل التأكيد في الخلايا التائية المشتقة من الدم المحيطي.
Abstract
الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) هي في طليعة علم الأورام. يتم إنشاء CAR من مجال استهداف (عادة ما يكون جزءا متغيرا أحادي السلسلة ، scFv) ، مع رابط مصاحب داخل السلسلة ، متبوعا بمفصلة ، وغشاء ، ومجال تكلفة. يمكن أن يكون لتعديل مجال الربط داخل السلسلة والمفصلة تأثير كبير على القتل بوساطة CAR. بالنظر إلى العديد من الخيارات المختلفة لكل جزء من بناء CAR ، هناك أعداد كبيرة من التباديل. يعد صنع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية عملية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة ، كما أن صنع واختبار العديد من التركيبات يعد استثمارا ثقيلا وماديا. يصف هذا البروتوكول منصة للتقييم السريع لبنيات CAR المحسنة للمفصلات في خلايا Jurkat (CAR-J). خلايا Jurkat عبارة عن خط خلايا تائية خلد مع امتصاص عالي لفيروس العدس ، مما يسمح بنقل CAR بكفاءة. هنا ، نقدم منصة لتقييم CAR-J بسرعة باستخدام جهاز تصوير الفلورسنت ، متبوعا بتأكيد التحلل الخلوي في الخلايا التائية المشتقة من PBMC.
Introduction
أظهر العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية وعدا كبيرا في الأورام الخبيثة الدموية ، وهو ما يتضح من 6 منتجات CAR-T المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء منذ عام 2017 ، كما أفاد المعهد الوطني للسرطان1. هناك العديد من الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية في التجارب السريرية لاستهداف الأورام الصلبة. تعد أهداف CAR الجديدة الهندسية وتحسين بنية CAR أمرا حيويا لفعالية خلية CAR-T. يعد اختيار بنية CAR المثالية لكل تطبيق أمرا ضروريا للاستهداف الدقيق للمستضدات المرتبطة بالورم (TAA) مع تجنب المستويات المنخفضة من تعبير TAA في الأنسجة الطبيعية2.
يتكون بناء CAR بشكل أساسي من خمس مقصورات: (1) مجال الجزء المتغير أحادي السلسلة خارج الخلية (scFv) الذي يستهدف مستضد الورم. (2) مجال المفصلات. (3) المجال عبر الغشاء. (4) المجال المكلف للخلايا التائية السيتوبلازمية داخل الخلايا ؛ و (5) مجال الإشارة. يؤثر تعديل كل مجال من هذه المجالات على دقة الخلية التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية التي تتعامل مع الخلية المستهدفة3. ومن ثم ، فإن تقييم السمية الخلوية والتفاعل المتبادل لهذه التركيبات CAR في المختبر أمر بالغ الأهمية لاختيار البنية الصحيحة للتقدم نحو التجارب في الجسم الحي. تشمل الطرق الحالية لتقييم التحلل الخلوي بواسطة الخلايا التائية مقايسة إطلاق 51Cr ، ومقايسة إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات ، ومقايسة التصوير الحيوي ، وتحليل الخلايا القائم على المعاوقة في الوقت الفعلي ، ومقايسة قياس التدفق الخلوي القائم على الخلايا 4,5. تحدد المنصة القائمة على التصوير الفلوري الموصوفة هنا عدد الخلايا الحية مقابل الخلايا الميتة ، وهو تقدير كمي مباشر للتحلل الخلوي للخلايا التائية بدلا من طريقة غير مباشرة لتقييم التحلل الخلوي بواسطة الخلايا التائية.
إليك تقنية سهلة وفعالة من حيث التكلفة وسريعة وعالية الإنتاجية مع الحد الأدنى من التدخل لتقييم السمية الخلوية لخلايا Jurkat التي تعبر عن مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) CAR ضد خلايا سرطان الثدي الثلاثي السلبي MDA-MB-231 (TNBC) و EGFR CRISPR تضرب خلايا MDA-MB-231. خلايا Jurkat هي خلايا الخلايا اللمفاوية التائية البشرية6 التي تم استخدامها على نطاق واسع لدراسة تنشيط الخلايا التائية وآليات الإشارة7. علاوة على ذلك ، تم استخدام خلايا Jurkat لاختبار CAR في المختبر في دراسات متعددة8،9،10،11. يتم تحويل خلايا Jurkat بسهولة بواسطة فيروس lentivirus ولها تكاثر مستدام ، وقد تم الاستفادة من هذا النظام لتحسين المجال المفصلي لمختلف تركيبات EGFR CAR.
