Summary
Протокол оценки количественного уничтожения опухолевых клеток клетками Юрката, экспрессирующими химерный антигенный рецептор (CAR), нацеленный на одиночный опухолевый антиген. Этот протокол может быть использован в качестве скрининговой платформы для быстрой оптимизации шарнирных конструкций CAR перед подтверждением в Т-клетках периферической крови.
Abstract
Т-клетки химерного антигенного рецептора (CAR) находятся на переднем крае онкологии. CAR состоит из целевого домена (обычно фрагмента переменной цепи, scFv) с сопутствующим внутрицепочечным линкером, за которым следуют шарнирный, трансмембранный и костимулирующий домены. Модификация внутрицепочечного линкера и шарнирного домена может оказать существенное влияние на CAR-опосредованное убийство. Принимая во внимание множество различных вариантов для каждой части конструкции CAR, существует большое количество перестановок. Изготовление CAR-T-клеток является трудоемким и дорогостоящим процессом, а изготовление и тестирование многих конструкций требует больших временных и материальных затрат. Этот протокол описывает платформу для быстрой оценки шарнирно-оптимизированных конструкций CAR в ячейках Jurkat (CAR-J). Клетки Jurkat представляют собой иммортализированную линию Т-клеток с высоким поглощением лентивируса, что обеспечивает эффективную трансдукцию CAR. Здесь мы представляем платформу для быстрой оценки CAR-J с помощью флуоресцентного тепловизора с последующим подтверждением цитолиза в Т-клетках, полученных из PBMC.
Introduction
По даннымНационального института рака, с 2017 года CAR-T-клеточная терапия показала большие перспективы при гематологических злокачественных новообразованиях, о чем свидетельствуют 6 одобренных FDA продуктов CAR-T. Существует множество CAR-T-клеток, проводимых в клинических испытаниях для воздействия на солидные опухоли. Разработка новых мишеней для CAR и оптимизация конструкции CAR имеют жизненно важное значение для эффективности CAR-T-клеток. Выбор идеальной конструкции CAR для каждого применения имеет важное значение для точного нацеливания на опухоль-ассоциированные антигены (ТАА) при одновременном избежании низких уровней экспрессии ТАА в нормальных тканях2.
Конструкция CAR в основном состоит из пяти компартментов: (1) внеклеточный одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), нацеленный на опухолевой антиген; (2) шарнирный домен; (3) трансмембранный домен; (4) внутриклеточный цитоплазматический Т-клеточный костимулирующий домен; и (5) сигнальная область. Модификация каждого из этих доменов влияет на точность взаимодействия CAR-T-клетки со своей клеткой-мишенью3. Следовательно, оценка цитотоксичности и перекрестной реактивности этих CAR-конструкций in vitro имеет решающее значение для выбора правильной конструкции для перехода к экспериментам in vivo. Современные методы оценки цитолиза Т-клетками включают анализ высвобождения 51Cr, анализ высвобождения лактатдегидрогеназы, анализ биолюминесцентной визуализации, анализ клеток на основе импеданса в реальном времени и анализ проточной цитометрии на основе клеток 4,5. Описанная здесь платформа, основанная на флуоресцентной визуализации, идентифицирует количество живых и мертвых клеток, что является прямой количественной оценкой цитолиза Т-клеток, в отличие от косвенного метода оценки цитолиза Т-клетками.
Вот простой, экономичный, быстрый и высокопроизводительный метод с минимальным вмешательством для оценки цитотоксичности клеток Jurkat, экспрессирующих рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) CAR, против клеток трижды негативного рака молочной железы (ТНРМЖ) MDA-MB-231, а EGFR CRISPR нокаутирует клетки MDA-MB-231. Клетки Jurkat представляют собой иммортализированные Т-лимфоцитарные клеткичеловека 6, которые широко используются для изучения активации Т-клеток и сигнальных механизмов7. Кроме того, клетки Jurkat использовались для тестирования in vitro CAR в нескольких исследованиях 8,9,10,11. Клетки Jurkat легко трансдуцируются лентивирусом и имеют устойчивую пролиферацию, и эта система была использована для оптимизации шарнирного домена различных конструкций EGFR CAR.
