Summary
פרוטוקול להערכת הרג כמותי של תאי גידול על ידי תאי Jurkat המבטאים קולטן אנטיגן כימרי (CAR) המכוון לאנטיגן גידול יחיד. פרוטוקול זה יכול לשמש כפלטפורמת סינון לאופטימיזציה מהירה של מבני צירי CAR לפני אישור בתאי T היקפיים שמקורם בדם.
Abstract
תאי T של קולטן אנטיגן כימרי (CAR) נמצאים בחזית האונקולוגיה. CAR בנוי מתחום מיקוד (בדרך כלל מקטע משתנה שרשרת יחיד, scFv), עם מקשר תוך-שרשרת נלווה, ואחריו ציר, טרנסממברנה ותחום קוסטימולטורי. שינוי של המקשר התוך-שרשרת ותחום הציר יכול להשפיע באופן משמעותי על הרג בתיווך רכב. בהתחשב באפשרויות השונות הרבות עבור כל חלק של מבנה CAR, ישנם מספר רב של תמורות. ייצור תאי CAR-T הוא תהליך גוזל זמן ויקר, וייצור ובדיקה של מבנים רבים הוא השקעה כבדה בזמן ובחומר. פרוטוקול זה מתאר פלטפורמה להערכה מהירה של מבני CAR ממוטבים לציר בתאי Jurkat (CAR-J). תאי Jurkat הם קו תאי T אימורטלי עם ספיגה גבוהה של לנטיוירוסים, המאפשרים העברת CAR יעילה. כאן, אנו מציגים פלטפורמה להערכה מהירה של CAR-J באמצעות הדמיה פלואורסצנטית, ואחריה אישור של ציטוליזה בתאי T שמקורם ב-PBMC.
Introduction
טיפול בתאי CAR-T הראה הבטחה גדולה בממאירויות המטולוגיות, כפי שעולה מ-6 מוצרי CAR-T שאושרו על ידי ה-FDA מאז 2017, כפי שדווח על ידי המכון הלאומי לסרטן1. ישנם תאי CAR-T רבים בניסויים קליניים להתמקדות בגידולים מוצקים. תכנון מטרות CAR חדשניות ואופטימיזציה של מבנה CAR חיוניים ליעילות של תא CAR-T. בחירת מבנה CAR האידיאלי עבור כל יישום חיונית למיקוד מדויק של אנטיגנים הקשורים לגידול (TAA) תוך הימנעות מרמות נמוכות של ביטוי TAA ברקמות נורמליות2.
מבנה CAR מורכב בעיקר מחמישה תאים: (1) תחום משתנה חד-תאי חוץ-תאי (scFv) המכוון לאנטיגן גידולי; (2) תחום ציר; (3) תחום טרנסממברנלי; (4) תחום קוסטימולטורי ציטופלזמי תוך-תאי של תאי T; ו-(5) תחום האיתות. שינוי כל אחד מתחומים אלה משפיע על הדיוק של תא CAR-T העוסק בתא היעד שלו3. לפיכך, הערכת ציטוטוקסיות ותגובתיות צולבת של מבני CAR אלה במבחנה היא קריטית לבחירת המבנה הנכון להתקדמות לקראת ניסויים in vivo. השיטות הנוכחיות להערכת ציטוליזה על ידי תאי T כוללות בדיקת שחרור 51Cr, בדיקת שחרור לקטט דהידרוגנאז, בדיקת הדמיה ביולומינסנטית, ניתוח תאים מבוסס עכבה בזמן אמת ובדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת תאים 4,5. הפלטפורמה מבוססת הדימות הפלואורסצנטי המתוארת כאן מזהה את מספר התאים החיים לעומת המתים, שהוא כימות ישיר של ציטוליזה של תאי T בניגוד לשיטה עקיפה להערכת הציטוליזה על ידי תאי T.
להלן טכניקה קלה, חסכונית, מהירה ובעלת תפוקה גבוהה עם התערבות מינימלית להערכת ציטוטוקסיות של תאי Jurkat המבטאים קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR) CAR כנגד תאי סרטן שד טריפל נגטיב (TNBC) של MDA-MB-231 ותאי EGFR CRISPR מחסלים תאי MDA-MB-231. תאי Jurkat הם תאי לימפוציטים אנושיים מסוג Tאימורטליים 6 הנמצאים בשימוש נרחב לחקר הפעלת תאי T ומנגנוני איתות7. יתר על כן, תאי Jurkat שימשו לבדיקות CAR במבחנה במחקרים מרובים 8,9,10,11. תאי Jurkat מתמרים בקלות על ידי lentivirus ויש להם שגשוג מתמשך, ומערכת זו מונפה כדי לייעל את תחום הצירים של מבני EGFR CAR שונים.
