Summary
En protokol til evaluering af kvantitativ tumorcelledrab af Jurkat-celler, der udtrykker kimær antigenreceptor (CAR) rettet mod enkelt tumorantigen. Denne protokol kan bruges som screeningsplatform til hurtig optimering af CAR-hængselkonstruktioner inden bekræftelse i perifere blodafledte T-celler.
Abstract
Chimeric antigen receptor (CAR) T-celler er i spidsen for onkologi. En CAR er konstrueret af et målretningsdomæne (normalt et enkelt kædevariabelt fragment, scFv) med en ledsagende intra-chain linker efterfulgt af et hængsel, transmembran og costimulatorisk domæne. Ændring af intra-chain linker og hængseldomænet kan have en betydelig effekt på CAR-medieret drab. I betragtning af de mange forskellige muligheder for hver del af en CAR-konstruktion er der et stort antal permutationer. Fremstilling af CAR-T-celler er en tidskrævende og dyr proces, og fremstilling og test af mange konstruktioner er en tung tids- og materialeinvestering. Denne protokol beskriver en platform til hurtig evaluering af hængseloptimerede CAR-konstruktioner i Jurkat-celler (CAR-J). Jurkat-celler er en udødeliggjort T-cellelinje med høj lentivirusoptagelse, hvilket muliggør effektiv CAR-transduktion. Her præsenterer vi en platform til hurtigt at evaluere CAR-J ved hjælp af et fluorescerende kamera efterfulgt af bekræftelse af cytolyse i PBMC-afledte T-celler.
Introduction
CAR-T-celleterapi har vist stort løfte i hæmatologiske maligniteter, hvilket fremgår af de 6 FDA-godkendte CAR-T-produkter siden 2017, som rapporteret af National Cancer Institute1. Der er adskillige CAR-T-celler i kliniske forsøg til målretning af solide tumorer. Konstruktion af nye CAR-mål og optimering af CAR-konstruktionen er afgørende for effektiviteten af en CAR-T-celle. At vælge den ideelle CAR-konstruktion til hver applikation er afgørende for nøjagtig målretning af tumorassocierede antigener (TAA), samtidig med at man undgår lave niveauer af TAA-ekspression i normalt væv2.
En CAR-konstruktion er primært lavet af fem rum: (1) ekstracellulært enkeltkædet variabelt fragment (scFv) domæne rettet mod tumorantigen; (2) hængseldomæne; (3) transmembran domæne; (4) intracellulært cytoplasmatisk T-celle costimulatorisk domæne; og (5) signaldomæne. Ændring af hvert af disse domæner påvirker præcisionen af CAR-T-cellen, der interagerer med dens målcelle3. Derfor er evaluering af cytotoksicitet og krydsreaktivitet af disse CAR-konstruktioner in vitro afgørende for at vælge den rigtige konstruktion til fremskridt mod in vivo-eksperimenter. Nuværende metoder til evaluering af cytolyse af T-celler inkluderer 51Cr-frigivelsesassay, lactatdehydrogenasefrigivelsesassay, bioluminescerende billeddannelsesassay, impedansbaseret celleanalyse i realtid og cellebaseret flowcytometriassay 4,5. Den fluorescerende billeddannelsesbaserede platform, der er beskrevet her, identificerer antallet af levende vs. døde celler, hvilket er en direkte kvantificering af T-cellecytolyse i modsætning til en indirekte metode til evaluering af cytolysen af T-celler.
Her er en nem, omkostningseffektiv, hurtig og høj gennemstrømningsteknik med minimal indgriben til evaluering af cytotoksiciteten af Jurkat-celler, der udtrykker epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) CAR mod MDA-MB-231 triple-negative brystkræftceller (TNBC) og EGFR CRISPR knock out MDA-MB-231-celler. Jurkatceller er udødeliggjorte humane T-lymfocytceller6, der har været meget udbredt til at studere T-celleaktiverings- og signalmekanismer7. Desuden er Jurkat-celler blevet anvendt til in vitro CAR-test i flere undersøgelser 8,9,10,11. Jurkat-celler transduceres let af lentivirus og har vedvarende spredning, og dette system blev udnyttet til at optimere hængseldomænet for forskellige EGFR CAR-konstruktioner.
