Summary
Tek tümör antijenini hedefleyen kimerik antijen reseptörü (CAR) eksprese eden Jurkat hücreleri tarafından kantitatif tümör hücresi öldürmesini değerlendirmek için bir protokol. Bu protokol, periferik kandan türetilen T hücrelerinde onaylanmadan önce CAR menteşe yapılarının hızlı optimizasyonu için bir tarama platformu olarak kullanılabilir.
Abstract
Kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri onkolojinin ön saflarında yer alır. Bir CAR, eşlik eden bir zincir içi bağlayıcı ve ardından bir menteşe, transmembran ve yardımcı uyarıcı alan ile bir hedefleme alanından (genellikle tek zincirli değişken bir parça, scFv) oluşur. Zincir içi bağlayıcı ve menteşe alanının değiştirilmesi, CAR aracılı öldürme üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Bir CAR yapısının her bir parçası için birçok farklı seçenek göz önüne alındığında, çok sayıda permütasyon vardır. CAR-T hücreleri yapmak zaman alıcı ve pahalı bir süreçtir ve birçok yapıyı yapmak ve test etmek ağır bir zaman ve malzeme yatırımıdır. Bu protokol, Jurkat hücrelerinde (CAR-J) menteşe için optimize edilmiş CAR yapılarını hızlı bir şekilde değerlendirmek için bir platformu açıklar. Jurkat hücreleri, verimli CAR transdüksiyonuna izin veren, yüksek lentivirüs alımına sahip ölümsüzleştirilmiş bir T hücre hattıdır. Burada, bir floresan görüntüleyici kullanarak CAR-J'yi hızlı bir şekilde değerlendirmek için bir platform sunuyoruz, ardından PBMC'den türetilen T hücrelerinde sitolizin doğrulanması geliyor.
Introduction
CAR-T hücre tedavisi, Ulusal Kanser Enstitüsü6 tarafından bildirildiği üzere, 2017'den bu yana 1 FDA onaylı CAR-T ürününden de anlaşılacağı gibi, hematolojik malignitelerde büyük umut vaat etmektedir. Katı tümörleri hedeflemek için klinik çalışmalarda çok sayıda CAR-T hücresi vardır. Yeni CAR hedeflerinin mühendisliği ve CAR yapısının optimize edilmesi, bir CAR-T hücresinin etkinliği için hayati önem taşır. Her uygulama için ideal CAR yapısının seçilmesi, normal dokularda düşük TAA ekspresyon seviyelerinden kaçınırken, tümörle ilişkili antijenlerin (TAA) doğru hedeflenmesi için gereklidir2.
Bir CAR yapısı temel olarak beş bölmeden oluşur: (1) tümör antijenini hedefleyen hücre dışı tek zincirli değişken fragman (scFv) alanı; (2) menteşe alanı; (3) transmembran alanı; (4) hücre içi sitoplazmik T hücresi uyarıcı alanı; ve (5) sinyal alanı. Bu alanların her birinin değiştirilmesi, hedef hücresi3 ile etkileşime giren CAR-T hücresinin hassasiyetini etkiler. Bu nedenle, bu CAR yapılarının sitotoksisitesini ve çapraz reaktivitesini in vitro olarak değerlendirmek, in vivo deneylere doğru ilerlemek için doğru yapıyı seçmek için kritik öneme sahiptir. T hücreleri tarafından sitolizi değerlendirmenin mevcut yöntemleri arasında 51Cr salım testi, laktat dehidrojenaz salım testi, biyolüminesan görüntüleme testi, gerçek zamanlı empedans tabanlı hücre analizi ve hücre bazlı akış sitometrisi testi 4,5 bulunur. Burada açıklanan floresan görüntüleme tabanlı platform, T hücreleri tarafından sitolizi değerlendirmenin dolaylı bir yönteminin aksine, T hücresi sitolizinin doğrudan bir miktar tayini olan canlı ve ölü hücrelerin sayısını tanımlar.
İşte MDA-MB-231 üçlü negatif meme kanseri (TNBC) hücrelerine karşı epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) CAR eksprese eden Jurkat hücrelerinin sitotoksisitesini değerlendirmek için minimum müdahale ile kolay, uygun maliyetli, hızlı ve yüksek verimli bir tekniktir ve EGFR CRISPR MDA-MB-231 hücrelerini devre dışı bırakır. Jurkat hücreleri, T hücresi aktivasyonunu ve sinyal mekanizmalarını incelemek için yaygın olarak kullanılanölümsüzleştirilmiş insan T Lenfosit Hücreleri6'dır 7. Ayrıca, Jurkat hücreleri, çoklu çalışmalarda in vitro CAR testi için kullanılmıştır 8,9,10,11. Jurkat hücreleri, lentivirüs tarafından kolayca transdüksiyona sahiptir ve sürekli proliferasyona sahiptir ve bu sistem, çeşitli EGFR CAR yapılarının menteşe alanını optimize etmek için kullanılmıştır.
