Summary
단일 종양 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 Jurkat 세포에 의한 정량적 종양 세포 사멸을 평가하기 위한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 말초 혈액 유래 T 세포에서 확인하기 전에 CAR hinge 구조를 신속하게 최적화하기 위한 스크리닝 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.
Abstract
키메라 항원 수용체(CAR) T 세포는 종양학의 최전선에 있습니다. CAR은 표적 도메인(일반적으로 단일 사슬 변수 단편, scFv)으로 구성되며, 동반되는 사슬 내 링커와 힌지, 막관통 및 늑골 도메인이 뒤따릅니다. 사슬 내 링커(intra-chain linker)와 힌지 도메인(hinge domain)의 변형은 CAR 매개 사멸에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. CAR 구성의 각 부분에 대한 다양한 옵션을 고려할 때 많은 수의 순열이 있습니다. CAR-T 세포를 만드는 것은 시간과 비용이 많이 드는 공정이며, 많은 구조를 만들고 테스트하는 것은 많은 시간과 재료 투자입니다. 이 프로토콜은 Jurkat 세포(CAR-J)에서 힌지 최적화 CAR 구조를 신속하게 평가하기 위한 플랫폼을 설명합니다. Jurkat 세포는 렌티바이러스 흡수율이 높은 불멸화된 T 세포주로, 효율적인 CAR transduction이 가능합니다. 여기서는 형광 이미저를 사용하여 CAR-J를 신속하게 평가한 후 PBMC 유래 T 세포의 세포 용해를 확인할 수 있는 플랫폼을 제시합니다.
Introduction
미국 국립암연구소(National Cancer Institute)가 발표한 바에 따르면, CAR-T 세포 치료제는 2017년 이후 FDA가 승인한 6개의 CAR-T 제품에서 분명하게 드러나는 혈액 악성 종양에 대한 큰 가능성을 보여주었습니다1. 고형 종양을 표적으로 하는 수많은 CAR-T 세포가 임상시험에 참여하고 있습니다. 새로운 CAR 표적을 엔지니어링하고 CAR 구조를 최적화하는 것은 CAR-T 세포의 효능에 매우 중요합니다. 종양 관련 항원(TAA)을 정확하게 표적화하는 동시에 정상 조직에서 낮은 수준의 TAA 발현을 피하기 위해서는 각 응용 분야에 이상적인 CAR 구조를 선택하는 것이 필수적이다2.
CAR 구조체는 주로 5개의 구획으로 이루어진다: (1) 종양 항원을 표적으로 하는 세포외 단일사슬 가변 단편(scFv) 도메인; (2) 힌지 도메인; (3) 막관통 도메인; (4) 세포내 세포질 T 세포 늑골 도메인; 및 (5) 신호 영역. 이러한 각 도메인의 변형은 표적 셀3과 결합하는 CAR-T 셀의 정밀도에 영향을 미칩니다. 따라서 in vitro에서 이러한 CAR 구조체의 세포 독성 및 교차 반응성을 평가하는 것은 in vivo 실험을 진행하기 위한 올바른 구조체를 선택하는 데 중요합니다. 현재 T 세포에 의한 세포 분해를 평가하는 방법에는 51Cr 방출 분석, 젖산 탈수소효소 방출 분석, 생물 발광 이미징 분석, 실시간 임피던스 기반 세포 분석 및 세포 기반 유세포 분석분석 4,5가 포함됩니다. 여기에 설명된 형광 이미징 기반 플랫폼은 살아있는 세포와 죽은 세포의 수를 식별하며, 이는 T 세포에 의한 세포 용해를 평가하는 간접적인 방법과 달리 T 세포 세포 용해의 직접적인 정량화입니다.
다음은 MDA-MB-231 삼중음성 유방암(TNBC) 세포 및 EGFR CRISPR knock out MDA-MB-231 세포에 대한 표피 성장 인자 수용체(EGFR) CAR을 발현하는 Jurkat 세포의 세포 독성을 평가하기 위한 최소한의 개입으로 쉽고 비용 효율적이며 빠르고 처리량이 높은 기술입니다. 주르캣 세포(Jurkat cell)는 불멸의 인간 T 림프구 세포(human T lymphocyte cell)6로, T 세포 활성화 및 신호전달 기전을 연구하는 데 널리 사용되어 왔다7. 또한, Jurkat 세포는 여러 연구에서 시험관 내 CAR 테스트에 사용되었습니다 8,9,10,11. Jurkat 세포는 렌티바이러스에 의해 쉽게 transduction되고 지속적인 증식을 가지고 있으며, 이 시스템은 다양한 EGFR CAR 구조의 힌지 도메인을 최적화하는 데 활용되었습니다.