Dette assay kan bruges til screening af flere CAR-konstruktioner rettet mod forskellige tumorantigener og anvendes mod flere vedhængende tumorcellelinjer og i forskellige effektor til tumor (E: T) forhold. Derudover kan flere tidspunkter evalueres, og antallet af replikater kan ændres for at identificere det bedste drab blandt de forskellige CAR-konstruktioner. De bedste konstruktioner skal bekræftes ved hjælp af mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) afledte CD3 T-celler. Det overordnede mål bag udviklingen af denne metode er hurtigt at optimere CAR-hængselgeometri på en høj gennemstrømningsmåde og overvinde barrierer såsom lav transduktionseffektivitet efterfulgt af bekræftelse i PBMC-afledte T-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alt cellekulturarbejde udføres i et biosikkerhedsskab med laboratoriefrakke, handsker og efter standard aseptiske teknikker.
1. Generering af CAR, der udtrykker Jurkats (CAR-J)
- Køb Jurkat celler, klon E6-1 fra ATCC. Optø 1 x 106 celler i en T-75 kolbe og dyrk dem i T-75 kolber. Oprethold dem i suspension ved 0,6 x 106 celler pr. ml ved hjælp af Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medier suppleret med 10% FBS i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
- Plade 1 x 105 Jurkatceller pr. hul i en vævskultur behandlet 24 brøndplade i 500 μL RPMI-vækstmedier indeholdende 4 μg/ml polybran, hvilket forbedrer lentiviral effektivitet. Tæl celler ved hjælp af en laserbaseret fluorescerende detektionsbænkcelleanalysator. Antallet af brønde afhænger af antallet af konstruktioner, der skal evalueres. Dette eksempel vil bruge 4 konstruktioner og en ikke-transduceret kontrol. CAR-konstruktionens konstruktion er vist i tabel 1.
- Der tilsættes 10 μL lentivirus/hul for hver CAR-konstruktion. CAR konstruktion design og lentivirus produktion blev udført som beskrevet tidligere12.
- Næste dag tilsættes 1 ml vækst RPMI-medier til hver brønd og fortsæt dyrkning i inkubatoren ved 37 ° C med 5% CO2.
- Saml celler 2 dage senere (i alt 72 timer efter Jurkat transduktion) og tæl dem.
- Tag 1 x 104 celler til løbende flow for at bekræfte CAR-ekspression på Jurkat-cellerne. Vask kort sagt cellerne 2x med FACS-farvningsopløsning (FSS), før du mærker CAR-J med antistoffer rettet mod Flag-mærke, der bruges til at detektere CAR-positivitet i 30 minutter i mørke ved 4 °C. Vask 2x igen med FSS og kør celler gennem et flowcytometer som tidligere beskrevet12. Brug antistofkoncentration som anbefalet af producenten.
- Jurkat-celler transduceres let og viser næsten altid >90% CAR-udtryk. Fremstil CAR-J lang tid før co-kultur cytotoksicitetsanalysen og frys ned til senere brug.
2. Forgyldning CFSE-mærkede tumorceller
BEMÆRK: MDA-MB-231 (fra ATCC, HTB-26) celler var en gave fra en samarbejdspartner, og EGFR KO MDA-MB-231 blev oprettet som tidligere beskrevet12.
- Optø 1 x 106 celler i en T-75 kolbe og dyrk dem i T-75 kolber. Oprethold MDA-MB-231 tumorceller og CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 tumorceller i 14 ml af Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2 og spaltet, når ca. 70% sammenflydende.
- Overhold klæbende tumorceller under almindeligt brightfield-mikroskop for at sikre næsten 70% sammenløb.
- Vækstmediet fjernes fra kolben ved hjælp af en serologisk pipette. Der tilsættes 3 ml trypsin til T75-kolben og anbringes i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2 i 3-5 minutter for at løsne cellerne fra kolben.
- Neutraliser trypsin ved hjælp af lige store mængder (3 ml) vækstmedier. Opsaml cellesuspensionen i et centrifugerør og drej cellerne ned ved 400 x g i 4 minutter for at pelletere cellerne.
- Supernatanten kasseres med en pipette og cellerne resuspenderes i 2 ml fosfatbufret saltvand (PBS). Bestem cellekoncentrationen ved hjælp af en celletæller.