يمكن استخدام هذا الاختبار لفحص تركيبات CAR المتعددة التي تستهدف مستضدات الورم المختلفة واستخدامها ضد خطوط الخلايا السرطانية المتعددة الملتصقة وبنسب مختلفة من المستجيب إلى الورم (E: T). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقييم نقاط زمنية متعددة ، ويمكن تعديل عدد النسخ المتماثلة لتحديد أفضل قتل بين مختلف هياكل CAR. يجب تأكيد أفضل التركيبات باستخدام خلايا الدم أحادية النواة الطرفية (PBMCs) المشتقة من خلايا CD3 T. الهدف العام وراء تطوير هذه الطريقة هو التحسين السريع لهندسة مفصلات CAR بطريقة عالية الإنتاجية للتغلب على الحواجز مثل كفاءة النقل المنخفضة ، متبوعة بتأكيد في الخلايا التائية المشتقة من PBMC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تتم جميع أعمال زراعة الخلايا في خزانة السلامة الحيوية مع معطف المختبر والقفازات واتباع تقنيات التعقيم القياسية.
1. توليد CAR التعبير عن Jurkats (CAR-J)
- شراء خلايا Jurkat ، استنساخ E6-1 من ATCC. قم بإذابة 1 × 106 خلايا في قارورة T-75 واستزراعها في قوارير T-75. احتفظ بها معلقة عند 0.6 × 106 خلايا لكل مل باستخدام وسائط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) المكملة ب 10٪ FBS في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- صفيحة 1 × 105 خلايا جوركات لكل بئر من زراعة الأنسجة عالجت 24 صفيحة بئر في 500 ميكرولتر من وسائط نمو RPMI تحتوي على 4 ميكروغرام / مل بوليبرين مما يعزز كفاءة الفيروسات العدسية. عد الخلايا باستخدام محلل الخلايا العلوية لمنضدة الكشف عن الفلورسنت القائم على الليزر. يعتمد عدد الآبار على عدد الإنشاءات المراد تقييمها. سيستخدم هذا المثال 4 بنيات وعنصر تحكم غير محول. يظهر تصميم بناء CAR في الجدول 1.
- أضف 10 ميكرولتر من فيروس عدسي / بئر من كل بناء CAR. تم تصميم بناء CAR وإنتاج فيروس lentivirus كما هو موضح سابقا12.
- في اليوم التالي ، أضف 1 مل من وسائط RPMI للنمو إلى كل بئر واستمر في الزراعة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- جمع الخلايا 2 أيام في وقت لاحق (مجموع 72 ساعة بعد نقل Jurkat) وعدها.
- خذ 1 × 104 خلايا لتشغيل التدفق لتأكيد تعبير CAR على خلايا Jurkat. باختصار ، اغسل الخلايا 2x بمحلول تلطيخ FACS (FSS) قبل وضع علامة CAR-J بالأجسام المضادة التي تستهدف علامة العلم المستخدمة للكشف عن إيجابية CAR لمدة 30 دقيقة في الظلام عند 4 درجات مئوية. اغسل 2x مرة أخرى باستخدام FSS وقم بتشغيل الخلايا من خلال مقياس التدفق الخلوي كما هو موضح سابقا12. استخدم تركيز الأجسام المضادة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
- يتم تحويل خلايا Jurkat بسهولة وتظهر دائما تعبير CAR بنسبة >90٪. قم بإنتاج CAR-J قبل فترة طويلة من مقايسة السمية الخلوية للثقافة المشتركة وقم بتجميدها لاستخدامها لاحقا.
2. تصفيح الخلايا السرطانية المسمى CFSE
ملاحظة: كانت خلايا MDA-MB-231 (من ATCC ، HTB-26) هدية من متعاون ، وتم إنشاء EGFR KO MDA-MB-231 كما هو موضح سابقا12.
- قم بإذابة 1 × 106 خلايا في قارورة T-75 واستزراعها في قوارير T-75. الحفاظ على الخلايا السرطانية MDA-MB-231 والخلايا السرطانية CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 في 14 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco المكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 والانقسام عند التقاء 70٪ تقريبا.
- راقب الخلايا السرطانية الملتصقة تحت مجهر برايت فيلد العادي لضمان التقاء ما يقرب من 70٪.
- قم بإزالة وسائط النمو من القارورة باستخدام ماصة مصلية. أضف 3 مل من التربسين إلى دورق T75 وضعه في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 3-5 دقائق لفصل الخلايا عن القارورة.