Этот анализ может быть использован для скрининга нескольких конструкций CAR, нацеленных на различные опухолевые антигены, и использоваться против нескольких адгезивных линий опухолевых клеток и в различных соотношениях эффекторов и опухолей (E:T). Кроме того, можно оценить несколько временных точек и изменить количество репликаций, чтобы определить лучшее убийство среди различных конструкций CAR. Наилучшие конструкции должны быть подтверждены с использованием CD3 Т-клеток, полученных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). Общая цель разработки этого метода заключается в быстрой оптимизации геометрии шарнира CAR с высокой пропускной способностью, преодолевая такие барьеры, как низкая эффективность трансдукции, с последующим подтверждением на Т-клетках, полученных из PBMC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы с клеточными культурами выполняются в шкафу биобезопасности с лабораторным халатом, перчатками и в соответствии со стандартными асептическими методами.
1. Генерация CAR, выражающая юркаты (CAR-J)
- Приобретите ячейки Jurkat, клон E6-1 от ATCC. Разморозить 1 х 106 клеток в колбе Т-75 и культивировать их в колбах Т-75. Хранят их в суспензии при концентрации 0,6 x 10,6 клеток на мл, используя среду Roswell Park Memorial Institute (RPMI) с добавлением 10% FBS в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2.
- Планшет 1 x 105 клеток Jurkat на лунку обработанной тканевой культуры 24-луночный планшет в 500 мкл питательной среды RPMI, содержащей 4 мкг/мл полибрена, который повышает лентивирусную эффективность. Подсчитайте количество клеток с помощью лазерного флуоресцентного анализатора клеток. Количество скважин зависит от количества конструкций, подлежащих оценке. В этом примере будут использоваться 4 конструкции и нетрансдуцируемый элемент управления. Конструкция конструкции ЦАР приведена в таблице 1.
- Добавьте 10 мкл лентивируса на лунку каждого CAR-конструкта. Проектирование конструкции CAR и получение лентивируса выполнялось, как описано выше12.
- На следующий день добавьте в каждую лунку по 1 мл питательной среды RPMI и продолжайте культивирование в инкубаторе при температуре 37 °C с 5% CO2.
- Собирают клетки через 2 дня (всего через 72 ч после трансдукции Юрката) и подсчитывают их.
- Возьмем 1 х 104 ячейки для бегущего потока, чтобы подтвердить экспрессию CAR на клетках Jurkat. Короче говоря, промойте клетки 2 раза раствором для окрашивания FACS (FSS) перед маркировкой CAR-J антителами, нацеленными на метку Flag, используемой для определения положительного результата CAR, в течение 30 минут в темноте при температуре 4 °C. Еще раз промывают 2 раза с помощью FSS и пропускают клетки через проточный цитометр, как описано ранее12. Используйте концентрацию антител в соответствии с рекомендациями производителя.
- Клетки Jurkat легко трансдуцируются и почти всегда показывают экспрессию >90% CAR. Производят CAR-J задолго до проведения анализа на цитотоксичность в совместном культивировании и замораживают для последующего использования.
2. Покрытие опухолевых клеток, меченных CFSE
ПРИМЕЧАНИЕ: ЯЧЕЙКИ MDA-MB-231 (от ATCC, HTB-26) были подарком от коллаборанта, а EGFR KO MDA-MB-231 были созданы, как описано ранее12.
- Разморозить 1 х 106 клеток в колбе Т-75 и культивировать их в колбах Т-75. Поддерживайте опухолевые клетки MDA-MB-231 и опухолевые клетки CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 в 14 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) Dulbecco, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2 и расщепляйте при слиянии примерно 70%.