- Overfør 8 x 105 celler til et andet 15 ml rør og tilsæt PBS for at gøre det til et volumen på 1 ml.
- Der tilsættes 2 μL carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE; 5 μM stamkoncentration) i hvert glas og blandes godt med en 1 ml pipette.
- Inkuber cellerne med CFSE i 20 minutter i inkubatoren ved 37 °C med 5% CO2. Fjern rørene fra inkubatoren efter 20 minutter og tilsæt 5 ml vækstmedier til røret.
- Centrifuger glassene ved 400 x g i 4 minutter for at pelletere de CFSE-mærkede celler. Supernatanten kasseres med en pipette og tilsættes 1 ml frisk medie for at opslæmme cellerne igen.
- Evaluer cellekoncentrationen ved hjælp af en celletæller. Overfør 4 x 105 celler til et 25 ml reagensreservoir, og tilsæt medier til et samlet volumen på 8 ml.
- For at sikre tilstrækkelig volumen til at frø 5000 tumorceller / brønd i 100 μL medier, volumen nødvendig for at kunne pipette ved hjælp af multikanalpipetten og for at kompensere for tabet af nogle få celler under trin 1.7, forberede 10% -20% ekstra celler og medievolumen.
- Bland cellesuspensionen grundigt med en 5 ml serologisk pipette. Ved hjælp af en 100 μL multikanalpipette pipetteres 100 μL af cellesuspensionen i hver række af den klare fladbundede sorte 96-brøndplade på venstre halvdel. En strategi for plettering af prøven findes i tabel 2.
- Pipette EGFR KO-celler på samme måde på højre halvdel af pladen. Når hele pladen er belagt, skal du trække pladen frem og tilbage og side til side på vævskulturhætteplatformen for at sikre ensartet fordeling af tumorcellerne i brøndene.
- Pladen inkuberes i 4 timer i inkubatoren ved 37 °C med 5% CO2 for tumorcellerne at binde.
3. Co-kultivering af CAR, der udtrykker Jurkats med CFSE-mærkede tumorceller
- Ved hjælp af tællingerne af ikke-transducerede og CAR-ekspressive Jurkat-celler overføres 4 x 105 celler af hver CAR-J til et 25 ml reservoir. Tilføj DMEM-vækstmedier for en samlet volumen på 2 ml.
- For E:T på 4:1 blev der tilsat 2 x 104 CAR-J pr. hul i 100 μL medier ved hjælp af en flerkanalpipette forsigtigt langs siden af hvert hul for ikke at forstyrre de fastgjorte tumorceller.
- Der tilsættes yderligere 100 μL vækstmedier ved hjælp af en multikanalpipette til siden af huller, der indeholder tumorceller og Jurkat-celler. Tumorgrupperne får kun 200 μL medier for at gøre det til i alt 300 μL medier i alle brønde.
- Træk pladen langs platformen frem og tilbage og fra side til side bevægelse for at sikre ensartet fordeling af Jurkat cellerne på tumorcellerne.
- Der tillades samdyrkning i inkubatoren ved 37 °C med 5% CO2 i 48 timer.
4. Forberedelse af plade til billeddannelse
- Der fremstilles en opløsning af propidiumiodid (PI) ved 1 μg/ml i fluorescensmedier med lav baggrundsbaggrund baseret på antallet af huller, og hver får 100 μL medier.
- For 84 brønde fremstilles 9 ml medier indeholdende PI. Bland mediet grundigt ved hjælp af en pipette.
- Der fremstilles 10 ml 20% Triton-X-opløsning ved at fortynde Triton-X med deioniseret vand. Efter 48 timers samdyrkning kasseres supernatanten indeholdende CAR-J ved en enkelt invertering af pladen og bankes på køkkenrulle.
- Der tilsættes nu 100 μL ovennævnte forberedte medier (trin 4.2) indeholdende PI i hvert hul ved hjælp af en flerkanalpipette forsigtigt for ikke at forstyrre de klæbende tumorceller.
- Tilsæt 20 μL 20% Triton-X-opløsning til den første brønd af hver tumortype, der fungerer som en total død kontrol.