- تحييد التربسين باستخدام كمية متساوية (3 مل) من وسائط النمو. اجمع تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي وقم بتدوير الخلايا بسرعة 400 × جم لمدة 4 دقائق لتكسير الخلايا.
- تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). أوجد تركيز الخلية باستخدام عداد خلوي.
- انقل 8 × 105 خلايا إلى أنبوب آخر سعة 15 مل وأضف PBS ليصل حجمه إلى 1 مل.
- أضف 2 ميكرولتر من إستر كربوكسي فلوريسئين سكسينيميديل (CFSE ؛ تركيز مخزون 5 ميكرومتر) في كل أنبوب واخلطه جيدا باستخدام ماصة 1 مل.
- احتضان الخلايا مع CFSE لمدة 20 دقيقة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. أخرج الأنابيب من الحاضنة بعد 20 دقيقة وأضف 5 مل من وسائط النمو إلى الأنبوب.
- أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 400 × غرام لمدة 4 دقائق لبيليه أسفل الخلايا المسمى CFSE. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة وأضف 1 مل من الوسائط الطازجة لإعادة تعليق الخلايا.
- أعد تقييم تركيز الخلية باستخدام عداد الخلية. نقل 4 × 105 خلايا إلى خزان كاشف 25 مل وإضافة وسائط لحجم إجمالي قدره 8 مل.
- لضمان حجم كاف لزرع 5000 خلية سرطانية / بئر في 100 ميكرولتر من الوسائط ، يجب أن يكون الحجم قادرا على الماصة باستخدام الماصة متعددة القنوات ، وللتعويض عن فقدان عدد قليل من الخلايا خلال الخطوة 1.7 ، قم بإعداد 10٪ -20٪ خلايا إضافية وحجم الوسائط.
- امزج تعليق الخلية باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل جيدا. باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 100 ميكرولتر ، ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل صف من لوحة البئر السوداء 96 ذات القاع المسطح الشفافة في النصف الأيسر. يمكن العثور على استراتيجية طلاء عينة في الجدول 2.
- خلايا ماصة EGFR KO بالمثل على النصف الأيمن من اللوحة. بمجرد طلاء اللوحة بأكملها ، اسحب اللوحة ذهابا وإيابا وجنبا إلى جنب على منصة غطاء زراعة الأنسجة لضمان التوزيع الموحد للخلايا السرطانية في الآبار.
- احتضان اللوحة لمدة 4 ساعات في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 للخلايا السرطانية لتعلق.
3. المشاركة في زراعة CAR للتعبير عن Jurkats مع الخلايا السرطانية المسماة CFSE
- باستخدام عدد الخلايا غير المحولة وخلايا CAR التي تعبر عن Jurkat ، انقل 4 × 105 خلايا من كل CAR-J إلى خزان سعة 25 مل. أضف وسائط نمو DMEM لحجم إجمالي قدره 2 مل.
- بالنسبة ل E: T من 4: 1 ، تمت إضافة 2 × 104 CAR-J لكل بئر في 100 ميكرولتر من الوسائط باستخدام ماصة متعددة القنوات برفق على طول جانب كل بئر حتى لا تزعج الخلايا السرطانية المرفقة.
- أضف 100 ميكرولتر أخرى من وسائط النمو باستخدام ماصة متعددة القنوات إلى جانب الآبار التي تحتوي على الخلايا السرطانية وخلايا Jurkat. تحصل مجموعات الورم فقط على 200 ميكرولتر من الوسائط ليصبح المجموع 300 ميكرولتر من الوسائط في جميع الآبار.
- اسحب اللوحة على طول المنصة ذهابا وإيابا وحركة من جانب إلى آخر لضمان توزيع موحد لخلايا Jurkat على الخلايا السرطانية.
- السماح بالاستزراع المشترك في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 48 ساعة.
4. إعداد لوحة للتصوير
- اصنع محلولا من يوديد البروبيديوم (PI) عند 1 ميكروغرام / مل في وسائط مضان منخفضة الخلفية بناء على عدد الآبار ويحصل كل منها على 100 ميكرولتر من الوسائط.
- ل 84 بئرا إعداد 9 مل من الوسائط التي تحتوي على PI. امزج الوسائط جيدا باستخدام ماصة.
- اصنع 10 مل من محلول Triton-X بنسبة 20٪ عن طريق تخفيف Triton-X بالماء منزوع الأيونات. بعد 48 ساعة من الاستزراع المشترك ، تخلص من المادة الطافية التي تحتوي على CAR-J عن طريق انعكاس واحد للوحة والنقر على منشفة ورقية.