이 분석법은 다양한 종양 항원을 표적으로 하는 여러 CAR 구조체를 스크리닝하는 데 사용할 수 있으며 여러 부착 종양 세포주 및 다양한 이펙터 대 종양(E:T) 비율에 사용할 수 있습니다. 또한 여러 시점을 평가할 수 있으며 반복실험 횟수를 수정하여 다양한 CAR 구성 중에서 최상의 사멸을 식별할 수 있습니다. 최상의 구성물은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 유래 CD3 T 세포를 사용하여 확인해야 합니다. 이 방법 개발의 전반적인 목표는 낮은 형질도입 효율과 같은 장벽을 극복하고 PBMC 유래 T 세포를 확인하는 고처리량 방식으로 CAR 힌지 형상을 신속하게 최적화하는 것입니다.
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Protocol
알림: 모든 세포 배양 작업은 실험실 가운, 장갑 및 표준 무균 기술에 따라 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다.
1. Jurkats를 발현하는 CAR 생성 (CAR-J)
- Jurkat 세포를 구입하고 ATCC에서 E6-1을 복제하십시오. T-75 플라스크에서 1 x 106 세포를 해동하고 T-75 플라스크에서 배양합니다. 5 % CO2 의 37 ° C에서 10 % FBS가 보충 된 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 배지를 사용하여 mL 당 0.6 x 106 세포로 현탁액으로 유지합니다.
- 플레이트 1 x 105 Jurkat 세포는 렌티바이러스 효율을 향상시키는 4μg/mL 폴리브렌을 함유한 500μL의 RPMI 성장 배지에 처리된 조직 배양 웰당 24웰 플레이트를 처리합니다. 레이저 기반 형광 검출 벤치탑 세포 분석기를 사용하여 세포 계수를 계산합니다. 웰의 수는 평가할 구성의 수에 따라 달라집니다. 이 예제에서는 4개의 구문과 변환되지 않은 컨트롤을 사용합니다. CAR 구조 설계는 표 1에 나타내었다.
- 각 CAR 구조체의 렌티바이러스/웰 10μL를 추가합니다. CAR 구축물 설계 및 렌티바이러스 생산은 앞서 설명한 바와 같이 수행하였다12.
- 다음날 각 웰에 1mL의 성장 RPMI 배지를 추가하고 5 % CO2 로 37 ° C의 인큐베이터에서 계속 배양합니다.
- 2일 후(Jurkat 형질도입 후 총 72시간) 세포를 수집하고 계수합니다.
- Jurkat 세포에서 CAR 발현을 확인하기 위해 1 x 104 세포를 흐름 흐름에 사용합니다. 간단히 말해서, 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 CAR 양성을 검출하는 데 사용되는 플래그 태그를 표적으로 하는 항체로 CAR-J를 라벨링하기 전에 FACS 염색액(FSS)으로 세포를 2배 세척합니다. FSS로 다시 2회 세척하고 앞서 설명한 대로 유세포 분석기를 통해 세포를 실행합니다12. 제조업체에서 권장하는 항체 농도를 사용하십시오.
- Jurkat 세포는 쉽게 transduction되며 거의 항상 >90%의 CAR 발현을 보입니다. CAR-J는 공동 배양 세포독성 분석보다 훨씬 앞서 생산하고 나중에 사용할 수 있도록 냉동합니다.
2. CFSE 표지 종양 세포 도금
참고: MDA-MB-231(ATCC, HTB-26) 세포는 공동 연구자의 선물이며, EGFR KO MDA-MB-231은 앞서 설명한 바와 같이 생성되었습니다12.
- T-75 플라스크에서 1 x 106 세포를 해동하고 T-75 플라스크에서 배양합니다. MDA-MB-231 종양 세포와 CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 종양 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 14mL에 5%CO2 가 있는 37°C의 인큐베이터에서 유지하고 약 70%가 합류하면 분할합니다.