בדיקה זו יכולה לשמש לבדיקת מבני CAR מרובים המכוונים לאנטיגנים סרטניים שונים ולהשתמש בהם כנגד קווי תאים סרטניים נצמדים מרובים וביחסי השפעה לגידול (E:T) שונים. בנוסף, ניתן להעריך נקודות זמן מרובות, ולשנות את מספר העותקים המשוכפלים כדי לזהות את ההרג הטוב ביותר בין מבני CAR השונים. המבנים הטובים ביותר צריכים להיות מאושרים באמצעות תאי דם מונוגרעיניים היקפיים (PBMCs) נגזר CD3 T תאים. המטרה הכוללת מאחורי פיתוח שיטה זו היא לייעל במהירות את הגיאומטריה של ציר CAR באופן בתפוקה גבוהה תוך התגברות על מחסומים כגון יעילות התמרה נמוכה, ולאחר מכן אישור בתאי T הנגזרים מ-PBMC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל עבודת תרבית התאים נעשית בארון בטיחות ביולוגית עם חלוק מעבדה, כפפות וטכניקות אספטיות סטנדרטיות.
1. יצירת מכוניות המבטאות יורקטים (CAR-J)
- לרכוש תאי Jurkat, לשכפל E6-1 מ ATCC. הפשירו 1 x 106 תאים בבקבוק T-75 ותרבו אותם בצלוחיות T-75. שמור אותם בהשעיה ב 0.6 x 106 תאים למ"ל באמצעות Roswell Park Memorial Institute (RPMI) מדיה בתוספת 10% FBS באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2.
- צלחת 1 x 105 תאי Jurkat לכל באר של תרבית רקמה מטופלת 24 צלחת באר ב 500 μL של RPMI מצע גידול המכיל 4 מיקרוגרם / מ"ל פוליברן אשר משפר את היעילות lentiviral. ספירת תאים באמצעות מנתח תאים עליון מבוסס לייזר מבוסס לייזר. מספר הבארות תלוי במספר המבנים שיש להעריך. דוגמה זו תשתמש ב- 4 מבנים ופקד לא מותמר. תכנון מבנה המכונית מוצג בטבלה 1.
- הוסף 10 μL של lentivirus/well של כל מבנה CAR. תכנון מבנה הרכב וייצור הלנטיוירוס נעשה כמתואר קודם לכן12.
- למחרת להוסיף 1 מ"ל של מדיה RPMI צמיחה לכל באר ולהמשיך לגדל באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2.
- לאסוף תאים 2 ימים מאוחר יותר (סה"כ 72 שעות לאחר התמרה Jurkat) ולספור אותם.
- קח 1 x 104 תאים לזרימה רצה כדי לאשר ביטוי CAR על תאי Jurkat. בקצרה, שטפו את התאים 2x עם תמיסת צביעה FACS (FSS) לפני תיוג CAR-J עם נוגדנים המכוונים תג דגל המשמש לזיהוי CAR חיובי במשך 30 דקות בחושך ב 4 ° C. שטפו שוב פעמיים עם FSS והריצו תאים דרך ציטומטר זרימה כפי שתואר קודם לכן12. יש להשתמש בריכוז נוגדנים לפי המלצת היצרן.
- תאי Jurkat מתמרים בקלות וכמעט תמיד מראים >90% ביטוי CAR. יש לייצר CAR-J זמן רב לפני בדיקת ציטוטוקסיות התרבות המשותפת ולהקפיא לשימוש מאוחר יותר.
2. ציפוי CFSE מסומן תאים סרטניים
הערה: תאי MDA-MB-231 (מ-ATCC, HTB-26) היו מתנה ממשתף פעולה, ו-EGFR KO MDA-MB-231 נוצרו כמתוארקודם 12.
- הפשירו 1 x 106 תאים בבקבוק T-75 ותרבו אותם בצלוחיות T-75. שמור על תאי גידול MDA-MB-231 ותאי גידול CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 ב- 14 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 ומפוצל כאשר כ 70% מתמזג.