- أضف الآن 100 ميكرولتر من الوسائط المعدة أعلاه (الخطوة 4.2) التي تحتوي على PI في كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات برفق حتى لا تزعج الخلايا السرطانية الملتصقة.
- أضف 20 ميكرولتر من محلول Triton-X بنسبة 20٪ إلى البئر الأول من كل نوع من أنواع الأورام التي تعمل كتحكم كامل في الموتى.
- اترك اللوحة في الحاضنة لمدة 20 دقيقة. تخيل اللوحة باستخدام مقياس التصوير الخلوي بالفلورسنت. يتم تخزين البيانات على الكمبيوتر ويمكن تحليلها في وقت لاحق.
5. تحليل صور الفلورسنت
- استخدم أحد الخلايا الموجودة في الورم فقط لضبط قناة الفلورسنت الخضراء.
- قم بتقليل قناع البئر إلى 98٪ لإزالة الخلايا الموجودة على حافة البئر لأن الإشارة ليست مثالية على الحافة.
- تحديد الخلايا السرطانية الموسومة ب CFSE على قناة CFSE الخضراء الفلورية. قم بتعديل قيمة عتبة شدة التألق لالتقاط جميع الخلايا الموجودة على البئر.
- اضبط الحد الأدنى لقطر الخلية على 25 ميكرومتر لإزالة أي حطام تم اكتشافه على قناة CFSE. يختلف هذا حسب نوع الخلية التي يتم تحليلها.
- قم بتمكين كائنات لمس منفصلة لتعريف الخلايا المنفردة عندما تكون على اتصال مع بعضها البعض.
- حدد CFSE على شاشة الصورة وانظر إلى تراكب الرسوم لمعرفة ما يتم اختياره بواسطة النظام.
- بمجرد التقاط الخلايا التي تحمل علامة CFSE بشكل صحيح ، قم بتعيين بوابات لتحديد عدد الخلايا الحية مقابل الخلايا الميتة.
- عند اختيار الخلايا المسماة CFSE ، قم بإنشاء رسم بياني للأعداد على المحور y مقابل متوسط كثافة PI على المحور x.
- استنادا إلى البئر حيث أضفنا Triton-X (الخطوة 4.5) ، ارسم مقسم للتمييز بين الخلايا منخفضة PI الملطخة مقابل الخلايا عالية PI. يجب أن يحتوي هذا البئر على معظم الخلايا في منطقة عالية ملطخة ب PI.
ملاحظة: يظهر PI الإشارة القاعدية على الخلايا الحية. ومن ثم ، فإن إضافة Triton-X يقتل جميع الخلايا والبقع الساطعة في قناة الفلورسنت الحمراء. هذا يسهل رسم البوابات لفصل الخلايا الميتة عن الخلايا الحية. - اضبط قيمة المحور السيني لتكون أكثر قدرة على عرض الخلايا. الآن قم بتسمية الخلايا منخفضة التلطيخ ب PI على أنها خلايا حية.
- عند تحديد الخلايا الحية ، قم بتعيين مدرج تكراري آخر بمساحة على المحور السيني وحسابه على المحور ص.
- ارسم مقسم آخر باستخدام الورم جيدا فقط لالتقاط الخلايا وليس الحطام. ستبدأ الآبار المعالجة بجوركات في تراكم الحطام الذي سيكون ملطخا ب CFSE ويحتاج إلى إزالته من العد. يتم تصنيف ما تبقى من غير الحطام على أنه "خلايا كبيرة".
- قم بتشغيل التحليل على اللوحة بأكملها وقم بتصدير جدول البيانات الذي يحتوي على الأرقام.