- 일반 명시야 현미경으로 부착 종양 세포를 관찰하여 거의 70%의 합류도를 확인합니다.
- 혈청학적 피펫을 사용하여 플라스크에서 성장 배지를 제거합니다. T75 플라스크에 트립신 3mL를 넣고 37°C의 인큐베이터에 5%CO2 와 함께 3-5분 동안 넣어 플라스크에서 세포를 분리합니다.
- 동일한 양(3mL)의 성장 배지를 사용하여 트립신을 중화합니다. 원심분리기 튜브에 세포 현탁액을 모으고 400 x g 에서 4분 동안 세포를 회전시켜 세포를 펠릿 아래로 떨어뜨립니다.
- 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 세포를 2mL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁시킵니다. 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 측정합니다.
- 8 x 105 세포를 다른 15mL 튜브에 옮기고 PBS를 추가하여 부피가 1mL가 되도록 합니다.
- 2μL의 카르복시플루오레세인 숙시니미딜 에스테르(CFSE, 5μM 원액 농도)를 각 튜브에 넣고 1mL 피펫을 사용하여 잘 혼합합니다.
- 37 ° C의 인큐베이터에서 5 % CO 2 로 20 분 동안 CFSE로 세포를 배양합니다. 20분 후 인큐베이터에서 튜브를 제거하고 5mL의 성장 배지를 튜브에 추가합니다.
- 튜브를 400 x g 에서 4분 동안 원심분리하여 CFSE 라벨이 부착된 세포를 펠릿 아래로 펠릿화합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 버리고 1mL의 새 배지를 추가하여 세포를 재현탁시킵니다.
- 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 재평가합니다. 4 x 105 세포를 25mL 시약 reservoir에 옮기고 배지를 추가하여 총 부피 8mL를 만듭니다.
- 100μL의 배지에 5000개의 종양 세포/웰을 파종할 수 있는 충분한 부피를 확보하려면 멀티채널 피펫을 사용하여 피펫팅할 수 있어야 하며, 1.7단계 동안 일부 세포의 손실을 보상하기 위해 10%-20%의 추가 세포와 배지 부피를 준비해야 합니다.
- 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 완전히 혼합합니다. 100 μL 멀티채널 피펫을 사용하여 100 μL의 셀 현탁액을 왼쪽 절반에 있는 투명하고 평평한 바닥 검은색 96웰 플레이트의 각 열에 피펫팅합니다. 샘플 도금 전략은 표 2에서 찾을 수 있습니다.
- 피펫 EGFR KO 세포는 플레이트의 오른쪽 절반에 유사하게 있습니다. 전체 플레이트가 도금되면 조직 배양 후드 플랫폼에서 플레이트를 앞뒤로 좌우로 끌어 웰에 종양 세포가 균일하게 분포되도록 합니다.
- 종양 세포가 부착할 수 있도록 37°C의 인큐베이터에서 5%CO2 로 플레이트를 4시간 동안 배양합니다.
3. CFSE 표지 종양 세포와 Jurkat을 발현하는 CAR의 공동 배양
- transduction되지 않은 세포 및 CAR 발현 Jurkat 세포의 수를 사용하여 각 CAR-J의 4 x 105 세포를 25mL reservoir로 전달합니다. 총 부피 2mL의 DMEM 성장 배지를 추가합니다.
- 4:1의 E:T의 경우, 부착된 종양 세포를 방해하지 않도록 멀티채널 피펫을 사용하여 100μL의 배지에 웰당2 x 10 4 CAR-J를 첨가하여 각 웰의 측면을 따라 부드럽게 첨가했습니다.
- 종양 세포와 Jurkat 세포가 들어 있는 웰 측면에 멀티채널 피펫을 사용하여 100μL의 성장 배지를 추가합니다. 종양 그룹만 200μL의 배지를 얻어 모든 웰에서 총 300μL의 배지를 만듭니다.
- 플랫폼을 따라 플레이트를 앞뒤로 그리고 좌우로 드래그하여 종양 세포에 Jurkat 세포가 균일하게 분포되도록 합니다.
- 37°C의 인큐베이터에서 5% CO2 로 48시간 동안 공동 배양합니다.