- התבונן בתאי גידול דבקים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר רגיל כדי להבטיח כמעט 70% מפגש.
- מוציאים את מצע הגידול מהבקבוק בעזרת פיפטה סרולוגית. הוסף 3 מ"ל של טריפסין לבקבוק T75 ומניחים באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 למשך 3-5 דקות כדי לנתק את התאים מן הצלוחית.
- נטרל את הטריפסין באמצעות כמות שווה (3 מ"ל) של מצע גידול. אספו את תרחיף התא בצינור צנטריפוגה וסובבו את התאים במהירות של 400 x גרם למשך 4 דקות כדי לזרוק את התאים למטה.
- השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה והשהו מחדש את התאים ב-2 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS). קבע את ריכוז התא באמצעות מונה תאים.
- העבר 8 x 105 תאים לתוך צינור נוסף של 15 מ"ל והוסף PBS כדי להגיע לנפח של 1 מ"ל.
- הוסף 2 μL של carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE; ריכוז מלאי 5 μM) לתוך כל צינור ולערבב היטב באמצעות פיפטה 1 מ"ל.
- לדגור על התאים עם CFSE במשך 20 דקות באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2. הסר את הצינורות מן האינקובטור לאחר 20 דקות ולהוסיף 5 מ"ל של מדיה צמיחה לצינור.
- צנטריפוגה את הצינורות ב 400 x גרם במשך 4 דקות כדי לגלול למטה את התאים המסומנים CFSE. השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה והוסיפו 1 מ"ל של מדיה טרייה כדי להשהות מחדש את התאים.
- להעריך מחדש את ריכוז התא באמצעות מונה תאים. העבר 4 x 105 תאים למאגר מגיב 25 מ"ל והוסף מדיה לנפח כולל של 8 מ"ל.
- כדי להבטיח נפח מספיק כדי לזרוע 5000 תאים סרטניים / באר ב 100 μL של מדיה, נפח צריך להיות מסוגל פיפטה באמצעות פיפטה רב ערוצית, כדי לפצות על אובדן של כמה תאים במהלך שלב 1.7, להכין 10%-20% תאים נוספים נפח מדיה.
- מערבבים היטב את תרחיף התא באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל. באמצעות פיפטה רב ערוצית 100 μL, פיפטה 100 μL של תרחיף התא לתוך כל שורה של צלחת הבאר השחורה התחתונה השטוחה השקופה במחצית השמאלית. אסטרטגיית ציפוי לדוגמה ניתן למצוא בטבלה 2.
- פיפטה EGFR KO תאים באופן דומה על החצי הימני של הצלחת. לאחר שכל הצלחת מצופה, גרור את הצלחת קדימה ואחורה ומצד לצד על פלטפורמת מכסה המנוע של תרבית הרקמה כדי להבטיח פיזור אחיד של תאי הגידול בבארות.
- לדגור על הצלחת במשך 4 שעות באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור תאי הגידול להתחבר.
3. תרבית משותפת של מכוניות המבטאות יורקטים עם תאי גידול המסומנים ב-CFSE
- באמצעות ספירת תאי Jurkat שאינם מומרים ומבטאי CAR, מעבירים 4 x 105 תאים מכל CAR-J למאגר של 25 מ"ל. הוסף מדיית צמיחה DMEM לנפח כולל של 2 מ"ל.
- עבור E:T של 4:1, 2 x 104 CAR-J נוספו לכל באר ב 100 μL של מדיה באמצעות פיפטה רב ערוצית בעדינות לאורך הצד של כל באר כדי לא להפריע לתאי הגידול המחוברים.
- הוסף עוד 100 μL של מצע גידול באמצעות פיפטה רב ערוצית לצד בארות המכילות תאי גידול ותאי Jurkat. רק קבוצות הגידול מקבלות 200 מיקרוליטר של מדיה כדי להפוך אותו לסך של 300 מיקרוליטר מדיה בכל הבארות.
- גרור את הצלחת לאורך הפלטפורמה קדימה ואחורה ובתנועה מצד לצד כדי להבטיח פיזור אחיד של תאי Jurkat על תאי הגידול.
- אפשר תרבית משותפת בחממה ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 48 שעות.
4. הכנת צלחת להדמיה
- צור תמיסה של יודיד פרופידיום (PI) ב 1 מיקרוגרם / מ"ל במדיה פלואורסצנטית ברקע נמוך בהתבסס על מספר הבארות וכל אחת מקבלת 100 מיקרוליטר של מדיה.