- Наблюдайте за адгезивными опухолевыми клетками под обычным светлопольным микроскопом, чтобы обеспечить почти 70% слияние.
- Удалить питательную среду из колбы с помощью серологической пипетки. Добавьте 3 мл трипсина в колбу T75 и поместите в инкубатор при температуре 37 °C с 5% CO2 на 3-5 мин, чтобы отделить клетки от колбы.
- Нейтрализуют трипсин, используя равное количество (3 мл) питательной среды. Соберите клеточную суспензию в центрифужную пробирку и открутите клетки со скоростью 400 x g в течение 4 минут, чтобы гранулировать клетки.
- Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторно суспендируйте клетки в 2 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Определите концентрацию клеток с помощью счетчика клеток.
- Переложите ячейки 8 x 105 в другую пробирку объемом 15 мл и добавьте PBS, чтобы получить объем 1 мл.
- Добавьте 2 мкл карбоксифлуоресцеина сукцинимидилового эфира (CFSE; концентрация 5 мкМ) в каждую пробирку и хорошо перемешайте с помощью пипетки объемом 1 мл.
- Инкубируют клетки с CFSE в течение 20 мин в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2. Через 20 мин вынуть пробирки из инкубатора и добавить в пробирку 5 мл питательной среды.
- Центрифугируйте пробирки при 400 x g в течение 4 минут, чтобы гранулировать меченые ячейки CFSE. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки и добавьте 1 мл свежей среды для ресуспендирования клеток.
- Переоцените концентрацию клеток с помощью счетчика клеток. Переложите ячейки 4 x 105 в резервуар для реагента объемом 25 мл и добавьте среду до общего объема 8 мл.
- Чтобы обеспечить достаточный объем для посева 5000 опухолевых клеток/лунку в 100 мкл среды, объем необходимо было пипетировать с помощью многоканальной пипетки, а для компенсации потери нескольких клеток на этапе 1.7 подготовить 10%-20% дополнительных клеток и объема среды.
- Тщательно перемешайте клеточную суспензию с помощью серологической пипетки объемом 5 мл. Используя многоканальную пипетку на 100 мкл, пипетку по 100 мкл клеточной суспензии в каждый ряд прозрачной черной 96-луночной пластины с плоским дном в левой половине. Пример стратегии нанесения покрытия можно найти в таблице 2.
- Пипетку EGFR KO ячейки аналогично наносят на правую половину пластины. После того, как вся пластина будет покрыта, перетащите пластину вперед и назад и из стороны в сторону на платформе для культивирования тканей, чтобы обеспечить равномерное распределение опухолевых клеток в лунках.
- Инкубируйте планшет в течение 4 ч в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2 для прикрепления опухолевых клеток.
3. Совместное культивирование CAR, экспрессирующих Jurkats, с опухолевыми клетками, меченными CFSE
- Используя подсчет нетрансдуцированных и экспрессирующих CAR клеток Jurkat, перенесите 4 x 105 клеток каждого CAR-J в резервуар объемом 25 мл. Добавьте питательную среду DMEM для общего объема 2 мл.
- Для E:T 4:1 добавляли 2 x 104 CAR-J на лунку в 100 мкл среды с помощью многоканальной пипетки осторожно вдоль борта каждой лунки, чтобы не повредить прикрепленные опухолевые клетки.
- Добавьте еще 100 мкл питательной среды с помощью многоканальной пипетки к стенкам лунок, содержащих опухолевые клетки и клетки Юрката. Группы, больные только опухолями, получают 200 мкл среды, что в общей сложности составляет 300 мкл среды во всех лунках.
- Перетащите пластину по платформе вперед-назад и из стороны в сторону, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток Юрката на опухолевых клетках.
- Выдерживают посев в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%СО2 в течение 48 ч.