- Lad pladen stå i inkubatoren i 20 min. Afbild pladen ved hjælp af det fluorescerende billedcytometer. Data gemmes på computeren og kan analyseres på et senere tidspunkt.
5. Analyse af fluorescerende billeder
- Brug en af tumoren kun godt af celler til at indstille den grønne fluorescerende kanal.
- Reducer brøndmasken til 98% for at fjerne cellerne på kanten af brønden, da signalet ikke er perfekt på kanten.
- Identificer CFSE-mærkede tumorceller på den grønne, fluorescerende CFSE-kanal. Rediger tærskelværdien for fluorescensintensitet for at hente alle cellerne i brønden.
- Indstil den mindste cellediameter til 25 μm for at fjerne snavs, der registreres på CFSE-kanalen. Dette varierer afhængigt af den celletype, der analyseres.
- Aktivér separate berøringsobjekter for at identificere individuelle celler, når de er i kontakt med hinanden.
- Vælg CFSE på billeddisplayet, og se på grafisk overlay for at finde ud af, hvad systemet vælger.
- Når CFSE-mærkede celler bliver korrekt afhentet, skal du indstille porte til at definere levende vs døde cellepopulationer.
- Valg af CFSE-mærkede celler genererer et histogram af tællinger på y-aksen vs gennemsnitlig PI-intensitet på x-aksen.
- Baseret på brønden, hvor vi tilføjede Triton-X (trin 4.5), skal du tegne en splitter for at differentiere celler med lav PI-farvet vs høj PI-farve. Denne brønd skal have de fleste celler i et højt PI-farvet område.
BEMÆRK: PI viser basalsignal på levende celler. Derfor dræber tilsætning af Triton-X alle cellerne, og de pletter lyst i den røde fluorescerende kanal. Dette letter tegningsporten til at adskille døde celler fra levende celler. - Juster x-akseværdien for bedre at kunne se cellerne. Mærk nu de lave PI-farvede celler som levende celler.
- Hvis du vælger Live-cellerne, skal du indstille et andet histogram med areal på x-aksen og tæller på y-aksen.
- Tegn en anden splitter ved hjælp af tumor kun godt for at fange celler og ikke snavs. Jurkat-behandlede brønde begynder at akkumulere affald, der vil være CFSE-farvet og skal fjernes fra tællingerne. De resterende ikke-affald er mærket som "Store celler".
- Kør analysen på hele pladen, og eksporter regnearket, der indeholder tallene.
- Plot de store tællinger for at identificere antallet af levende CFSE-mærkede tumorceller, der er tilbage i brønden efter eksponering for CAR-J. Bestem statistik ved hjælp af envejs ANOVA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et interval af E:T-forhold mellem 1:8 og 8:1 for CAR-J1 blev evalueret ved 72 timer, som målrettede EGFR på TNBC MDA-MB-231-celler. Jurkat-celler blev transduceret med CAR-lentivirus med polybren for at generere CAR-J-celler som beskrevet i trin 2. Cytotoksiciteten af CAR-J1 steg signifikant med højere E:T-forhold uden forskel i drab i forholdet 1:8 (figur 1). Mere end 50% drab blev observeret ved 4: 1 E: T over 72 timer. Denne E:T blev anvendt til efterfølgende eksperimenter med varighed reduceret til 48 timer til hurtig cytotoksicitetsevaluering af flere CAR-konstruktioner. EGFR-målretningskonstruktioner til CAR-konstruktioner med hængseldomænet modificeret blev designet (tabel 1). De 4 forskellige anvendte hængsler er IgG lang, IgG medium, IgG kort og CD8a som beskrevet her13. Disse 3 konstruktioner blev udtrykt på Jurkat celler og CAR positivitet bestemt ved at evaluere procentdelen af Flag mærkede celler ved flowcytometri (figur 2A-D) som beskrevet her12. Utransducerede Jurkat-celler blev brugt som kontrolgruppe til at bestemme CAR-ekspression, og gating-strategien er vist i (figur 2E). Cytotoksiciteten af disse 4 CAR-konstruktioner udtrykt på Jurkat-celler blev evalueret mod EGFR, der udtrykte MDA-MB-231-celler og CRISPR EGFR KO MDA-MB-231-celler. Antigenspecifik aflivning blev observeret af alle konstruktionerne (figur 3A), mens der ikke blev observeret signifikant drab mod EGFR KO-celler (figur 3B), hvilket tyder på, at drab kun blev medieret specifikt gennem scFv. Der var ingen drab af de ikke-transducerede Jurkat celler. Repræsentative billeder af tumordrab vises også, hvor overlapningen af CFSE-mærkede tumorceller med PI-farvet død kerne får dem til at se gule ud (figur 4). Data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter med 6 tekniske replikater pr. Gruppe.