- עבור 84 בארות להכין 9 מ"ל של מדיה המכילה PI. מערבבים היטב את המדיה באמצעות פיפטה.
- לייצר 10 מ"ל של 20% תמיסת Triton-X על ידי דילול Triton-X עם מים נטולי יונים. לאחר 48 שעות של תרבית משותפת, השליכו את הסופרנאטנט המכיל CAR-J על ידי היפוך יחיד של הצלחת והקשה על מגבת נייר.
- כעת הוסף 100 μL של מדיה מוכנה לעיל (שלב 4.2) המכיל PI לכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית בעדינות כדי לא להפריע לתאי הגידול המודבקים.
- הוסף 20 μL של 20% תמיסת Triton-X לבאר הראשונה מכל סוג גידול המתפקדת כבקרה מתה מוחלטת.
- משאירים את הצלחת באינקובטור למשך 20 דקות. צלם את הלוח באמצעות ציטומטר הדמיה פלואורסצנטי. הנתונים מאוחסנים במחשב וניתן לנתח אותם במועד מאוחר יותר.
5. ניתוח תמונות ניאון
- השתמש באחד הגידול רק טוב של תאים כדי להגדיר את התעלה הפלואורסצנטית הירוקה.
- להקטין את מסיכת הבאר ל 98% כדי להסיר את התאים על קצה הבאר כמו האות אינו מושלם על הקצה.
- זהה תאים סרטניים המסומנים ב-CFSE על תעלת CFSE הירוקה והפלואורסצנטית. שנה את ערך הסף של עוצמת הפלואורסצנטיות כדי לאסוף את כל התאים על הבאר.
- הגדר את קוטר התא המינימלי ל- 25 מיקרומטר כדי להסיר פסולת שזוהתה בתעלת CFSE. הדבר משתנה בהתאם לסוג התא המנותח.
- הפעל אובייקטים נוגעים נפרדים כדי לזהות תאים בודדים כאשר הם באים במגע זה עם זה.
- בחר CFSE בתצוגת התמונה והתבונן בשכבת-על גרפית כדי להבין מה נבחר על-ידי המערכת.
- לאחר שתאים המסומנים ב-CFSE נאספים כראוי, הגדר שערים להגדרת אוכלוסיית תאים חיים לעומת מתים.
- בחירת התאים המסומנים CFSE, ליצור היסטוגרמה של ספירות על ציר y לעומת עוצמת PI ממוצע על ציר x.
- בהתבסס על הבאר שבה הוספנו Triton-X (שלב 4.5), ציירו מפצל כדי להבדיל בין תאים מוכתמים PI נמוך לעומת תאים מוכתמים PI גבוה. באר זו צריכה להיות רוב התאים באזור מוכתם PI גבוה.
הערה: PI מציג אות בסיסי בתאים חיים. לפיכך, הוספת Triton-X הורגת את כל התאים והם מכתימים בבהירות בתעלה הפלואורסצנטית האדומה. זה מקל על ציור שערים להפרדת תאים מתים מתאים חיים. - התאם את ערך ציר ה- x כדי שתוכל להציג טוב יותר את התאים. כעת תייגו את התאים המוכתמים ב-PI הנמוך כתאים חיים.
- בחירת התאים החיים, הגדר היסטוגרמה נוספת עם שטח על ציר ה- x וספירה על ציר y.
- צייר מפצל נוסף באמצעות הגידול רק טוב כדי ללכוד תאים ולא פסולת. בארות מטופלות Jurkat יתחילו לצבור פסולת שתהיה מוכתמת CFSE ויש צורך להסיר אותה מהספירות. שאר הפסולת שאינה פסולת מסומנת כ"תאים גדולים".
- הפעל את הניתוח על הלוח כולו וייצא את הגיליון האלקטרוני המכיל את המספרים.