4. Подготовка пластины к визуализации
- Раствор йодида пропидия (PI) в концентрации 1 мкг/мл в низкофоновых флуоресцентных средах в расчете на количество лунок и получение 100 мкл среды в каждой.
- Для 84 лунок готовят 9 мл среды, содержащей ПИ. Тщательно перемешайте среду с помощью пипетки.
- Приготовьте 10 мл 20% раствора Тритона-Х, разбавив Тритон-Х деионизированной водой. После 48 ч совместной культуры выбросьте надосадочную жидкость, содержащую CAR-J, однократным переворачиванием пластины и постукиванием по бумажному полотенце.
- Теперь добавьте в каждую лунку 100 мкл подготовленной выше подготовленной среды (шаг 4.2), содержащей ПИ, с помощью многоканальной пипетки осторожно, чтобы не потревожить прилипшие опухолевые клетки.
- Добавьте 20 мкл 20% раствора Тритона-Х в первую лунку каждого типа опухоли, которая функционирует как полный мертвый контроль.
- Оставьте тарелку в инкубаторе на 20 минут. Визуализируйте планшет с помощью флуоресцентного цитометра. Данные хранятся на компьютере и могут быть проанализированы позже.
5. Анализ флуоресцентных изображений
- Используйте одну из опухолевых лунок клеток, чтобы установить зеленый флуоресцентный канал.
- Уменьшите маску лунки до 98%, чтобы удалить ячейки на краю лунки, так как сигнал на краю не идеален.
- Идентификация меченых опухолевых клеток CFSE на зеленом флуоресцентном канале CFSE. Измените пороговое значение интенсивности флуоресценции, чтобы захватить все ячейки на лунке.
- Установите минимальный диаметр ячейки на 25 мкм, чтобы удалить любой мусор, обнаруженный на канале CFSE. Это зависит от типа анализируемой клетки.
- Включите параметр «Разделять соприкасающиеся объекты », чтобы идентифицировать отдельные ячейки, когда они соприкасаются друг с другом.
- Выберите CFSE на дисплее изображения и посмотрите на графическое наложение, чтобы понять, что выбирается системой.
- После того, как клетки, помеченные CFSE, будут должным образом отобраны, установите ворота для определения популяции живых и мертвых клеток.
- Выбрав ячейки, помеченные CFSE, постройте гистограмму отсчетов по оси Y от средней интенсивности ПИ по оси X.
- На основе лунки, в которую мы добавили Triton-X (шаг 4.5), нарисуйте разветвитель для дифференциации клеток с низким и высоким PI-окрашиванием. В этой лунке должна быть большая часть клеток в области с высоким ПИ-окрашиванием.
ПРИМЕЧАНИЕ: PI показывает базальный сигнал на живых клетках. Следовательно, добавление Triton-X убивает все клетки, и они ярко окрашиваются в красный флуоресцентный канал. Это облегчает вытягивание ворот для отделения мертвых клеток от живых. - Отрегулируйте значение оси X, чтобы лучше просматривать ячейки. Теперь обозначьте клетки с низким PI-окрашиванием как живые клетки.
- Выделив живые ячейки, задайте еще одну гистограмму с площадью по оси x и отсчетом по оси y.
- Нарисуйте еще один разветвитель, используя только опухоль, чтобы захватить клетки, а не мусор. В скважинах, обработанных Юркатом, начнет скапливаться мусор, который будет окрашен CFSE и должен быть удален из учета. Остальные, не являющиеся мусором, помечены как «Большие ячейки».
- Запустите анализ на всей пластине и экспортируйте электронную таблицу, содержащую числа.