Bu test, çeşitli tümör antijenlerini hedef alan çoklu CAR yapılarını taramak için kullanılabilir ve çoklu yapışık tümör hücre hatlarına karşı ve çeşitli efektör/tümör (E:T) oranlarında kullanılabilir. Ek olarak, birden fazla zaman noktası değerlendirilebilir ve çeşitli CAR yapıları arasında en iyi öldürmeyi belirlemek için kopya sayısı değiştirilebilir. En iyi yapıların, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) türetilen CD3 T hücreleri kullanılarak doğrulanması gerekir. Bu yöntemin geliştirilmesinin arkasındaki genel amaç, düşük iletim verimliliği gibi engellerin üstesinden gelerek CAR menteşe geometrisini yüksek verimli bir şekilde hızla optimize etmek ve ardından PBMC'den türetilen T hücrelerinde onay almaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm hücre kültürü çalışmaları, laboratuvar önlüğü, eldivenler ve standart aseptik teknikler izlenerek bir biyogüvenlik kabininde yapılır.
1. Jurkatları ifade eden CAR oluşturma (CAR-J)
- Jurkat hücrelerini satın alın, ATCC'den E6-1'i klonlayın. Bir T-75 şişesinde 1 x 106 hücreyi çözün ve bunları T-75 şişelerinde kültürleyin. % 5 CO 2 ile 37 ° C'de bir inkübatörde% 10 FBS ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamını kullanarak mL başına 0.6 x10 6 hücrede süspansiyon halindetutun.
- Plaka 1 x 10 5 Jurkat hücresi ile muamele edilmiş bir doku kültürünün oyuğu başına24 oyuklu plaka, lentiviral verimliliği artıran 4 μg / mL polibren içeren 500 μL RPMI büyüme ortamında plaka. Lazer tabanlı bir floresan algılama tezgah üstü hücre analizörü kullanarak hücreleri sayın. Kuyu sayısı, değerlendirilecek yapı sayısına bağlıdır. Bu örnekte 4 yapı ve dönüştürülmemiş bir denetim kullanılacaktır. CAR yapı tasarımı Tablo 1'de gösterilmektedir.
- Her CAR yapısından 10 μL lentivirüs / kuyu ekleyin. CAR yapı tasarımı ve lentivirüs üretimi daha önceanlatıldığı gibi yapıldı 12.
- Ertesi gün, her bir kuyucuğa 1 mL büyüme RPMI ortamı ekleyin ve inkübatörde 37 °C'de% 5 CO2 ile kültürlemeye devam edin.
- Hücreleri 2 gün sonra toplayın (Jurkat transdüksiyonundan toplam 72 saat sonra) ve sayın.
- Jurkat hücrelerinde CAR ekspresyonunu doğrulamak için çalışan akış için 1 x 104 hücre alın. Kısaca, CAR-J'yi 4 °C'de karanlıkta 30 dakika boyunca CAR pozitifliğini tespit etmek için kullanılan Bayrak etiketini hedefleyen antikorlarla etiketlemeden önce hücreleri 2x FACS boyama solüsyonu (FSS) ile yıkayın. FSS ile tekrar 2 kez yıkayın ve hücreleri daha önce tarif edildiği gibi bir akış sitometresinden geçirin12. Üretici tarafından önerilen antikor konsantrasyonunu kullanın.
- Jurkat hücreleri kolayca transdüksiyona uğrar ve neredeyse her zaman %>90 CAR ekspresyonu gösterir. Ko-kültür sitotoksisite testinden çok önce CAR-J üretin ve daha sonra kullanmak üzere dondurun.
2. CFSE etiketli tümör hücrelerinin kaplanması
NOT: MDA-MB-231 (ATCC, HTB-26'dan) hücreleri bir işbirlikçinin hediyesiydi ve EGFR KO MDA-MB-231 daha önce açıklandığı gibioluşturuldu 12.