- תכננו את הספירה הגדולה כדי לזהות את מספר תאי הגידול החיים המסומנים ב-CFSE שנותרו בבאר לאחר החשיפה ל-CAR-J. קבע סטטיסטיקה באמצעות ANOVA חד-כיוונית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
טווח של יחס E:T בין 1:8 ל-8:1 עבור CAR-J1 הוערך ב-72 שעות, והתמקד ב-EGFR בתאי TNBC MDA-MB-231. תאי Jurkat הומרו עם CAR lentivirus עם פוליברן כדי ליצור תאי CAR-J כמתואר בשלב 2. ציטוטוקסיות של CAR-J1 עלתה באופן משמעותי עם יחס E:T גבוה יותר ללא הבדל בהרג ביחס של 1:8 (איור 1). יותר מ-50% מקרי הרג נצפו ביחס של 4:1 E:T במשך 72 שעות. E:T זה שימש לניסויים הבאים עם משך מופחת ל -48 שעות להערכה ציטוטוקסיות מהירה של מבני CAR מרובים. EGFR המכוון למבני מכוניות עם תחום הציר שונה תוכננו (טבלה 1). 4 הצירים השונים המשמשים הם IgG ארוך, IgG בינוני, IgG קצר CD8a כמתואר כאן13. 3 המבנים האלה בוטאו על תאי Jurkat וחיוביות CAR נקבעה על-ידי הערכת אחוז התאים המתויגים על-ידי ציטומטריית זרימה (איור 2A-D) כמתואר כאן12. תאי Jurkat לא מותמרים שימשו כקבוצת ביקורת כדי לקבוע את ביטוי CAR, ואסטרטגיית ה-gating מוצגת באיור 2E. ציטוטוקסיות של 4 מבני CAR אלה המבוטאים בתאי Jurkat הוערכה מול תאי EGFR המבטאים תאי MDA-MB-231 ותאי CRISPR EGFR KO MDA-MB-231. הרג ספציפי לאנטיגן נצפה על-ידי כל המבנים (איור 3A), בעוד שלא נצפה הרג משמעותי נגד תאי EGFR KO (איור 3B), מה שמרמז על כך שההרג תווך באופן ספציפי באמצעות scFv בלבד. לא היה הרג על ידי תאי יורקאט שלא עברו טרנספורמציה. תמונות מייצגות של הרג גידולים מוצגות גם כאשר החפיפה של תאי גידול המסומנים ב-CFSE עם גרעין מת מוכתם ב-PI גורמת להם להיראות צהובים (איור 4). הנתונים מייצגים 3 ניסויים עצמאיים עם 6 שכפולים טכניים לכל קבוצה.
זה אושר עוד יותר על ידי ביטוי מבני CAR אלה על תאי CD3 T הנגזרים מ- PBMC. יש ביטוי נמוך של CAR על תאי CD3 T אשר מועשרים לאחר מכן על ידי מיון זרימה סטרילית (איור 5). עם זאת, לא היה ביטוי של ציר CD8 המכיל EGFR CAR. לפיכך, 3 מבני CAR האחרים המכילים IgG ארוך, IgG בינוני ו- IgG קצר הוערכו עבור הפוטנציאל ציטוטוקסי שלהם כנגד תאי MDA-MB-231. קיימת מגמה דומה של הרג כאשר IgG קצר הוא בעל העוצמה ציטוטוקסית הנמוכה ביותר בהשוואה לשני המבנים האחרים (איור 6). כדי לזהות את המבנה הטוב ביותר בקרב תאי CAR-T ארוכים ובינוניים מסוג IgG, ההפעלה שלהם עם וללא חשיפה לתאי גידול TNBC הוערכה על ידי צביעה תוך-תאית של ציטוקינים כפי שתואר קודם לכן12. MDA-MB-436 הוא בעל רמות נמוכות של EGFR ו-MDA-MB-468 הוא בעל ביטוי חלבון EGFR הגבוה ביותר בהתבסס על כתם מערבי עם פאנל של 13 שורות תאי TNBC12. תאי CAR-T ארוכים מסוג IgG היו בעלי רמות ההפעלה הבסיסיות הנמוכות ביותר (TNFa, 4-1BB) ושחרור נמוך של גרגירים ציטוטוקסיים (פרפורין ואנזים B)14 ללא כל חשיפה לתאי הגידול (איור 7). לאחר חשיפה לתאי EGFR גבוהים המבטאים MDA-MB-468, תאי CAR-T ארוכים מסוג IgG היו בעלי ההפעלה הגבוהה ביותר בהתבסס על TNFa ו-4-1BB.