- Постройте график больших подсчетов, чтобы определить количество живых опухолевых клеток, меченных CFSE, оставшихся в лунке после воздействия CAR-J. Определяйте статистику с помощью одностороннего ANOVA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Диапазон соотношения E:T от 1:8 до 8:1 для CAR-J1 был оценен через 72 ч, который был нацелен на EGFR на клетках TNBC MDA-MB-231. Клетки Jurkat трансдуцировали лентивирусом CAR с полибреном для получения клеток CAR-J, как описано на шаге 2. Цитотоксичность CAR-J1 достоверно увеличивалась при более высоком соотношении E:T без различия в убойности в соотношении 1:8 (рис. 1). Более 50% смертей наблюдалось при 4:1 E:T в течение 72 ч. Этот E:T был использован для последующих экспериментов с продолжительностью, сокращенной до 48 ч, для быстрой оценки цитотоксичности нескольких конструкций CAR. Разработаны конструкции EGFR, нацеленные на CAR с модифицированным шарнирным доменом (табл. 1). Используются 4 различных шарнира: IgG длинный, IgG средний, IgG короткий и CD8a, как описано здесь13. Эти 3 конструкции экспрессировались на клетках Юрката и CAR-позитивности, определяемой путем оценки процента клеток, меченных флагом, методом проточной цитометрии (рис. 2A-D), как описано здесь12. В качестве контрольной группы для определения экспрессии CAR использовали нетрансдуцированные клетки Jurkat, а стратегия стробирования показана на рисунке 2E. Цитотоксичность этих 4 CAR-конструкций, экспрессируемых на клетках Jurkat, оценивали в сравнении с клетками, экспрессирующими MDA-MB-231 и клетками CRISPR EGFR KO MDA-MB-231. Антиген-специфическое убийство наблюдалось во всех конструктах (рис. 3A), в то время как в отношении EGFR KO клеток не наблюдалось значительного уничтожения (рис. 3B), что позволяет предположить, что убийство было специфически опосредовано только через scFv. Не было никакого убийства нетрансдуцированными клетками Юрката. Также показаны репрезентативные изображения гибели опухоли, где наложение меченых CFSE опухолевых клеток с окрашенным PI-окрашенным мертвым ядром делает их желтыми (рис. 4). Данные репрезентативны для 3 независимых экспериментов с 6 техническими повторами в каждой группе.
Это было дополнительно подтверждено экспрессией этих CAR-конструкций на CD3-Т-клетках, полученных из PBMC. Наблюдается низкая экспрессия CAR на CD3 Т-клетках, которые затем обогащаются стерильной проточной сортировкой (рис. 5). Однако экспрессии CD8 шарнира, содержащего EGFR CAR, не наблюдалось. Таким образом, другие 3 конструкции CAR, содержащие IgG длинный, средний IgG и короткий IgG, были оценены на предмет их цитотоксического потенциала в отношении клеток MDA-MB-231. Аналогичная тенденция наблюдается и при коротком IgG, обладающем наименьшей цитотоксической активностью по сравнению с двумя другими конструктами (рис. 6). Для выявления наилучшей конструкции среди длинных IgG и средних IgG-CAR-T-клеток оценивали их активацию при воздействии и без воздействия опухолевых клеток ТНРМЖ путем внутриклеточного окрашивания цитокинов, как описано ранее12. MDA-MB-436 имеет низкие уровни EGFR, а MDA-MB-468 имеет самую высокую экспрессию белка EGFR на основе вестерн-блоттинга с панелью из 13 клеточных линий TNBC12. Длинные CAR-T-клетки IgG имели наименьшие уровни базальной активации (TNFa, 4-1BB) и низкое высвобождение цитотоксических гранул (перфорин и гранзим В)14 без какого-либо воздействия на опухолевые клетки (рис. 7). При воздействии клеток MDA-MB-468 с высоким уровнем экспрессии EGFR длинные CAR-T-клетки IgG имели самую высокую активацию на основе TNFa и 4-1BB.