4. 이미징을 위한 플레이트 준비
- 웰 수에 따라 낮은 백그라운드 형광 매체에서 1μg/mL의 프로피듐 요오드화물(PI) 용액을 만들고 각각 100μL의 매체를 얻습니다.
- 84웰의 경우 PI가 포함된 배지 9mL를 준비합니다. 피펫을 사용하여 매체를 완전히 혼합합니다.
- Triton-X를 탈이온수로 희석하여 20% Triton-X 용액 10mL를 만듭니다. 48시간의 공동 배양 후 CAR-J가 포함된 상층액을 플레이트를 한 번 뒤집고 종이 타월을 두드려 버립니다.
- 이제 부착된 종양 세포를 방해하지 않도록 멀티채널 피펫을 사용하여 PI가 포함된 위의 준비된 배지 100μL(4.2단계)를 각 웰에 부드럽게 추가합니다.
- 20μL의 20% Triton-X 용액을 각 종양 유형의 첫 번째 웰에 추가하여 전체 데드 컨트롤 기능을 합니다.
- 플레이트를 인큐베이터에 20분 동안 그대로 둡니다. 형광 이미징 세포분석기를 사용하여 플레이트를 이미지화합니다. 데이터는 컴퓨터에 저장되며 나중에 분석할 수 있습니다.
5. 형광 이미지 분석
- 녹색 형광 채널을 설정하기 위해 세포의 종양 중 하나를 사용하십시오.
- 웰 마스크를 98%로 줄여 웰 가장자리의 셀을 제거하는데, 이는 신호가 가장자리에서 완벽하지 않기 때문입니다.
- 녹색 형광 CFSE 채널에서 CFSE 표지 종양 세포를 식별합니다. 형광 강도 임계값을 수정하여 웰의 모든 세포를 선택합니다.
- 최소 셀 직경을 25μm로 설정하여 CFSE 채널에서 감지된 파편을 제거합니다. 이는 분석되는 세포 유형에 따라 다릅니다.
- Separate Touching Objects를 활성화하여 서로 접촉할 때 개별 셀을 식별합니다.
- 이미지 디스플레이에서 CFSE 를 선택하고 그래픽 오버레이를 확인하여 시스템에서 무엇을 선택하는지 파악합니다.
- CFSE 표지된 세포가 제대로 픽업되면 살아있는 세포와 죽은 세포 집단을 정의하기 위해 게이트를 설정합니다.
- CFSE 라벨이 부착된 셀을 선택하여 y축의 카운트 대 x축의 평균 PI 강도에 대한 히스토그램을 생성합니다.
- Triton-X를 추가한 웰(단계 4.5)을 기반으로 스플리터를 그려 PI 염색이 낮은 세포와 PI 염색이 높은 세포를 구별합니다. 이 웰에는 PI가 많이 염색된 영역에 대부분의 세포가 있어야 합니다.
참고: PI는 살아있는 세포의 기초 신호를 보여줍니다. 따라서 Triton-X를 추가하면 모든 세포가 죽고 적색 형광 채널에서 밝게 염색됩니다. 이것은 살아있는 세포에서 죽은 세포를 분리하기 위해 게이트를 쉽게 그릴 수 있습니다. - 셀을 더 잘 볼 수 있도록 x축 값을 조정합니다. 이제 PI가 낮은 염색된 세포를 살아있는 세포로 라벨링합니다.
- 라이브 셀을 선택하고 x축에 area가 있고 y축에 count가 있는 다른 히스토그램을 설정합니다.
- 파편이 아닌 세포를 포획하기 위해 종양만 사용하여 다른 스플리터를 그립니다. Jurkat 처리된 우물은 CFSE로 얼룩지고 카운트에서 제거해야 하는 파편을 축적하기 시작합니다. 나머지 비파편은 "큰 세포"로 표시됩니다.
- 전체 플레이트에서 해석을 실행하고 숫자가 포함된 스프레드시트를 내보냅니다.
- CAR-J에 노출된 후 웰에 남아 있는 살아있는 CFSE 표지 종양 세포의 수를 식별하기 위해 빅 카운트를 플로팅합니다. 일원분산분석을 사용하여 통계량을 결정합니다.