- ارسم الأعداد الكبيرة لتحديد عدد الخلايا السرطانية الحية التي تحمل علامة CFSE المتبقية في البئر بعد التعرض ل CAR-J. تحديد الإحصائيات باستخدام ANOVA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تقييم نطاق نسبة E: T بين 1: 8 و 8: 1 ل CAR-J1 عند 72 ساعة والتي استهدفت EGFR على خلايا TNBC MDA-MB-231. تم تحويل خلايا Jurkat مع فيروس CAR lentivirus مع البوليبرين لتوليد خلايا CAR-J كما هو موضح في الخطوة 2. زادت السمية الخلوية ل CAR-J1 بشكل ملحوظ مع ارتفاع نسبة E: T مع عدم وجود فرق في القتل بنسبة 1: 8 (الشكل 1). لوحظ أكثر من 50٪ قتل في 4: 1 E: T أكثر من 72 ساعة. تم استخدام هذا E: T للتجارب اللاحقة مع تقليل المدة إلى 48 ساعة لتقييم السمية الخلوية السريع لتركيبات CAR المتعددة. تم تصميم EGFR الذي يستهدف تركيبات CAR مع تعديل مجال المفصلات (الجدول 1). المفصلات الأربعة المختلفة المستخدمة هي IgG long و IgG المتوسطة و IgG القصيرة و CD8a كما هو موضح هنا13. تم التعبير عن هذه التركيبات الثلاثة على خلايا Jurkat وإيجابية CAR التي تم تحديدها من خلال تقييم النسبة المئوية للخلايا الموسومة بالعلم عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 2A-D) كما هو موضح هنا12. تم استخدام خلايا Jurkat غير المحولة كمجموعة تحكم لتحديد تعبير CAR وتظهر استراتيجية البوابات في (الشكل 2E). تم تقييم السمية الخلوية لهذه التركيبات 4 CAR المعبر عنها على خلايا Jurkat مقابل EGFR الذي يعبر عن خلايا MDA-MB-231 وخلايا CRISPR EGFR KO MDA-MB-231. لوحظ القتل النوعي للمستضد من قبل جميع التركيبات (الشكل 3 أ) في حين لم يكن هناك قتل كبير لوحظ ضد خلايا EGFR KO (الشكل 3B) مما يشير إلى أن القتل تم بوساطة SCFv على وجه التحديد من خلال scFv فقط. لم يكن هناك قتل من قبل خلايا جوركات غير المتحولة. تظهر أيضا صور تمثيلية لقتل الورم حيث يؤدي تداخل الخلايا السرطانية الموسومة ب CFSE مع النواة الميتة الملطخة ب PI إلى ظهورها باللون الأصفر (الشكل 4). تمثل البيانات 3 تجارب مستقلة مع 6 مكررات تقنية لكل مجموعة.
تم تأكيد ذلك بشكل أكبر من خلال التعبير عن تركيبات CAR هذه على خلايا CD3 T المشتقة من PBMC. هناك تعبير منخفض عن CAR على الخلايا التائية CD3 التي يتم تخصيبها بعد ذلك عن طريق فرز التدفق المعقم (الشكل 5). ومع ذلك ، لم يكن هناك تعبير عن مفصلة CD8 تحتوي على EGFR CAR. ومن ثم تم تقييم 3 تركيبات CAR الأخرى التي تحتوي على IgG طويل ومتوسط IgG وقصير IgG لإمكاناتها السامة للخلايا ضد خلايا MDA-MB-231. هناك اتجاه مماثل للقتل مع IgG القصير الذي يتمتع بأقل قوة سامة للخلايا مقارنة بتركيبات 2 الأخرى (الشكل 6). لتحديد أفضل بنية بين خلايا CAR-T الطويلة و IgG المتوسطة ، تم تقييم تنشيطها مع وبدون التعرض للخلايا السرطانية TNBC عن طريق تلطيخ السيتوكينات داخل الخلايا كما هو موضح سابقا12. يحتوي MDA-MB-436 على مستويات منخفضة من EGFR ويحتوي MDA-MB-468 على أعلى تعبير بروتين EGFR بناء على لطخة غربية مع لوحة من 13 خط خلية TNBC12. كان لخلايا IgG CAR-T الطويلة أقل مستويات التنشيط القاعدي (TNFa ، 4-1BB) وإطلاق منخفض للحبيبات السامة للخلايا (البيرفورين والجرانزيم B)14 دون أي تعرض للخلايا السرطانية (الشكل 7). عند التعرض لخلايا EGFR عالية التعبير عن MDA-MB-468 ، كان لخلايا IgG CAR-T الطويلة أعلى تنشيط يعتمد على TNFa و 4-1BB.