Рисунок 1: Цитотоксическая оценка EGFR CAR-J1 в диапазоне E:T. Опухолевые клетки, меченные CFSE, MDA-MB-231 были покрыты нетрансдуцированными клетками Jurkat или EGFR, нацеленными на CAR-J1 в соотношении E:T 1:8, 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 и 8:1, демонстрируя возрастающую цитотоксичность с более высокими эффекторными клетками. Данные представлены в виде среднего ± SD, а статистическая значимость оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента. 1:8 E:T было незначимым, 1:4 E:T имело ***p<0,001, а остальное ****p<0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Производство EGFR CAR Jurkat для цитотоксической оценки in vitro . (А-Д) Почти 90%-100% экспрессия CAR 4 различных конструкций: CAR IgG длинный, CAR IgG средний, CAR IgG короткий, CAR CD8a. (E) Стратегия стробирования для определения положительности CAR: Мусор исключен на графике SSC-A и FSC-A; Одиночные ячейки, выбранные на графике FSC-H и FSC-A; и живые клетки, отобранные красителем жизнеспособности DAPI отрицательным стробированием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Оценка цитотоксичности в совместном культивировании опухолевых клеток, меченных CAR-J и CFSE. (A) Клетки MDA MB 231, меченные CFSE, были покрыты CAR-J в соотношении E:T 4:1 в течение 48 ч, что показало различную эффективность в уничтожении опухолевых клеток. (B) Клетки, меченные CRISPR EGFR KO MDA MB 231, не подвергались какому-либо уничтожению ни одной из клеток CAR-J. Данные представлены в виде среднего ± SD, а статистическая значимость оценивалась с помощью одностороннего метода ANOVA. **с<0,01; стр<0,0001; Н.С.: Незначительно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Визуальное представление изображений после 48 ч совместного культивирования. (A) Группа только опухолей с опухолевыми клетками, помеченными CFSE (зеленым цветом). (B) Добавление нетрансдуцированных клеток Jurkat с эритроцитами, являющимися мертвыми клетками Jurkat, и (C) наложение зеленого и красного цветов, указывающих на мертвые опухолевые клетки (желтым), как показано стрелками. Количество зеленых клеток, которые не являются желтыми, подсчитывается количественно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Обогащение EGFR CD3 CAR-T-клетками. (A-B) Экспрессия CAR оценивается путем определения процента Flag-положительных и IgG-положительных клеток до обогащения и (C) после обогащения путем стерильной потоковой сортировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Оценка цитотоксичности при совместном культивировании CD3 CAR-T и CFSE меченных опухолевых клеток. Клетки MDA MB 231, меченные CFSE, покрывали CAR-J в соотношении E:T 4:1 в течение 48 ч, демонстрируя различную эффективность в уничтожении опухолевых клеток. Данные представлены в виде среднего ± SD, а статистическая значимость оценивалась с помощью одностороннего метода ANOVA. **с<0,01; стр<0,0001; Н.С.: Незначительно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Активация CAR-T-клеток CD3 EGFR. CAR-T-клетки подвергались воздействию опухолевых клеток и оценивали внутриклеточные уровни цитокинов для (A) TNFa, (B) 4-1BB, (C) перфорина и (D) гранзима B. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартного отклонения, а статистическая значимость оценивалась с помощью одностороннего ANOVA *p<0,05; **с<0,01; **с<0,001; стр<0,0001; Н.С.: Незначительно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Нет. ПА EGFR806 scFv | Линкер Vh-Vl | Шарнир/Распорка | ТМ | Цитоплазматический |
| CAR IgG Long | Уитлоу (18 аа) | IgG4 эквалайзер CH2 CH3 (229 аа) | КД4 | 4-1ББ / CD3z |