- Bir T-75 şişesinde 1 x 106 hücreyi çözün ve bunları T-75 şişelerinde kültürleyin. MDA-MB-231 tümör hücrelerini ve CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 tümör hücrelerini, %10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş Dulbecco'nun modifiye kartal ortamının (DMEM) 14 mL'sinde 37 ° C'de bir inkübatörde% 5 CO2 ile koruyun ve yaklaşık% 70 birleştiğinde bölünür.
- Yaklaşık% 70 birleşmeyi sağlamak için düzenli parlak alan mikroskobu altında yapışık tümör hücrelerini gözlemleyin.
- Serolojik bir pipet kullanarak büyüme ortamını şişeden çıkarın. T75 şişesine 3 mL tripsin ekleyin ve hücreleri şişeden ayırmak için 3-5 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatöre koyun.
- Eşit miktarda (3 mL) büyüme ortamı kullanarak tripsini nötralize edin. Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpünde toplayın ve hücreleri peletlemek için 4 dakika boyunca hücreleri 400 x g'da döndürün.
- Süpernatanı bir pipet kullanarak atın ve hücreleri 2 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin. Bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.
- 8 x 105 hücreyi başka bir 15 mL'lik tüpe aktarın ve 1 mL'lik bir hacme ulaşmak için PBS ekleyin.
- Her tüpe 2 μL karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE; 5 μM stok konsantrasyonu) ekleyin ve 1 mL'lik bir pipet kullanarak iyice karıştırın.
- Hücreleri CFSE ile inkübatörde 20 dakika boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin. Tüpleri 20 dakika sonra inkübatörden çıkarın ve tüpe 5 mL büyüme ortamı ekleyin.
- CFSE etiketli hücreleri peletlemek için tüpleri 400 x g'da 4 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın ve hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 mL taze ortam ekleyin.
- Bir hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu yeniden değerlendirin. 4 x 105 hücreyi 25 mL'lik bir reaktif rezervuarına aktarın ve toplam 8 mL'lik bir hacim için ortam ekleyin.
- 100 μL ortamda 5000 tümör hücresini/kuyusunu tohumlamak için yeterli hacmi sağlamak için, çok kanallı pipeti kullanarak pipetleme yapabilmek ve adım 1.7 sırasında birkaç hücre kaybını telafi etmek için hacim gerekiyordu, %10-20 ekstra hücre ve ortam hacmi hazırlayın.
- Hücre süspansiyonunu 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak iyice karıştırın. 100 μL'lik çok kanallı bir pipet kullanarak, sol yarıdaki şeffaf düz tabanlı siyah 96 oyuklu plakanın her sırasına 100 μL hücre süspansiyonu pipetleyin. Örnek bir kaplama stratejisi Tablo 2'de bulunabilir.
- EGFR KO hücrelerini benzer şekilde plakanın sağ yarısına pipetleyin. Tüm plaka kaplandıktan sonra, tümör hücrelerinin oyuklarda eşit dağılımını sağlamak için plakayı doku kültürü başlığı platformunda ileri geri ve yan yana sürükleyin.
- Tümör hücrelerinin tutunması için plakayı inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 ile 4 saat inkübe edin.
3. Jurkatları CFSE etiketli tümör hücreleri ile eksprese eden CAR'ın birlikte kültürlenmesi
- Transdüksiyonsuz ve CAR eksprese eden Jurkat hücrelerinin sayımlarını kullanarak, her bir CAR-J'nin 4 x 105 hücresini 25 mL'lik bir rezervuara aktarın. Toplam 2 mL hacim için DMEM büyüme ortamı ekleyin.
- 4:1 E:T için, bağlı tümör hücrelerini rahatsız etmemek için her bir oyuğun kenarı boyunca nazikçe çok kanallı bir pipet kullanılarak 100 μL ortamda oyuk başına 2 x 104 CAR-J ilave edildi.
- Tümör hücreleri ve Jurkat hücreleri içeren kuyucukların kenarına çok kanallı bir pipet kullanarak 100 μL daha büyüme ortamı ekleyin. Sadece tümör grupları, tüm oyuklarda toplam 300 μL ortam yapmak için 200 μL ortam alır.
- Jurkat hücrelerinin tümör hücreleri üzerinde eşit dağılımını sağlamak için plakayı platform boyunca ileri geri ve yan yana hareketlerle sürükleyin.
- İnkübatörde 37 °C'de 48 saat boyunca% 5 CO2 ile kokültüre izin verin.
4. Görüntüleme için plakanın hazırlanması
- Kuyucuk sayısına bağlı olarak düşük arka plan floresan ortamında 1 μg/mL'de bir propidyum iyodür (PI) çözeltisi yapın ve her biri 100 μL ortam elde edin.