الشكل 1: تقييم EGFR CAR-J1 السام للخلايا على طول نطاق E: T. تم طلاء الخلايا السرطانية MDA-MB-231 المسماة CFSE بخلايا Jurkat غير المحولة أو EGFR التي تستهدف CAR-J1 بنسبة E: T تبلغ 1: 8 و 1: 4 و 1: 2 و 1: 1 و 2: 1 و 4: 1 و 8: 1 مما يدل على زيادة السمية الخلوية مع الخلايا المستجيبة الأعلى. تم تمثيل البيانات كمتوسط ± SD وتم تقييم الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t للطالب. 1: 8 E: T كان غير مهم ، 1: 4 E: T كان ***p <0.001 ، والباقي ****p <0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إنتاج EGFR CAR Jurkat للتقييم السام للخلايا في المختبر . (أ-د) ما يقرب من 90٪ -100٪ تعبير CAR من 4 تركيبات مختلفة CAR IgG طويلة ، CAR IgG متوسطة ، CAR IgG قصيرة ، CAR CD8a. (ه) استراتيجية البوابات لتحديد إيجابية CAR: الحطام المستبعد في مخطط SSC-A مقابل FSC-A ؛ الخلايا المفردة المحددة في مخطط FSC-H مقابل FSC-A ؛ والخلايا الحية المختارة بواسطة صبغة الجدوى DAPI بوابة سلبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تقييم السمية الخلوية في الاستزراع المشترك للخلايا السرطانية الموسومة ب CAR-J و CFSE. (أ) تم طلاء خلايا MDA MB 231 التي تحمل علامة CFSE ب CAR-J بنسبة 4: 1 E: T لمدة 48 ساعة مما يدل على فعالية متفاوتة في قتل الخلايا السرطانية. (ب) لم تتعرض خلايا CRISPR EGFR KO MDA MB 231 المسماة CFSE لأي قتل من قبل أي من خلايا CAR-J. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SD وتم تقييم الدلالة الإحصائية باستخدام ANOVA. **ص<0.01; ص<0.0001; NS: ليس مهما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التمثيل المرئي للصور بعد 48 ساعة من الثقافة المشتركة. (أ) مجموعة الورم فقط مع الخلايا السرطانية الموسومة ب CFSE (الأخضر). (ب) إضافة خلايا جوركات غير متحولة، حيث تكون الخلايا الحمراء هي خلايا الجركات الميتة، و(ج) تراكب من اللونين الأخضر والأحمر يشير إلى الخلايا السرطانية الميتة (الصفراء) كما هو موضح بالأسهم. يتم تحديد عدد الخلايا الخضراء غير الصفراء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: إثراء الخلايا التائية EGFR CD3 CAR-T. (أ-ب) تقييم تعبير مستقبلات المستضدات الخيمرية عن طريق تحديد النسبة المئوية للخلايا الموجبة والخلايا الموجبة IgG قبل التخصيب و (ج) بعد التخصيب عن طريق فرز التدفق المعقم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تقييم السمية الخلوية في الاستزراع المشترك للخلايا السرطانية الموسومة CD3 CAR-T و CFSE. تم طلاء خلايا MDA MB 231 المسماة CFSE ب CAR-J بنسبة 4: 1 E: T لمدة 48 ساعة مما يدل على فعالية متفاوتة في قتل الخلايا السرطانية. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SD وتم تقييم الدلالة الإحصائية باستخدام ANOVA. **ص<0.01; ص<0.0001; NS: ليس مهما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تنشيط الخلايا التائية EGFR CD3 CAR-T. تعرضت الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية للخلايا السرطانية وتم تقييم مستويات السيتوكين داخل الخلايا ل (أ) TNFa و (B) 4-1BB و (ج) بيرفورين و (د) جرانزيم ب. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SD وتم تقييم الدلالة الإحصائية باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه * p<0.05; **ص<0.01; **ص<0.001; ص<0.0001; NS: ليس مهما. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| لا. من السلطة الفلسطينية EGFR806 scFv | Vh-VL رابط | المفصلي / فاصل | تي إم | السيتوبلازم |
| سيارة IgG طويل | ويتلو (18 أأ) | IgG4 مكافئ CH2 CH3 (229 AA) | سي دي 4 | 4-1BB / CD3z |
| CAR IgG متوسطة | ويتلو | IgG4 CH3 (129 AA) | سي دي 28 | 4-1BB / CD3z |
| سيارة IgG قصيرة | ويتلو | IgG قصير (12 أأ) | سي دي 4 | 4-1BB / CD3z |
| سيارة CD8a | ويتلو | CD8 (45 AA) | CD8a | 4-1BB / CD3z |
الجدول 1: تصاميم بناء CAR. الاختصارات: aa = الأحماض الأمينية. TM = الغشاء الغشائي.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | تريتون-X | MDA MB 231 فقط | تريتون-X | MDA MB 231 EGFR KO فقط | ||||||||