| CAR IgG средний | Панариций | IgG4 CH3 (129 аа) | КД28 | 4-1ББ / CD3z |
| CAR IgG Короткий | Панариций | IgG короткий (12 аа) | КД4 | 4-1ББ / CD3z |
| АВТОМОБИЛЬ CD8a | Панариций | CD8 (45 аа) | КД8а | 4-1ББ / CD3z |
Таблица 1: Конструкции CAR. Сокращения: aa = аминокислоты; ТМ = Трансмембранный.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | Тритон-Х | Только MDA MB 231 | Тритон-Х | MDA MB 231 EGFR KO Только | ||||||||
| B | MB231 + Mock 4:1 | MB231 EGFR НОКАУТ + Mock 4:1 | ||||||||||
| C | MB231 + EGFR IgG Long 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Long 4:1 | ||||||||||
| D | MB231 + EGFR IgG средний 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG средний 4:1 | ||||||||||
| E | MB231 + EGFR IgG короткий 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG короткий 4:1 | ||||||||||
| F | MB231 + EGFR CD8a 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR CD8a 4:1 | ||||||||||
| G | ||||||||||||
| H | ||||||||||||
Таблица 2: Пример стратегии нанесения покрытия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предложен экспресс-метод оценки таргет-специфической цитолитической активности, индуцированной экспрессией CAR в клетках Jurkat. Все конструкции CAR имеют один и тот же scFv, но разные шарнирные и трансмембранные домены, которые, как было показано, влияют на активность CAR-T-клеток13. Дальнейшая оценка неспецифического киллинга этими CAR-J проводилась путем культивирования их с клетками нокаута антигена (KO). Это свидетельствует о том, что убийство является специфичным для опухолевого антигена, а не обусловлено базальной активацией CAR-J. Цитотоксический потенциал диапазона соотношений Е:Т может быть легко определен путем определения наименьшего количества эффекторных клеток, необходимого для элиминации опухолевых клеток в определенные моменты времени. Несколько клеточных линий одного или разных типов рака и нормальных клеток также могут быть использованы для оценки специфичности этих конструкций. Наиболее мощные кандидаты, идентифицированные с помощью платформы CAR-J, могут быть дополнительно охарактеризованы экспрессией CAR на CD3-Т-клетках, полученных из PBMC, и выполнением аналогичных анализов убийства, а также оценкой истощения и активации при воздействии антигенпозитивных и негативных опухолевых клеток.
Следует отметить, что клетки Jurkat являются CD4+ клетками с измененным сигнальным путем15 Т-клеточного рецептора (TCR). Следовательно, внутриклеточная оптимизация сигнального домена конструкций CAR в идеале должна выполняться с CD3 Т-клетками16 и может не работать лучше всего с клетками Jurkat. Интересно, что CD4 Т-клетки демонстрируют цитотоксичность, как было продемонстрировано в предыдущей публикации, где EGFR, нацеленные на CD4 CAR-T-клетки с длинным шарниром IgG, способны полностью эрадикировать опухоли ТНРМЖ в моделивнутричерепной опухоли 12. Кроме того, CD4 CAR-Т-клетки демонстрируют долгосрочную активность и лучшее уничтожение по сравнению со смесью CD4 и CD8 Т-клеток или только CD8 Т-клеток в модели опухоли GBM, что делает их клинически важной субпопуляцией Т-клеток для эффективной терапии CAR-T.17.
Клетки Jurkat продуцируют IL2 и повышают регуляцию CD69 при активации, хотя они не секретируют все цитокины первичной активации Т-клеток 8,18. Однако оценка уровней IL2 и CD69 дает информацию об активации клеток Юрката, а не о прямом цитолизе клеток-мишеней, которые количественно оцениваются в абсолютном количестве опухолевых клеток с помощью этого подхода. Тем не менее, оценка цитотоксичности и активации важна для полного понимания эффектов новых молекул CAR.