- 84 kuyu için PI içeren 9 mL ortam hazırlayın. Ortamı bir pipet kullanarak iyice karıştırın.
- Triton-X'i deiyonize su ile seyrelterek 10 mL %20 Triton-X çözeltisi yapın. 48 saatlik kokültürden sonra, CAR-J içeren süpernatanı, plakanın tek bir ters çevrilmesiyle ve kağıt havluya hafifçe vurarak atın.
- Şimdi, yapışan tümör hücrelerini rahatsız etmemek için çok kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa PI içeren 100 μL yukarıda hazırlanmış ortam (adım 4.2) ekleyin.
- Her tümör tipinin ilk kuyucuğuna 20 μL% 20 Triton-X çözeltisi ekleyin, bu da toplam ölü kontrol işlevi görür.
- Plakayı inkübatörde 20 dakika bekletin. Floresan görüntüleme sitometresini kullanarak plakayı görüntüleyin. Veriler bilgisayarda saklanır ve daha sonra analiz edilebilir.
5. Floresan görüntülerin analizi
- Yeşil floresan kanalını ayarlamak için tümör hücrelerinden birini kullanın.
- Kuyu kenarındaki hücreleri çıkarmak için kuyu maskesini %98'e düşürün, çünkü sinyal kenarda mükemmel değildir.
- Yeşil, floresan CFSE kanalındaki CFSE etiketli tümör hücrelerini tanımlayın. Kuyudaki tüm hücreleri almak için floresan yoğunluğu eşik değerini değiştirin.
- CFSE kanalında tespit edilen kalıntıları temizlemek için minimum hücre çapını 25 μm'ye ayarlayın. Bu, analiz edilen hücre tipine bağlı olarak değişir.
- Birbirleriyle temas halinde olduklarında tek tek hücreleri tanımlamak için Ayrı Dokunma Nesneleri'ni etkinleştirin.
- Görüntü ekranında CFSE'yi seçin ve sistem tarafından neyin seçildiğini anlamak için grafik kaplamaya bakın.
- CFSE etiketli hücreler düzgün bir şekilde alındıktan sonra, canlı ve ölü hücre popülasyonunu tanımlamak için kapılar ayarlayın.
- CFSE etiketli hücreleri seçerek, y ekseninde ve x ekseninde ortalama PI yoğunluğuna karşı bir sayım histogramı oluşturun.
- Triton-X'i eklediğimiz kuyuya dayanarak (adım 4.5), düşük PI lekeli ve yüksek PI lekeli hücreleri ayırt etmek için bir ayırıcı çizin. Bu kuyu, yüksek PI lekeli bir bölgede hücrelerin çoğuna sahip olmalıdır.
NOT: PI, canlı hücrelerde bazal sinyal gösterir. Bu nedenle, Triton-X eklemek tüm hücreleri öldürür ve kırmızı floresan kanalında parlak bir şekilde boyanırlar. Bu, ölü hücreleri canlı hücrelerden ayırmak için kapıların çizilmesini kolaylaştırır. - Hücreleri daha iyi görüntüleyebilmek için x ekseni değerini ayarlayın. Şimdi düşük PI lekeli hücreleri Canlı hücreler olarak etiketleyin.
- Canlı hücreleri seçerek, x ekseninde alan ve y ekseninde sayılan başka bir histogram ayarlayın.
- Enkazı değil, hücreleri yakalamak için tümörü iyi kullanarak başka bir ayırıcı çizin. Jurkat ile muamele edilmiş kuyular, CFSE lekelenecek ve sayımlardan çıkarılması gereken enkaz biriktirmeye başlayacaktır. Kalan enkaz olmayanlar "Büyük hücreler" olarak etiketlenir.
- Analizi tüm plaka üzerinde çalıştırın ve sayıları içeren elektronik tabloyu dışa aktarın.