| B | MB231 + وهمية 4: 1 | MB231 EGFR KO + وهمية 4: 1 | ||||||||||
| C | MB231 + إيجفر إيغ لونج 4:1 | MB231 إيجفر كو + إيجفر إيغ لونج 4: 1 | ||||||||||
| D | MB231 + EGFR IgG متوسط 4: 1 | MB231 إيجفر كو + إيجفر إيغ إيغ متوسط 4:1 | ||||||||||
| E | MB231 + EGFR IgG قصير 4: 1 | MB231 إيجفر كو + إيجفر إيغ إيغ قصير 4:1 | ||||||||||
| F | MB231 + EGFR CD8a 4: 1 | MB231 إيجفر كو + إيجفر CD8a 4: 1 | ||||||||||
| G | ||||||||||||
| H | ||||||||||||
الجدول 2: استراتيجية طلاء العينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد اقترحنا هنا طريقة سريعة لتقييم النشاط الخلوي الخاص بالهدف الناجم عن تعبير CAR في خلايا Jurkat بكفاءة. جميع تركيبات CAR لها نفس scFv ولكن مجالات مفصلية وغشائية مختلفة ثبت أنها تؤثر على فاعلية الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضداتالوهمية 13. تم إجراء مزيد من التقييم للقتل غير النوعي بواسطة CAR-J عن طريق زراعتها بخلايا ضربة قاضية للمستضد (KO). هذا يدل على أن القتل هو مستضد الورم الخاص وليس بسبب التنشيط القاعدي بواسطة CAR-J. يمكن بسهولة تحديد الإمكانات السامة للخلايا لمجموعة من نسب E: T بتحديد أقل عدد من الخلايا المستجيبة المطلوبة للقضاء على الخلايا السرطانية في نقاط زمنية محددة. يمكن أيضا استخدام خطوط خلايا متعددة من نفس نوع السرطان أو نوع مختلف والخلايا الطبيعية لتقييم خصوصية هذه البنى. يمكن بعد ذلك تمييز المرشحين الأكثر فعالية الذين تم تحديدهم بواسطة منصة CAR-J بشكل أكبر من خلال التعبير عن CAR على الخلايا التائية CD3 المشتقة من PBMC وإجراء فحوصات قتل مماثلة وتقييم الإرهاق والتنشيط عند التعرض للخلايا السرطانية الإيجابية والسلبية للمستضد.
تجدر الإشارة إلى أن خلايا Jurkat هي خلايا CD4 + مع مسار إشارات متغير لمستقبلات الخلايا التائية (TCR)15. ومن ثم ، يجب أن يتم تحسين مجال الإشارات داخل الخلايا لبنيات CAR بشكل مثالي مع الخلايا التائية CD316 وقد لا يعمل بشكل أفضل مع خلايا Jurkat. ومن المثير للاهتمام ، أن خلايا CD4 T تعرض السمية الخلوية كما هو موضح في منشور سابق حيث أن EGFR الذي يستهدف خلايا CD4 CAR-T ذات المفصلة الطويلة IgG قادر على القضاء تماما على أورام TNBC في نموذج الورم داخل الجمجمة12. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر الخلايا التائية CD4 CAR T قوة طويلة الأمد وقتل أفضل مقارنة بمزيج من الخلايا التائية CD4 و CD8 أو الخلايا التائية CD8 وحدها في نموذج الورم GBM مما يجعلها مجموعة فرعية من الخلايا التائية المهمة سريريا لعلاج CAR-T الفعال17.
تنتج خلايا Jurkat IL2 وتنظم CD69 عند التنشيط ، على الرغم من أنها لا تفرز جميع السيتوكينات لتنشيط الخلايا التائية الأولية 8,18. ومع ذلك ، فإن تقييم مستويات IL2 و CD69 يعلم فيما يتعلق بتنشيط خلايا Jurkat وليس عن التحلل الخلوي المباشر للخلايا المستهدفة التي يتم تحديدها كميا بأعداد الخلايا السرطانية المطلقة من خلال هذا النهج. ومع ذلك ، فإن تقييم السمية الخلوية والتنشيط مهم لفهم تأثيرات جزيئات CAR الجديدة بشكل كامل.
يمكن تعديل مدة الثقافة المشتركة في هذه التجربة بناء على التركيبات المستخدمة. تم العثور على وضع العلامات CFSE على الخلايا السرطانية لتكون قابلة للكشف حتى 4 أيام بعد الطلاء. وبالتالي ، لتحقيق نسبة إشارة عالية إلى الضوضاء ، تم إجراء التجارب في غضون 72 ساعة. نظرا لأن شدة CFSE تنخفض عند انقسام الخلايا السرطانية ، فقد تحتاج كمية CFSE المستخدمة والمدة إلى التغيير وفقا للخلايا السرطانية المستخدمة. نظرا لأن هذه تجربة عالية الإنتاجية لتحليل تركيبات متعددة في وقت واحد ، فإن كثافة البذر للخلايا المستهدفة في لوحة بئر 96 تحتاج أيضا إلى التحسين. يجب الحفاظ على الخلايا المستهدفة بحيث لا تنمو بشكل مفرط أو يكون لها قيود نمو تنافسية بنهاية الفحص دون الحاجة إلى تغيير الوسائط لتقليل أي تدخل. يمكن استخدام ألواح الآبار الأكبر حجما لاستيعاب المزيد من الخلايا وزيادة طول عمر التجربة. ومع ذلك ، يجب خياطة الصور للحصول على صورة كاملة للبئر ويجب العمل على كل بئر على حدة ، مما قد لا يجعلها سريعة وعالية الإنتاجية.