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Representative Results
CAR-J1에 대한 1:8 및 8:1 사이의 E:T 비율 범위는 TNBC MDA-MB-231 세포에서 EGFR을 표적으로 하는 72시간에 평가되었습니다. jurkat 세포를 폴리브렌이 포함된 CAR 렌티바이러스로 형질도입하여 단계 2에 설명된 대로 CAR-J 세포를 생성했습니다. CAR-J1의 세포독성은 E:T 비율이 높을수록 유의하게 증가했으며, 1:8 비율에서 사멸 차이는 없었습니다(그림 1). 72시간 동안 4:1 E:T에서 50% 이상의 사멸이 관찰되었습니다. 이 E:T는 여러 CAR 작제물의 신속한 세포 독성 평가를 위해 지속 시간을 48시간으로 단축한 후속 실험에 사용되었습니다. 힌지 도메인이 변형된 CAR 구조체를 표적으로 하는 EGFR을 설계하였다(표 1). 사용되는 4가지 다른 경첩은 여기에 설명된 대로 IgG 길이, IgG 중간, IgG 단락 및 CD8a입니다13. 이들 3개의 작제물은 Jurkat 세포에서 발현되었으며, 여기에 기술된 바와 같이 유세포 분석법(그림 2A-D)에 의한 Flag 표지 세포의 백분율을 평가하여 결정된 CAR 양성을 측정하였다(도 2A-D). 형질도입되지 않은 Jurkat 세포를 대조군으로 사용하여 CAR 발현을 결정하고 게이팅 전략을 (그림 2E)에 나타내었습니다. Jurkat 세포에서 발현된 이 4가지 CAR 구조체의 세포독성은 MDA-MB-231 세포 및 CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 세포를 발현하는 EGFR에 대해 평가되었습니다. 항원 특이적 사멸은 모든 작제물에서 관찰된 반면(그림 3A), EGFR KO 세포에 대해서는 유의한 사멸이 관찰되지 않았으며(그림 3B), 이는 사멸이 scFv만을 통해서만 특이적으로 매개되었음을 시사합니다. 형질도입되지 않은 주르카트 세포에 의한 살해는 없었다. 종양 사멸의 대표적인 이미지도 보여주는데, CFSE로 표지된 종양 세포와 PI 염색된 죽은 핵이 겹치면 노란색으로 보입니다(그림 4). 데이터는 그룹당 6번의 기술 반복실험이 있는 3개의 독립적인 실험을 대표합니다.
이는 PBMC 유래 CD3 T 세포에 이러한 CAR 작제물을 발현시킴으로써 추가로 확인되었다. CD3 T 세포에서 CAR의 발현이 낮으며, 이는 멸균 유동 분류에 의해 농축됩니다(그림 5). 그러나, EGFR CAR을 함유하는 CD8 힌지의 발현은 없었다. 따라서 IgG long, IgG 배지 및 IgG short를 포함하는 다른 3개의 CAR 작제물은 MDA-MB-231 세포에 대한 세포독성 잠재력에 대해 평가되었습니다. IgG short는 다른 2개의 구성물에 비해 세포독성 효능이 가장 적기 때문에 유사한 사멸 추세가 있습니다(그림 6). IgG long 및 IgG medium CAR-T 세포 중 최상의 구조를 식별하기 위해, TNBC 종양 세포에 노출된 경우와 노출되지 않은 경우의 활성화를 앞서 설명한 바와 같이 사이토카인의 세포 내 염색에 의해 평가되었습니다12. MDA-MB-436은 낮은 수준의 EGFR을 가지고 있으며, MDA-MB-468은 13개의 TNBC 세포주12로 구성된 패널로 웨스턴 블롯을 기반으로 가장 높은 EGFR 단백질 발현을 가지고 있다. IgG 긴 CAR-T 세포는 종양 세포에 노출되지 않은 상태에서 기초 활성화 수준(TNFa, 4-1BB)이 가장 낮고 세포독성 과립(퍼포린 및 그랜자임 B)의 방출이 낮았습니다(그림 7). 높은 EGFR 발현 MDA-MB-468 세포에 노출되었을 때, TNFa와 4-1BB를 기반으로 IgG long CAR-T 세포가 가장 높은 활성화를 보였다.