- CAR-J'ye maruz kaldıktan sonra kuyuda kalan canlı CFSE etiketli tümör hücrelerinin sayısını belirlemek için Büyük sayıları çizin. Tek yönlü ANOVA kullanarak istatistikleri belirleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CAR-J1 için 1: 8 ile 8: 1 arasında bir E: T oranı aralığı, TNBC MDA-MB-231 hücrelerinde EGFR'yi hedefleyen 72 saatte değerlendirildi. Jurkat hücreleri, adım 2'de tarif edildiği gibi CAR-J hücreleri oluşturmak için polibren ile CAR lentivirüsü ile transdüksiyona tabi tutuldu. CAR-J1'in sitotoksisitesi, 1: 8 oranında öldürmede hiçbir fark olmaksızın daha yüksek E: T oranı ile önemli ölçüde artmıştır (Şekil 1). 72 saat boyunca 4:1 E:T'de %50'den fazla öldürme gözlendi. Bu E: T, çoklu CAR yapılarının hızlı sitotoksisite değerlendirmesi için süresi 48 saate düşürülen sonraki deneyler için kullanıldı. Menteşe alanı değiştirilmiş EGFR hedeflemeli CAR yapıları tasarlanmıştır (Tablo 1). Kullanılan 4 farklı menteşe, burada açıklandığı gibi IgG uzun, IgG orta, IgG kısa ve CD8a'dır13. Bu 3 yapı, Jurkat hücreleri üzerinde eksprese edildi ve CAR pozitifliği, burada açıklandığı gibi akış sitometrisi ile Flag etiketli hücrelerin yüzdesi değerlendirilerek belirlendi (Şekil 2A-D)12. CAR ekspresyonunu belirlemek için kontrol grubu olarak transdüksiyona uğramamış Jurkat hücreleri kullanıldı ve geçit stratejisi (Şekil 2E)'de gösterilmiştir. Jurkat hücrelerinde eksprese edilen bu 4 CAR yapısının sitotoksisitesi, MDA-MB-231 hücrelerini eksprese eden EGFR ve CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 hücrelerine karşı değerlendirildi. Antijene özgü öldürme tüm yapılar tarafından gözlenirken (Şekil 3A), EGFR KO hücrelerine karşı önemli bir öldürme gözlenmedi (Şekil 3B), bu da öldürmeye sadece scFv aracılığıyla özel olarak aracılık edildiğini düşündürdü. Dönüştürülmemiş Jurkat hücreleri tarafından herhangi bir öldürme olmadı. CFSE etiketli tümör hücrelerinin PI ile boyanmış ölü çekirdek ile örtüşmesinin sarı görünmelerini sağladığı durumlarda, tümör öldürmenin temsili görüntüleri de gösterilmiştir (Şekil 4). Veriler, grup başına 6 teknik kopya içeren 3 bağımsız deneyi temsil eder.
Bu, bu CAR yapılarının PBMC'den türetilen CD3 T hücrelerinde eksprese edilmesiyle daha da doğrulandı. CD3 T hücrelerinde düşük CAR ekspresyonu vardır ve bunlar daha sonra steril akış sıralaması ile zenginleştirilir (Şekil 5). Bununla birlikte, EGFR CAR içeren CD8 menteşesinin ifadesi yoktu. Bu nedenle, IgG uzun, IgG ortamı ve IgG kısa içeren diğer 3 CAR yapısı, MDA-MB-231 hücrelerine karşı sitotoksik potansiyelleri açısından değerlendirildi. Diğer 2 yapıya kıyasla en az sitotoksik potansiyele sahip olan IgG kısa ile benzer bir öldürme eğilimi vardır (Şekil 6). IgG uzun ve IgG ortamı CAR-T hücreleri arasında en iyi yapıyı belirlemek için, TNBC tümör hücrelerine maruz kaldıklarında ve maruz kalmadan aktivasyonları, daha önce tarif edildiği gibi sitokinlerin hücre içi boyanması ile değerlendirildi12. MDA-MB-436, düşük EGFR seviyelerine sahiptir ve MDA-MB-468, 13 TNBC hücre hattı12 paneline sahip bir batı lekesine dayanan en yüksek EGFR protein ekspresyonuna sahiptir. IgG uzun CAR-T hücreleri, tümör hücrelerine maruz kalmadan en az bazal aktivasyon seviyelerine (TNFa, 4-1BB) ve düşük sitotoksik granül salınımına (perforin ve granzim B)14 sahipti (Şekil 7). Yüksek EGFR eksprese eden MDA-MB-468 hücrelerine maruz kaldığında, IgG uzun CAR-T hücreleri, TNFa ve 4-1BB'ye dayalı en yüksek aktivasyona sahipti.