هناك نهج آخر لخلايا الورم الفلورية طويلة المدى لوضع العلامات على الخلايا السرطانية عن طريق نقل الفيروسات العدسية مع بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) أو البروتين الفلوري الأحمر (RFP). يجب إجراء الاختيار النسيلي المناسب لاختيار المستعمرات عالية التخصيب (حوالي 100٪) الأكثر سطوعا للحصول على أفضل نسبة إشارة إلى الضوضاء. يجب اختيار صبغة الصلاحية بشكل مناسب بناء على كاشفات الفلورسنت في أداة التصوير.
يعتمد مضان الخلفية على الوسائط المستخدمة ، وبالتالي يجب التحقق منها لتجنب فقدان الإشارة أثناء التقاط الصور. تحتوي الوسائط العادية على مكونات تنبعث منها مضان كبير عند الإثارة. يوصى باستخدام وسائط خلفية منخفضة19. يمكن استخدام PBS ولكنه قد يؤثر على الخلايا أثناء الحصول على الصور حيث يستغرق الأمر حوالي 20 دقيقة للحصول على الصور اعتمادا على الإعدادات المحددة لالتقاط الصور.
أحد قيود هذا الفحص هو عدم القدرة على التقاط الصور في نقاط زمنية متعددة لنفس لوحة البئر 96 بعد إضافة صبغة قابلة للحياة. لم يتم تقييم تأثير إضافة مؤشر الأداء على مدى فترة طويلة لهذا المنشور. ومع ذلك ، سيكون من المثالي أن تكون قادرا على اكتشاف الخلايا المستهدفة الحية والميتة / المحتضرة خلال فترة باستخدام نفس اللوحة. قد يكون من الصعب فصل الخلايا الفردية إذا أصبحت الخلايا متقاربة. يمكن استخدام منطقة الخلية أحادية الطبقة وشدة التألق لمقارنة النسبة المئوية للخلايا الحية / الميتة كما هو موضح20.
الطرق البديلة المستخدمة للكشف عن التحلل الخلوي بواسطة الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية لا تقيس بشكل مباشر العدد المطلق للخلايا الميتة والحية ، بل تقيم الفاعلية بطرق غير مباشرة موصوفة بالتفصيل في مكان آخر 4,5. لذلك ، تعطي هذه الطريقة حسابا مطلقا للخلايا المستجيبة ويمكن استخدامها في الزراعة المشتركة ل 3 أنواع من الخلايا أيضا اعتمادا على قدرة أداة التصوير. هناك عدد قليل جدا من الخلايا المطلوبة (5000 لكل بئر) والتي قد تتغير جنبا إلى جنب مع حرية اختيار نقطة زمنية وهي مزايا كبيرة لاستخدام هذا الفحص. يمكن أيضا استخدام الخلايا المستهدفة في المزرعة المعلقة وفي الثقافة الكروية ثلاثية الأبعاد في الثقافة مع تحديد الخلايا المستجيبة والتحلل الخلوي كما هو موضح في مكان آخر21. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه المنصة لفحص مكتبات كبيرة من الجزيئات والمركبات الصغيرة لتحديد الجزيئات الأكثر فعالية ويمكن إجراء جرعات متعددة في نقاط زمنية متعددة.
إلى جانب سرعة ومرونة النظام ، فإن الفائدة النهائية هي التكلفة. آلة التصوير الفلورية والألواح والكواشف كلها شائعة وبأسعار معقولة للشراء ، خاصة عند مقارنتها بالأجهزة الأكثر تطورا وقد تستخدم حتى المعادن الثمينة في لوحاتها ذات الاستخدام الواحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
كانت MDA-MB-231 هدية كريمة من الدكتور شين ستيكلين. يقر المؤلفون بالتمويل من مركز السرطان بجامعة كانساس لإجراء هذا البحث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Methods in Cell Biology. 167, Academic Press. 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D. Jr, Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis. , https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023).
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