그림 1: E:T 범위에 따른 EGFR CAR-J1 세포독성 평가. CFSE 표지 MDA-MB-231 종양 세포는 1:8, 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 및 8:1의 E:T 비율로 CAR-J1을 표적으로 하는 비형질도입된 Jurkat 세포 또는 EGFR로 도말되었으며, 더 높은 effector 세포에서 증가하는 세포 독성을 보여주었습니다. 데이터는 평균± SD로 표시되며 통계적 유의성은 스튜던트 t-검정을 사용하여 평가되었습니다. 1:8 E:T는 유의하지 않았고, 1:4 E:T는 ***p<0.001, 나머지 ****p<0.0001을 가졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 체외 세포독성 평가를 위한 EGFR CAR Jurkat 생산. (서기-인도) 거의 90%-100% CAR 발현 4가지 다른 구조 CAR IgG long, CAR IgG medium, CAR IgG short, CAR CD8a. (E) CAR 양성률 결정을 위한 게이팅 전략: SSC-A 대 FSC-A 플롯에서 제외된 파편; FSC-H 대 FSC-A 플롯에서 선택된 단일 세포; 및 생존도 염료 DAPI negative gating에 의해 선택된 살아있는 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: CAR-J 및 CFSE 표지 종양 세포의 공동 배양에서의 세포 독성 평가. (A) CFSE 표지 MDA MB 231 세포를 48시간 동안 4:1 E:T 비율로 CAR-J로 도말하여 종양 세포 사멸에 다양한 효능을 보여주었습니다. (B) CFSE로 표지된 CRISPR EGFR KO MDA MB 231 세포는 CAR-J 세포에 의한 사멸을 경험하지 않았습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표현되며 통계적 유의성은 일원 분산 분석을 사용하여 평가되었습니다. **피<0.01; 피<0.0001; NS: 중요하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 공동 배양 48시간 후 이미지의 시각적 표현. (A) CFSE(녹색)로 표지된 종양 세포가 있는 종양 전용 그룹. (B) 형질도입되지 않은 Jurkat 세포의 추가, 적혈구는 죽은 Jurkat 세포이고, (C) 화살표로 표시된 것처럼 죽은 종양 세포(노란색)를 나타내는 녹색과 빨간색의 오버레이. 노란색이 아닌 녹색 셀의 수는 정량화됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: EGFR CD3 CAR-T 세포 농축. (A-B) 농축 전 Flag 양성 및 IgG 양성 세포의 백분율을 결정하여 평가한 CAR 발현 및 (C) 멸균 흐름 정렬에 의한 농축 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: CD3 CAR-T 및 CFSE 표지 종양 세포의 공동 배양에서 세포 독성 평가. CFSE 표지된 MDA MB 231 세포를 48시간 동안 4:1 E:T 비율로 CAR-J로 도말하여 종양 세포 사멸에 다양한 효능을 보였습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표현되며 통계적 유의성은 일원 분산 분석을 사용하여 평가되었습니다. **피<0.01; 피<0.0001; NS: 중요하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: EGFR CD3 CAR-T 세포 활성화. CAR-T 세포를 종양 세포에 노출시키고 (A) TNFa, (B) 4-1BB, (C) perforin 및 (D) granzyme B에 대한 세포 내 사이토카인 수치를 평가했습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시되며 통계적 유의성은 일원 분산 분석(one-way ANOVA) *p<0.05를 사용하여 평가되었습니다. **피<0.01; **피<0.001; 피<0.0001; NS: 중요하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 아니요. PA EGFR806 scFv의 | Vh-Vl 링커 | 힌지/스페이서 | 티엠 | 세포질 |
| 자동차 IgG 롱 | 휘틀로 (18 aa) | IgG4 EQ 채널2 채널3(229aa) | CD4 CD4 CD4 CD4 | 4-1BB / CD3z |
| CAR IgG 배지 | 휘틀로 | IgG4 채널3 (129 aa) | CD28 시리즈 | 4-1BB / CD3z |
| CAR IgG 쇼트 | 휘틀로 | IgG 단락(12aa) | CD4 CD4 CD4 CD4 | 4-1BB / CD3z |
| 자동차 CD8a | 휘틀로 | CD8 (45 aa) | CD8a (CD8a) | 4-1BB / CD3z |
표 1: CAR 구성 설계. 약어: aa = 아미노산; TM = 막관통.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | 트리톤-X | MDA MB 231 전용 | 트리톤-X | MDA MB 231 EGFR KO 전용 | ||||||||
| B | MB231 + 모의 4:1 | MB231 EGFR KO + 모의 4:1 | ||||||||||
| C | MB231 + EGFR IgG 롱 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG 롱 4:1 | ||||||||||
| D | MB231 + EGFR IgG 배지 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG 배지 4:1 | ||||||||||
| E | MB231 + EGFR IgG 쇼트 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG 쇼트 4:1 | ||||||||||
| F | MB231 + EGFR CD8a 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR CD8a 4:1 | ||||||||||
| G | ||||||||||||
| H | ||||||||||||
표 2: 샘플 도금 전략.