Şekil 1: Bir dizi E:T boyunca EGFR CAR-J1 sitotoksik değerlendirmesi. CFSE işaretli MDA-MB-231 tümör hücreleri, 1:8, 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 ve 8:1 E:T oranında transdüksiyonsuz Jurkat hücreleri veya EGFR'yi hedefleyen CAR-J1 ile kaplandı ve daha yüksek efektör hücrelerle artan sitotoksisite gösterdi. Veriler ortalama ± SD olarak gösterildi ve istatistiksel anlamlılık Student t-testi kullanılarak değerlendirildi. 1:8 E:T anlamlı değildi, 1:4 E:T ***p<0.001 ve geri kalanı ****p<0.0001 idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İn vitro sitotoksik değerlendirme için EGFR CAR Jurkat üretimi. (A-D) 4 farklı yapının yaklaşık% 90 -% 100 CAR ifadesi CAR IgG uzun, CAR IgG orta, CAR IgG kısa, CAR CD8a. (E) CAR pozitifliğinin belirlenmesi için geçit stratejisi: SSC-A ve FSC-A grafiğinde hariç tutulan enkaz; FSC-H ve FSC-A grafiğinde seçilen Tek Hücreler; ve canlı boya DAPI negatif geçit ile seçilen canlı hücreler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: CAR-J ve CFSE etiketli tümör hücrelerinin ko-kültüründe sitotoksisite değerlendirmesi. (A) CFSE etiketli MDA MB 231 hücreleri, tümör hücresi öldürmede değişen etkinlik gösteren 48 saat boyunca 4: 1 E: T oranında CAR-J ile kaplandı. (B) CFSE etiketli CRISPR EGFR KO MDA MB 231 hücreleri, CAR-J hücrelerinin hiçbiri tarafından herhangi bir öldürme yaşamadı. Veriler ortalama ± SD olarak gösterildi ve istatistiksel anlamlılık tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile değerlendirildi. **p<0.01; p<0.0001; NS: Önemli değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 48 saatlik ko-kültürden sonra görüntülerin görsel temsili. (A) Sadece CFSE (yeşil) etiketli tümör hücrelerine sahip tümör grubu. (B) Kırmızı hücrelerin ölü Jurkat hücreleri olduğu ve (C) oklarla gösterildiği gibi ölü tümör hücrelerini (sarı) gösteren yeşil ve kırmızı kaplamaları ile dönüştürülmemiş Jurkat hücrelerinin eklenmesi. Sarı olmayan yeşil hücrelerin sayısı ölçülür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: EGFR CD3 CAR-T hücre zenginleştirmesi. (AB) CAR ekspresyonu, zenginleştirmeden önce Flag pozitif ve IgG pozitif hücrelerin yüzdesi belirlenerek ve (C) steril akış sıralaması ile zenginleştirme sonrası değerlendirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: CD3 CAR-T ve CFSE işaretli tümör hücrelerinin ko-kültüründe sitotoksisite değerlendirmesi. CFSE işaretli MDA MB 231 hücreleri, tümör hücresi öldürmede değişen etkinlik gösteren 48 saat boyunca 4:1 E:T oranında CAR-J ile kaplandı. Veriler ortalama ± SD olarak gösterildi ve istatistiksel anlamlılık tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile değerlendirildi. **p<0.01; p<0.0001; NS: Önemli değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: EGFR CD3 CAR-T hücre Aktivasyonu. CAR-T hücreleri tümör hücrelerine maruz bırakıldı ve (A) TNFa, (B) 4-1BB, (C) perforin ve (D) granzim B için hücre içi sitokin seviyeleri değerlendirildi. Veriler ortalama ± SD olarak gösterildi ve istatistiksel anlamlılık tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak değerlendirildi *p<0.05; **p<0.01; **p<0,001; p<0.0001; NS: Önemli değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Hayır. PA EGFR806 scFv | Vh-Vl Bağlayıcı | Menteşe/Ara Parça | TM | Sitoplazmik |
| ARABA IgG Uzun | Beyaz (18 aa) | IgG4 EQ CH2 CH3 (229 aa) | CD4 Serisi | 4-1BB / CD3z |
| ARAÇ IgG Orta | Beyazlık | IgG4 CH3 (129 aa) | CD28 Serisi | 4-1BB / CD3z |