Dette blev yderligere bekræftet ved at udtrykke disse CAR-konstruktioner på PBMC-afledte CD3 T-celler. Der er lav ekspression af CAR på CD3 T-celler, som derefter beriges ved steril flowsortering (figur 5). Der var imidlertid ingen udtryk for CD8-hængsel indeholdende EGFR CAR. Derfor blev de andre 3 CAR-konstruktioner indeholdende IgG lang, IgG medium og IgG kort evalueret for deres cytotoksiske potentiale mod MDA-MB-231-celler. Der er en lignende tendens til at dræbe, hvor IgG kort har den mindst cytotoksiske styrke sammenlignet med de andre 2 konstruktioner (figur 6). For at identificere den bedste konstruktion blandt IgG lange og IgG mellemstore CAR-T-celler blev deres aktivering med og uden eksponering for TNBC-tumorceller evalueret ved intracellulær farvning af cytokiner som beskrevet tidligere12. MDA-MB-436 har lave niveauer af EGFR, og MDA-MB-468 har det højeste EGFR-proteinekspression baseret på en western blot med et panel på 13 TNBC-cellelinjer12. IgG lange CAR-T-celler havde de mindst basale aktiveringsniveauer (TNFa, 4-1BB) og lav frigivelse af cytotoksiske granulater (perforin og granzym B)14 uden eksponering for tumorceller (figur 7). Ved eksponering for høje EGFR-ekspressive MDA-MB-468-celler havde IgG lange CAR-T-celler den højeste aktivering baseret på TNFa og 4-1BB.
Figur 1: EGFR CAR-J1 cytotoksisk evaluering langs en række E:T. CFSE-mærkede MDA-MB-231 tumorceller blev belagt med ikke-transducerede Jurkat-celler eller EGFR rettet mod CAR-J1 i E: T-forholdet 1: 8, 1: 4, 1: 2, 1: 1, 2: 1, 4: 1 og 8: 1, hvilket viser stigende cytotoksicitet med højere effektorceller. Data er repræsenteret som gennemsnit ± SD, og statistisk signifikans blev evalueret ved hjælp af elevens t-test. 1:8 E:T var ikke-signifikant, 1:4 E:T havde ***p<0,001 og resten ****p<0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: EGFR CAR Jurkat produktion til in vitro cytotoksisk evaluering. (A-D) Næsten 90% -100% CAR udtryk af 4 forskellige konstruktioner CAR IgG lang, CAR IgG medium, CAR IgG kort, CAR CD8a. (E) Gating strategi for CAR positivitet bestemmelse: Vragrester udelukket i SSC-A vs FSC-A plot; Enkeltceller valgt i FSC-H vs FSC-A-plot; og levende celler udvalgt ved levedygtighedsfarvestof DAPI-negativ gating. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Cytotoksicitetsevaluering i co-kultur af CAR-J og CFSE-mærkede tumorceller. (A) CFSE-mærkede MDA MB 231-celler blev belagt med CAR-J i forholdet 4:1 E:T i 48 timer, hvilket viste varierende effekt ved tumorcelledrab. (B) CFSE-mærkede CRISPR EGFR KO MDA MB 231-celler blev ikke dræbt af nogen af CAR-J-cellerne. Data er repræsenteret som gennemsnit ± SD, og statistisk signifikans blev evalueret ved hjælp af envejs ANOVA. **p<0,01; s<0.0001; NS: Ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Visuel repræsentation af billeder efter 48 timers samkultur. (A) Kun tumorgruppe med CFSE (grøn) mærkede tumorceller. (B) Tilføjelse af ikke-transducerede Jurkat celler, hvor røde blodlegemer er de døde Jurkat celler og (C) overlay af grøn og rød, der indikerer døde tumorceller (gul) som vist med pile. Antallet af grønne celler, der ikke er gule, kvantificeres. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: EGFR CD3 CAR-T-celleberigelse. (A-B) CAR-ekspression evalueret ved at bestemme procentdelen af Flag-positive og IgG-positive celler før berigelse og (C) efter berigelse ved steril flowsortering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Cytotoksicitetsevaluering i co-kultur af CD3 CAR-T og CFSE mærkede tumorceller. CFSE-mærkede MDA MB 231-celler blev belagt med CAR-J ved 4: 1 E: T-forhold i 48 timer, hvilket viste varierende effekt ved tumorcelledrab. Data er repræsenteret som gennemsnit ± SD, og statistisk signifikans blev evalueret ved hjælp af envejs ANOVA. **p<0,01; s<0.0001; NS: Ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: EGFR CD3 CAR-T-celleaktivering. CAR-T-celler blev udsat for tumorceller og intracellulære cytokinniveauer for (A) TNFa, (B) 4-1BB, (C) perforin og (D) granzym B blev evalueret. Data er repræsenteret som gennemsnit ± SD, og statistisk signifikans blev evalueret ved hjælp af envejs ANOVA *p<0,05; **p<0,01; **p<0,001; s<0.0001; NS: Ikke signifikant. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Nej. af PA EGFR806 scFv | Vh-Vl Linker | Hængsel/afstandsstykke | TM | Cytoplasmatisk |
| BIL IgG Lang | Whitlow (18 aa) | IgG4 EQ CH2 CH3 (229 aa) | CD4 | 4-1BB / CD3z |
| CAR IgG Medium | Pinsetræ | IgG4 CH3 (129 aa) | CD28 | 4-1BB / CD3z |
| CAR IgG Kort | Pinsetræ | IgG kort (12 aa) | CD4 | 4-1BB / CD3z |
| BIL CD8a | Pinsetræ | CD8 (45 aa) | CD8a | 4-1BB / CD3z |
Tabel 1: CAR konstruere design. Forkortelser: aa = aminosyrer; TM = Transmembran.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| En | Triton-X | Kun MDA MB 231 | Triton-X | Kun MDA MB 231 EGFR KO | ||||||||
| B | MB231 + Mock 4:1 | MB231 EGFR KO + Mock 4:1 | ||||||||||
| C | MB231 + EGFR IgG Lang 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Lang 4:1 | ||||||||||
| D | MB231 + EGFR IgG Medium 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Medium 4:1 | ||||||||||
| E | MB231 + EGFR IgG Kort 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Kort 4:1 | ||||||||||
| F | MB231 + EGFR CD8a 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR CD8a 4:1 | ||||||||||
| G | ||||||||||||
| H | ||||||||||||
Tabel 2: Strategi for prøveplettering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi foreslået en hurtig metode til effektivt at evaluere den målspecifikke cytolytiske aktivitet induceret af CAR-ekspression i Jurkat-celler. Alle CAR-konstruktioner har samme scFv, men forskellige hængsel- og transmembrandomæner, som har vist sig at påvirke CAR-T-cellernes styrke13. Yderligere evaluering af ikke-specifik drab af disse CAR-J blev udført ved at dyrke dem med antigen knock out (KO) celler. Dette viser, at drabet er tumorantigenspecifikt og ikke skyldes basal aktivering af CAR-J. Cytotoksisk potentiale for en række E: T-forhold kan let bestemmes og identificere det mindste antal effektorceller, der kræves for at eliminere tumorceller på bestemte tidspunkter. Flere cellelinjer fra samme eller forskellige kræfttype og normale celler kan også bruges til at evaluere specificiteten af disse konstruktioner. De mest potente kandidater identificeret af CAR-J-platformen kan derefter yderligere karakteriseres ved at udtrykke CAR på PBMC-afledte CD3 T-celler og udføre lignende drabsanalyser og evaluere udmattelse og aktivering ved eksponering for antigenpositive og negative tumorceller.