איור 1: הערכה ציטוטוקסית של EGFR CAR-J1 לאורך טווח של E:T. CFSE שכותרתו MDA-MB-231 תאי גידול צופו בתאי Jurkat לא מותמרים או EGFR המכוונים ל-CAR-J1 ביחס E:T של 1:8, 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 ו-8:1, מה שמראה עלייה בציטוטוקסיות עם תאי השפעה גבוהים יותר. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD והמובהקות הסטטיסטית הוערכה באמצעות מבחן t של התלמיד. 1:8 E:T לא היה משמעותי, 1:4 E:T היה ***p<0.001, והשאר ****p<0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ייצור EGFR CAR Jurkat להערכה ציטוטוקסית במבחנה . (א-ד) כמעט 90%-100% ביטוי CAR של 4 מבנים שונים CAR IgG ארוך, CAR IgG בינוני, CAR IgG קצר, CAR CD8a. (ה) אסטרטגיית Gating לקביעת חיוביות CAR: פסולת שאינה נכללת בתרשים SSC-A לעומת FSC-A; תאים בודדים שנבחרו בהתוויית FSC-H לעומת FSC-A; ותאים חיים שנבחרו על ידי צבע כדאיות DAPI גידור שלילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הערכת ציטוטוקסיות בתרבית משותפת של תאי גידול המסומנים CAR-J ו-CFSE. (A) CFSE שכותרתו MDA MB 231 תאים צופו ב-CAR-J ביחס E:T של 4:1 במשך 48 שעות, מה שמראה יעילות משתנה בהרג תאי גידול. (B) CFSE שכותרתו CRISPR EGFR KO MDA MB 231 תאים לא חוו הרג כלשהו על ידי אף אחד מתאי CAR-J. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD והמובהקות הסטטיסטית הוערכה באמצעות ANOVA חד-כיוונית. **עמ<0.01; עמ<0.0001; נ.ס: לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ייצוג חזותי של תמונות לאחר 48 שעות של תרבית משותפת. (A) קבוצת גידול בלבד עם CFSE (ירוק) המסומנים בתאי גידול. (B) תוספת של תאי Jurkat לא מותמרים כאשר תאים אדומים הם תאי Jurkat מתים ו-(C) כיסוי של ירוק ואדום המציין תאי גידול מתים (צהוב) כפי שמוצג על ידי חצים. מספר התאים הירוקים שאינם צהובים מכומתים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: העשרת תאי CAR-T מסוג EGFR CD3. (A-B) ביטוי CAR מוערך על ידי קביעת אחוז התאים החיוביים לדגל וחיובי IgG לפני ההעשרה ו-(C) לאחר העשרה על ידי מיון זרימה סטרילית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הערכת ציטוטוקסיות בתרבית משותפת של תאי גידול מסומנים CD3 CAR-T ו-CFSE. CFSE שכותרתו MDA MB 231 תאים צופו ב-CAR-J ביחס E:T של 4:1 במשך 48 שעות, מה שמראה יעילות משתנה בהרג תאי גידול. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD והמובהקות הסטטיסטית הוערכה באמצעות ANOVA חד-כיוונית. **עמ<0.01; עמ<0.0001; נ.ס: לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: הפעלת תאי CAR-T מסוג EGFR CD3. תאי CAR-T נחשפו לתאי הגידול והוערכו רמות ציטוקינים תוך-תאיים עבור (A) TNFa, (B) 4-1BB, (C) perforin ו-(D) granzyme B. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD והמובהקות הסטטיסטית הוערכה באמצעות ANOVA חד-כיווני *p<0.05; **עמ<0.01; **עמ<0.001; עמ<0.0001; נ.ס: לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| לא. של הרשות הפלסטינית EGFR806 scFv | Vh-Vl Linker | ציר/מרווח | TM | ציטופלזמי |
| רכב IgG ארוך | ויטלו (18 aa) | IgG4 EQ CH2 CH3 (229 aa) | CD4 | 4-1BB / CD3z |
| רכב IgG בינוני | ויטלו | IgG4 CH3 (129 aa) | CD28 | 4-1BB / CD3z |
| רכב IgG קצר | ויטלו | IgG קצר (12 aa) | CD4 | 4-1BB / CD3z |
| CD8a לרכב | ויטלו | CD8 (45 aa) | CD8a | 4-1BB / CD3z |
טבלה 1: עיצובי מבנה רכב. קיצורים: aa = חומצות אמינו; TM = Transmembrane.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | טריטון-X | מד"א מ"ב 231 בלבד | טריטון-X | מד"א MB 231 EGFR KO בלבד | ||||||||