| CAR IgG Kısa | Beyazlık | IgG kısa (12 aa) | CD4 Serisi | 4-1BB / CD3z |
| ARAÇ CD8a | Beyazlık | CD8 (45 aa) | CD8a (İngilizce) | 4-1BB / CD3z |
Tablo 1: CAR yapı tasarımları. Kısaltmalar: aa = amino asitler; TM = Transmembran.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | Triton-X | Yalnızca MDA MB 231 | Triton-X | Yalnızca MDA MB 231 EGFR KO | ||||||||
| B | MB231 + Sahte 4:1 | MB231 EGFR KO + Sahte 4:1 | ||||||||||
| C | MB231 + EGFR IgG Uzun 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Uzun 4:1 | ||||||||||
| D | MB231 + EGFR IgG Orta 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Orta 4:1 | ||||||||||
| E | MB231 + EGFR IgG Kısa 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Kısa 4:1 | ||||||||||
| F | MB231 + EGFR CD8a 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR CD8a 4:1 | ||||||||||
| G | ||||||||||||
| H | ||||||||||||
Tablo 2: Numune kaplama stratejisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, Jurkat hücrelerinde CAR ekspresyonu tarafından indüklenen hedefe özgü sitolitik aktiviteyi verimli bir şekilde değerlendirmek için hızlı bir yöntem önerdik. Tüm CAR yapıları aynı scFv'ye sahiptir, ancak CAR-T hücrelerinin potensini etkilediği gösterilen farklı menteşe ve transmembran alanları13. Bu CAR-J tarafından spesifik olmayan öldürmenin daha ileri değerlendirmesi, antijen nakavt (KO) hücreleri ile kültürlenerek yapıldı. Bu, öldürmenin tümör antijenine özgü olduğunu ve CAR-J tarafından bazal aktivasyona bağlı olmadığını göstermektedir. Bir dizi E: T oranının sitotoksik potansiyeli, belirli zaman noktalarında tümör hücrelerini ortadan kaldırmak için gereken en az sayıda efektör hücre tanımlanarak kolayca belirlenebilir. Bu yapıların özgüllüğünü değerlendirmek için aynı veya farklı kanser türünden ve normal hücrelerden çoklu hücre hatları da kullanılabilir. CAR-J platformu tarafından tanımlanan en güçlü adaylar daha sonra PBMC'den türetilen CD3 T hücrelerinde CAR'ın eksprese edilmesi ve benzer öldürme deneylerinin gerçekleştirilmesi ve antijen pozitif ve negatif tümör hücrelerine maruz kalındığında tükenme ve aktivasyonun değerlendirilmesi ile daha da karakterize edilebilir.
Jurkat hücrelerinin, değiştirilmiş bir T hücresi reseptörü (TCR) sinyal yolu15 olan CD4+ hücreleri olduğuna dikkat edilmelidir. Bu nedenle, CAR yapılarının hücre içi sinyal alanı optimizasyonu ideal olarak CD3 T hücreleri16 ile yapılmalıdır ve Jurkat hücreleri ile en iyi şekilde çalışmayabilir. İlginç bir şekilde, CD4 T hücreleri, IgG uzun menteşeli CD4 CAR-T hücrelerini hedefleyen EGFR'nin intrakraniyal tümör modelinde TNBC tümörlerini tamamen yok edebildiği önceki bir yayında gösterildiği gibi sitotoksisite sergiler12. Ek olarak, CD4 CAR T hücreleri, GBM tümör modelinde CD4 ve CD8 T hücrelerinin veya tek başına CD8 T hücrelerinin karışımına kıyasla uzun süreli güç ve daha iyi öldürme gösterir ve bu da onları etkili CAR-T tedavisi için klinik olarak önemli T hücreleri alt kümesi haline getirir17.
Jurkat hücreleri, birincil T hücresi aktivasyonunun tüm sitokinlerini salgılamasalar da, aktivasyon üzerine IL2 üretir ve CD69'u yukarı regüle eder 8,18. Bununla birlikte, IL2 ve CD69 düzeylerinin değerlendirilmesi, bu yaklaşımla mutlak tümör hücre sayılarında ölçülen hedef hücrelerin doğrudan sitolizi hakkında değil, Jurkat hücrelerinin aktive olduğu hakkında bilgi verir. Bununla birlikte, sitotoksisite ve aktivasyonun değerlendirilmesi, yeni CAR moleküllerinin etkilerini tam olarak anlamak için önemlidir.