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Discussion
여기에서 우리는 Jurkat 세포에서 CAR 발현에 의해 유도된 표적 특이적 세포 용해 활성을 효율적으로 평가할 수 있는 신속한 방법을 제안했습니다. 모든 CAR 구조체는 동일한 scFv를 갖지만 CAR-T 세포 효능에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 힌지 및 막관통 도메인이 다릅니다13. 이들 CAR-J에 의한 비특이적 사멸에 대한 추가 평가는 항원 녹아웃(KO) 세포로 배양하여 수행되었습니다. 이는 사멸이 종양 항원 특이적이며 CAR-J에 의한 기저 활성화에 의한 것이 아님을 보여줍니다. 다양한 E:T 비율의 세포독성 가능성을 쉽게 측정하여 특정 시점에서 종양 세포를 제거하는 데 필요한 최소 수의 effector cell을 식별할 수 있습니다. 동일하거나 상이한 암 유형 및 정상 세포의 여러 세포주를 사용하여 이러한 구성물의 특이성을 평가할 수도 있습니다. CAR-J 플랫폼으로 식별된 가장 강력한 후보 물질은 PBMC 유래 CD3 T 세포에서 CAR을 발현하고 유사한 사멸 분석을 수행하고 항원 양성 및 음성 종양 세포에 노출되었을 때 소진 및 활성화를 평가하여 추가로 특성화할 수 있습니다.
Jurkat 세포는 변형된 T 세포 수용체(TCR) 신호 경로15를 가진 CD4+ 세포라는 점에 유의해야 합니다. 따라서, CAR 구축물의 세포내 신호전달 도메인 최적화는 이상적으로는 CD3 T 세포(16 )로 수행되어야 하며, Jurkat 세포에서는 가장 잘 작동하지 않을 수 있다. 흥미롭게도, CD4 T 세포는 IgG long hinge를 가진 CD4 CAR-T 세포를 표적으로 하는 EGFR이 두개내 종양 모델12에서 TNBC 종양을 완전히 박멸할 수 있다는 이전 논문에서 입증된 바와 같이 세포 독성을 보여줍니다. 또한, CD4 CAR T 세포는 교모세포종 종양 모델에서 CD4 및 CD8 T 세포의 혼합 또는 CD8 T 세포 단독에 비해 장기적인 효능과 더 나은 사멸을 보여주므로 효과적인 CAR-T 치료에 임상적으로 중요한 T 세포 하위 집합이 된다17.
Jurkat 세포는 IL2를 생성하고 활성화 시 CD69를 상향 조절하지만 일차 T 세포 활성화의 모든 사이토카인을 분비하지는 않습니다 8,18. 그러나 IL2 및 CD69 수준을 평가하면 Jurkat 세포가 활성화되는 것에 대해 알 수 있으며 이 접근법에 의해 절대 종양 세포 수로 정량화되는 표적 세포의 직접적인 세포 용해에 대해서는 알 수 없습니다. 그러나 새로운 CAR 분자의 효과를 완전히 이해하려면 세포 독성 및 활성화를 평가하는 것이 중요합니다.