| B | MB231 + דמה 4:1 | MB231 EGFR KO + דמה 4:1 | ||||||||||
| C | MB231 + EGFR IgG ארוך 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG ארוך 4:1 | ||||||||||
| D | MB231 + EGFR IgG בינוני 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG בינוני 4:1 | ||||||||||
| E | MB231 + EGFR IgG קצר 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG קצר 4:1 | ||||||||||
| F | MB231 + EGFR CD8a 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR CD8a 4:1 | ||||||||||
| G | ||||||||||||
| H | ||||||||||||
טבלה 2: אסטרטגיית ציפוי לדוגמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן הצענו שיטה מהירה להערכה יעילה של הפעילות הציטוליטית הספציפית למטרה הנגרמת על ידי ביטוי CAR בתאי Jurkat. לכל מבני CAR יש אותו scFv אך תחומי ציר וטרנסממברנה שונים אשר הוכחו כמשפיעים על עוצמת תאי CAR-T13. הערכה נוספת של הרג לא ספציפי על ידי CAR-J אלה נעשתה על ידי תרבית שלהם עם תאי אנטיגן נוק אאוט (KO). זה מוכיח כי ההרג הוא ספציפי אנטיגן הגידול ולא עקב הפעלה בסיסית על ידי CAR-J. ניתן לקבוע בקלות פוטנציאל ציטוטוקסי של טווח יחסי E:T תוך זיהוי המספר הקטן ביותר של תאי השפעה הדרושים לסילוק תאי הגידול בנקודות זמן ספציפיות. קווי תאים מרובים מסוג סרטן זהה או שונה ותאים נורמליים יכולים לשמש גם כדי להעריך את הספציפיות של מבנים אלה. לאחר מכן ניתן לאפיין עוד יותר את המועמדים החזקים ביותר שזוהו על ידי פלטפורמת CAR-J על ידי ביטוי CAR על תאי CD3 T הנגזרים מ-PBMC וביצוע מבחני הרג דומים והערכת תשישות והפעלה בעת חשיפה לתאי גידול חיוביים ושליליים של אנטיגן.
יש לציין כי תאי Jurkat הם תאי CD4+ עם קולטן תא T שונה (TCR) מסלול איתות15. לפיכך, אופטימיזציה של תחום איתות תוך תאי של מבני CAR צריכה להיעשות באופן אידיאלי עם תאי CD3 T16 ועשויה שלא לעבוד בצורה הטובה ביותר עם תאי Jurkat. באופן מעניין, תאי CD4 T מציגים ציטוטוקסיות כפי שהודגם בפרסום קודם שבו EGFR המכוון לתאי CD4 CAR-T עם ציר ארוך IgG מסוגלים לחסל לחלוטין גידולי TNBC במודל גידול תוך גולגולתי12. בנוסף, תאי CD4 CAR T מראים עוצמה לטווח ארוך והרג טוב יותר בהשוואה לתערובת של תאי CD4 ו- CD8 T או תאי CD8 T לבדם במודל גידול GBM, מה שהופך אותם לתאי T חשובים מבחינה קלינית לטיפול יעיל ב- CAR-T17.
תאי Jurkat מייצרים IL2 ומווסתים CD69 עם ההפעלה, אם כי הם אינם מפרישים את כל הציטוקינים של הפעלת תאי T ראשונית 8,18. עם זאת, הערכת רמות IL2 ו- CD69 מודיעה לגבי הפעלת תאי Jurkat ולא לגבי הציטוליזה הישירה של תאי המטרה אשר מכומתים במספרים מוחלטים של תאי גידול על ידי גישה זו. עם זאת, הערכה של ציטוטוקסיות והפעלה חשובה כדי להבין באופן מלא את ההשפעות של מולקולות CAR חדשות.
משך התרבות המשותפת בניסוי זה יכול להשתנות בהתבסס על המבנים שבהם נעשה שימוש. תיוג CFSE על תאי הגידול נמצא ניתן לגילוי עד 4 ימים לאחר הציפוי. לפיכך, כדי להשיג יחס אות לרעש גבוה, בוצעו ניסויים תוך 72 שעות. מכיוון שעוצמת CFSE פוחתת עם חלוקת תאי הגידול, כמות CFSE בשימוש ומשך הזמן עשויים להשתנות בהתאם לתאי הגידול המשמשים. מכיוון שמדובר בניסוי בתפוקה גבוהה לניתוח מבנים מרובים בו זמנית, צפיפות הזריעה של תאי המטרה בצלחת באר 96 צריכה גם היא להיות אופטימלית. תאי המטרה חייבים להישמר כך שלא יגדלו יתר על המידה או שתהיה להם הגבלת גדילה תחרותית עד סוף הבדיקה ללא צורך להחליף מדיה כדי למזער כל התערבות. ניתן להשתמש בלוחות באר גדולים יותר כדי להכיל יותר תאים ולהאריך את תוחלת החיים של הניסוי. עם זאת, התמונות צריכות להיות תפורות כדי לקבל תמונה מלאה של הבאר ויש לעבוד על כל באר בנפרד, מה שאולי לא יהפוך אותה למהירה ובעלת תפוקה גבוהה.