Bu deneydeki ortak kültürün süresi, kullanılan yapılara göre değiştirilebilir. Tümör hücreleri üzerindeki CFSE etiketlemesinin, kaplamadan 4 gün sonrasına kadar tespit edilebilir olduğu bulundu. Bu nedenle, yüksek bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için deneyler 72 saat içinde gerçekleştirildi. Tümör hücrelerinin bölünmesi ile KSSE yoğunluğu azaldığından, kullanılan KKSE miktarı ve süresi kullanılan tümör hücrelerine göre değişmelidir. Bu, aynı anda birden fazla yapıyı analiz etmek için yüksek verimli bir deney olduğundan, 96 oyuklu bir plakadaki hedef hücrelerin tohumlama yoğunluğunun da optimize edilmesi gerekir. Hedef hücreler, herhangi bir müdahaleyi en aza indirmek için ortamı değiştirmeye gerek kalmadan, testin sonunda aşırı birleşmeyecek veya rekabetçi büyüme kısıtlamasına sahip olmayacak şekilde korunmalıdır. Daha fazla hücreyi barındırmak ve deneyin ömrünü uzatmak için daha büyük kuyu plakaları kullanılabilir. Bununla birlikte, kuyunun tam bir resmini elde etmek için görüntülerin dikilmesi gerekir ve her bir kuyu üzerinde ayrı ayrı çalışılması gerekir, bu da onu hızlı ve yüksek verim sağlamayabilir.
Uzun süreli floresan etiketleme tümör hücrelerinin bir başka yaklaşımı, yeşil floresan proteini (GFP) veya kırmızı floresan proteini (RFP) ile lentiviral transdüksiyondur. En iyi sinyal-gürültü oranı için yüksek oranda zenginleştirilmiş (yaklaşık% 100) en parlak kolonileri seçmek için uygun klonal seçim yapılmalıdır. Canlılık boyasının, görüntüleme cihazındaki floresan dedektörlerine göre uygun şekilde seçilmesi gerekir.
Arka plan floresansı, kullanılan ortama bağlıdır ve bu nedenle görüntü alınırken sinyal kaybını önlemek için kontrol edilmelidir. Normal ortam, uyarıldığında önemli ölçüde floresan yayan bileşenler içerir. Düşük arka plan ortamı kullanılması önerilir19. PBS kullanılabilir, ancak görüntü yakalamak için ayarlanan ayarlara bağlı olarak görüntülerin alınması yaklaşık 20 dakika sürdüğünden, görüntü alma sırasında hücreleri etkileyebilir.
Bu tahlilin sınırlamalarından biri, bir canlılık boyası eklendikten sonra aynı 96 oyuklu plakanın birden fazla zaman noktasında görüntü alamamaktır. Bu yayın için PI ilavesinin uzun süre etkisi değerlendirilmemiştir. Bununla birlikte, aynı plakayı kullanarak bir süre boyunca canlı ve ölü/ölmekte olan hedef hücreleri tespit edebilmek ideal olacaktır. Hücreler aşırı birleşikleşirse, tek tek hücreleri ayırmak zor olabilir. Hücre tek tabakası alanı ve floresan yoğunluğu, tarif edildiği gibi canlı/ölü hücrelerin yüzdesini karşılaştırmak için kullanılabilir20.
CAR-T hücreleri tarafından sitolizi tespit etmek için kullanılan alternatif yöntemler, ölü ve canlı hücrelerin mutlak sayısını doğrudan ölçmez, bunun yerine başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanan dolaylı yöntemlerle gücü değerlendirir 4,5. Bu nedenle, bu yöntem efektör hücrelerin mutlak bir hesabını verir ve görüntüleme cihazının kapasitesine bağlı olarak 3 hücre tipinin ko-kültüründe de kullanılabilir. Bu testi kullanmanın büyük avantajları olan bir zaman noktası seçme özgürlüğü ile birlikte değişebilen çok az hücre (kuyu başına 5000) gereklidir. Süspansiyondaki ve 3 boyutlu sferoid kültüründeki hedef hücreler, efektör hücreler ve başka bir yerde tarif edildiği gibi belirlenen sitoliz ile kültürde de kullanılabilir21. Ayrıca, bu platform, en etkili molekülleri tanımlamak için küçük moleküllerin ve bileşiklerin büyük kütüphanelerini taramak için kullanılabilir ve birden fazla zaman noktasında çoklu dozlama yapılabilir.
Sistemin hızı ve esnekliğinin yanı sıra, nihai fayda maliyettir. Floresan görüntüleme makinesi, plakalar ve reaktifler, özellikle daha karmaşık olan ve hatta tek kullanımlık plakalarında değerli metaller kullanabilen cihazlarla karşılaştırıldığında, satın alınması yaygın ve uygun maliyetlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
MDA-MB-231, Dr. Shane Stecklein'ın nazik bir hediyesiydi. Yazarlar, bu araştırmayı yürütmek için Kansas Üniversitesi Kanser Merkezi'nden fon aldığını kabul ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Methods in Cell Biology. 167, Academic Press. 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D. Jr, Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis. , https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023).
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