Продолжительность совместной культуры в этом эксперименте может быть изменена в зависимости от используемых конструктов. Было обнаружено, что мечение CFSE на опухолевых клетках обнаруживается в течение 4 дней после нанесения покрытия. Таким образом, для достижения высокого соотношения сигнал/шум эксперименты проводились в течение 72 часов. Поскольку интенсивность CFSE уменьшается при делении опухолевых клеток, количество используемых CFSE и продолжительность могут быть изменены в зависимости от используемых опухолевых клеток. Поскольку это высокопроизводительный эксперимент по одновременному анализу нескольких конструкций, необходимо также оптимизировать плотность затравки клеток-мишеней в 96-луночном планшете. Клетки-мишени должны поддерживаться таким образом, чтобы они не росли чрезмерно сливающимися или не имели конкурентного ограничения роста к концу анализа без необходимости смены среды, чтобы свести к минимуму какое-либо вмешательство. Планшеты большего размера могут быть использованы для размещения большего количества клеток и увеличения продолжительности эксперимента. Тем не менее, чтобы получить полную картину скважины, изображения должны быть сшиты, и каждая скважина должна обрабатываться отдельно, что может не сделать ее быстрой и высокопроизводительной.
Другой подход к долгосрочному флуоресцентному мечению опухолевых клеток заключается в лентивирусной трансдукции зеленым флуоресцентным белком (GFP) или красным флуоресцентным белком (RFP). Надлежащая клональная селекция должна быть проведена для отбора высокообогащенных (почти на 100%) самых ярких колоний для наилучшего соотношения сигнал/шум. Краситель жизнеспособности должен быть выбран соответствующим образом на основе флуоресцентных детекторов в приборе визуализации.
Фоновая флуоресценция зависит от используемого носителя и, следовательно, должна быть проверена, чтобы избежать потери сигнала при получении изображений. Обычные среды содержат компоненты, которые при возбуждении излучают значительную флуоресценцию. Рекомендуется использовать низкофоновый носитель19. Можно использовать PBS, но это может повлиять на ячейки во время получения изображения, так как получение изображений занимает примерно 20 минут в зависимости от настроек, установленных для захвата изображений.
Одним из ограничений этого анализа является невозможность получения изображений в нескольких временных точках одной и той же 96-луночной пластины после добавления красителя жизнеспособности. Влияние добавления ПИ в течение длительного времени для данной публикации не оценивалось. Тем не менее, было бы идеально иметь возможность обнаруживать живые и мертвые/умирающие клетки-мишени в течение определенного периода времени, используя одну и ту же пластину. Может быть трудно отделить отдельные клетки, если клетки становятся слишком сливающимися. Площадь клеточного монослоя и интенсивность флуоресценции могут быть использованы для сравнения процента живых/мертвых клеток, как описанона рисунке 20.
Альтернативные методы, используемые для обнаружения цитолиза CAR-T-клетками, не измеряют непосредственно абсолютное число мертвых и живых клеток, а оценивают потенцию косвенными методами, которые подробно описаны в другом месте 4,5. Таким образом, этот метод дает абсолютный учет эффекторных клеток и может быть использован при совместном культивировании 3 типов клеток в зависимости от возможностей визуализирующего инструмента. Требуется очень мало клеток (5000 на лунку), которые могут меняться вместе со свободой выбора момента времени, что является огромным преимуществом использования этого анализа. Клетки-мишени в суспензии и в 3-мерной сфероидной культуре также могут быть использованы в культуре с эффекторными клетками и цитолизом, как описано в другом месте21. Кроме того, эта платформа может быть использована для скрининга больших библиотек малых молекул и соединений для определения наиболее эффективных молекул, а многократное дозирование может быть выполнено в несколько моментов времени.
Помимо скорости и гибкости системы, конечная выгода заключается в стоимости. Флуоресцентный аппарат для визуализации, планшеты и реагенты широко распространены и доступны для покупки, особенно по сравнению с устройствами, которые являются более сложными и могут даже использовать драгоценные металлы в своих одноразовых планшетах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
MDA-MB-231 были любезным подарком от доктора Шейна Стеклайна. Авторы выражают признательность за финансирование со стороны Онкологического центра Университета Канзаса для проведения этого исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Methods in Cell Biology. 167, Academic Press. 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D. Jr, Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis. , https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023).
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