גישה נוספת של תיוג פלואורסצנטי ארוך טווח של תאי גידול היא על ידי התמרה לנטיויראלית עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP). יש לבצע בחירה נכונה של השבטים כדי לבחור מושבות מועשרות מאוד (כמעט 100%) בהירות ביותר לקבלת יחס האות לרעש הטוב ביותר. יש לבחור כראוי את צבע הכדאיות בהתבסס על הגלאים הפלואורסצנטיים במכשיר ההדמיה.
פלואורסצנטיות הרקע תלויה במדיה בה נעשה שימוש ולכן יש לבדוק אותה כדי למנוע אובדן אות בעת רכישת תמונות. מדיה רגילה מכילה רכיבים הפולטים פלואורסצנטיות משמעותית בעת התרגשות. מומלץ להשתמש במדיית רקע נמוכה19. ניתן להשתמש ב-PBS, אך הדבר עלול להשפיע על התאים במהלך קבלת תמונה, מכיוון שקבלת תמונות נמשכת כ-20 דקות, בהתאם להגדרות שנקבעו ללכידת תמונות.
אחת המגבלות של בדיקה זו היא לא להיות מסוגל לצלם תמונות במספר נקודות זמן של אותה צלחת באר 96 לאחר הוספת צבע כדאיות. ההשפעה של הוספת PI לאורך זמן רב לא הוערכה עבור פרסום זה. עם זאת, זה יהיה אידיאלי להיות מסוגל לזהות תאי מטרה חיים ומתים / גוססים על פני תקופה באמצעות אותה לוחית. ייתכן שיהיה קשה להפריד תאים בודדים אם התאים הופכים ליותר מדי נפגשים. ניתן להשתמש באזור חד-שכבתי התא ובעוצמת הפלואורסצנטיות כדי להשוות את אחוז התאים החיים/מתים כמתואר20.
שיטות חלופיות המשמשות לזיהוי ציטוליזה על ידי תאי CAR-T אינן מודדות ישירות את המספר המוחלט של תאים מתים וחיים, אלא מעריכות עוצמה בשיטות עקיפות המתוארות בפירוט במקומות אחרים 4,5. לכן, שיטה זו נותנת תיאור מוחלט של תאי השפעה וניתן להשתמש בה בתרבית משותפת של 3 סוגי תאים, כמו גם בהתאם לקיבולת של מכשיר ההדמיה. יש מעט מאוד תאים נדרשים (5000 לכל באר) אשר עשויים להשתנות יחד עם החופש לבחור נקודת זמן שהם יתרונות עצומים של שימוש בבדיקה זו. תאי מטרה בתרחיף ובתרבית ספרואידים תלת-ממדית יכולים לשמש גם בתרבית עם תאי אפקט וציטוליזה שנקבעו כמתואר במקום אחר21. יתר על כן, פלטפורמה זו יכולה לשמש לסינון ספריות גדולות של מולקולות קטנות ותרכובות כדי לסמן את המולקולות היעילות ביותר וניתן לבצע מינונים מרובים במספר נקודות זמן.
מלבד המהירות והגמישות של המערכת, היתרון הסופי הוא זה של העלות. מכונת ההדמיה הפלואורסצנטית, הצלחות והריאגנטים נפוצים כולם ומשתלמים לרכישה, במיוחד בהשוואה למכשירים מתוחכמים יותר שעשויים אפילו להשתמש במתכות יקרות בלוחות החד-פעמיים שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מד"א-MB-231 היו מתנה חביבה מד"ר שיין סטקליין. המחברים מודים על מימון ממרכז הסרטן של אוניברסיטת קנזס לביצוע מחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Methods in Cell Biology. 167, Academic Press. 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D. Jr, Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis. , https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023).
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