이 실험에서 공동 배양 기간은 사용 중인 구문에 따라 수정할 수 있습니다. 종양 세포에 대한 CFSE 표지는 도금 후 4일까지 검출 가능한 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 높은 신호 대 잡음비를 얻기 위해 72시간 이내에 실험을 수행했습니다. CFSE 강도는 종양 세포가 분열할 때 감소하기 때문에 사용되는 CFSE의 양과 지속 시간은 사용된 종양 세포에 따라 변경되어야 할 수 있습니다. 이 실험은 한 번에 여러 구조물을 분석하기 위한 고처리량 실험이기 때문에 96웰 플레이트에서 표적 세포의 파종 밀도도 최적화해야 합니다. 표적 세포는 개입을 최소화하기 위해 배지를 변경할 필요 없이 분석이 끝날 때까지 과도하게 밀집되거나 경쟁적인 성장 제한이 발생하지 않도록 유지되어야 합니다. 더 큰 웰 플레이트를 사용하여 더 많은 세포를 수용하고 실험 수명을 늘릴 수 있습니다. 그러나 유정의 전체 그림을 얻으려면 이미지를 스티칭해야 하며 각 유정을 개별적으로 작업해야 하므로 빠르고 높은 처리량을 얻지 못할 수 있습니다.
장기 형광 표지 종양 세포의 또 다른 접근법은 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 적색 형광 단백질(RFP)을 사용한 렌티바이러스 형질도입입니다. 최상의 신호 대 잡음비를 위해 고농축(거의 100%) 가장 밝은 콜로니를 선택하려면 적절한 클론 선택을 수행해야 합니다. 생존도 염료는 이미징 기기의 형광 검출기에 따라 적절하게 선택해야 합니다.
배경 형광은 사용 중인 매체에 따라 다르므로 이미지를 획득하는 동안 신호 손실을 방지하기 위해 확인해야 합니다. 일반 배지에는 여기될 때 상당한 형광을 방출하는 성분이 포함되어 있습니다. 낮은 배경 매체를 사용하는 것이 좋습니다19. PBS를 사용할 수 있지만 이미지 캡처를 위해 설정된 설정에 따라 이미지를 획득하는 데 약 20분이 걸리므로 이미지 획득 중에 셀에 영향을 줄 수 있습니다.
이 분석의 한계 중 하나는 생존도 염료를 추가한 후 동일한 96웰 플레이트의 여러 시점에서 이미지를 촬영할 수 없다는 것입니다. 장기간에 걸친 PI 추가의 효과는 이 간행물에서 평가되지 않았습니다. 그러나 동일한 플레이트를 사용하여 일정 기간 동안 살아있는 표적 세포와 죽은 세포/죽어가는 표적 세포를 검출할 수 있는 것이 이상적입니다. 세포가 과도하게 합류하면 개별 세포를 분리하기 어려울 수 있습니다. 세포 단층 및 형광 강도의 면적은 기술된 바와 같이 생존/사멸된 세포의 백분율을 비교하는데 사용될 수 있다20.
CAR-T 세포에 의한 세포 용해를 검출하는 데 사용되는 대체 방법은 죽은 세포와 살아있는 세포의 절대 수를 직접 측정하지 않으며, 다른 곳에서 자세히 설명하는 간접적인 방법으로 효능을 평가합니다 4,5. 따라서 이 방법은 effector cell에 대한 절대적인 설명을 제공하며 이미징 기기의 용량에 따라 3가지 세포 유형의 공동 배양에도 사용할 수 있습니다. 이 분석실험을 사용하는 큰 이점인 시점을 선택하는 자유와 함께 바뀔 수 있는 요구되는 세포가 거의 없습니다(웰당 5000개). 현탁액 및 3차원 스페로이드 배양에서의 표적 세포는 또한 다른 문헌에 기술된 바와 같이 측정된 효과기 세포 및 세포 분해와 함께 배양에 사용될 수 있다21. 또한 이 플랫폼은 가장 효과적인 분자를 설명하기 위해 작은 분자 및 화합물의 대규모 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용할 수 있으며 여러 시점에서 여러 투여를 수행할 수 있습니다.
시스템의 속도와 유연성 외에도 최종 이점은 비용입니다. 형광 이미징 기계, 플레이트 및 시약은 모두 일반적이고 저렴하며, 특히 더 정교하고 일회용 플레이트에 귀금속을 사용할 수 있는 장치와 비교할 때 저렴합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
MDA-MB-231은 셰인 스테클라인 박사의 친절한 선물이었습니다. 저자들은 이 연구를 수행하기 위해 캔자스 대학 암 센터(University of Kansas Cancer Center)의 자금 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Methods in Cell Biology. 167, Academic Press. 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D. Jr, Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis. , https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023).
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