Det skal bemærkes, at Jurkat-celler er CD4 + celler med en ændret T-cellereceptor (TCR) signalvej15. Derfor bør intracellulær signaldomæneoptimering af CAR-konstruktioner ideelt set udføres med CD3 T-celler16 og fungerer muligvis ikke bedst med Jurkat-celler. Interessant nok viser CD4 T-celler cytotoksicitet som demonstreret i en tidligere publikation, hvor EGFR målrettet mod CD4 CAR-T-celler med IgG langt hængsel er i stand til fuldstændigt at udrydde TNBC-tumorer i en intrakraniel tumormodel12. Derudover viser CD4 CAR T-celler langsigtet styrke og bedre drab sammenlignet med blanding af CD4- og CD8 T-celler eller CD8 T-celler alene i GBM-tumormodel, hvilket gør dem klinisk vigtige T-celler delmængde til effektiv CAR-T-terapi17.
Jurkat-celler producerer IL2 og opregulerer CD69 ved aktivering, selvom de ikke udskiller alle cytokinerne i primær T-celleaktivering 8,18. Imidlertid informerer evaluering af IL2- og CD69-niveauer om, at Jurkat-cellerne bliver aktiveret og ikke om den direkte cytolyse af målceller, der kvantificeres i absolutte tumorcellenumre ved denne tilgang. Imidlertid er evaluering af cytotoksicitet og aktivering vigtig for fuldt ud at forstå virkningerne af nye CAR-molekyler.
Varigheden af samkultur i dette eksperiment kan ændres baseret på de anvendte konstruktioner. CFSE-mærkning på tumorceller viste sig at kunne påvises indtil 4 dage efter plettering. For at opnå et højt signal / støjforhold blev eksperimenter derfor udført inden for 72 timer. Da CFSE-intensiteten falder ved deling af tumorceller, kan mængden af CFSE, der anvendes, og varigheden muligvis ændre sig i henhold til de anvendte tumorceller. Da dette er et eksperiment med høj kapacitet til at analysere flere konstruktioner ad gangen, skal såtætheden af målceller i en 96 brøndplade også optimeres. Målceller skal vedligeholdes, så de ikke vokser oversammenflydende eller har konkurrencemæssig vækstbegrænsning ved afslutningen af assayet uden behov for at skifte medie for at minimere enhver intervention. Større brøndplader kan bruges til at rumme flere celler og øge eksperimentets levetid. Billederne skal dog sys for at få et fuldstændigt billede af brønden, og hver brønd skal arbejdes på individuelt, hvilket muligvis ikke gør det hurtigt og højt gennemløb.
En anden tilgang til langsigtet fluorescerende mærkning tumorceller er ved lentiviral transduktion med grønt fluorescerende protein (GFP) eller rødt fluorescerende protein (RFP). Korrekt klonvalg skal udføres for at vælge højt berigede (næsten 100%) lyseste kolonier for det bedste signal / støjforhold. Levedygtighedsfarvestoffet skal vælges korrekt baseret på fluorescerende detektorer i billeddannelsesinstrumentet.
Baggrundsfluorescens afhænger af det anvendte medie og skal derfor kontrolleres for at undgå tab af signal, mens du tager billeder. Almindelige medier indeholder komponenter, der udsender betydelig fluorescens, når de er ophidsede. Det anbefales at bruge et lavt baggrundsmedie19. PBS kan bruges, men det kan påvirke cellerne under billedoptagelse, da det tager ca. 20 minutter at hente billeder afhængigt af de indstillinger, der er indstillet til optagelse af billeder.
En af begrænsningerne ved dette assay er ikke at være i stand til at tage billeder på flere tidspunkter af den samme 96 brøndplade efter tilsætning af et levedygtighedsfarvestof. Effekten af tilføjelse af PI over lang tid blev ikke evalueret i forbindelse med denne publikation. Det ville dog være ideelt at kunne detektere levende og døde / døende målceller over en periode ved hjælp af den samme plade. Det kan være svært at adskille individuelle celler, hvis cellerne bliver overflydende. Arealet af cellemonolag og fluorescensintensitet kan bruges til at sammenligne procent af levende / døde celler som beskrevet20.
Alternative metoder, der anvendes til påvisning af cytolyse med CAR-T-celler, måler ikke direkte det absolutte antal døde og levende celler, men vurderer snarere styrken ved indirekte metoder, som er beskrevet detaljeret andetsteds 4,5. Så denne metode giver en absolut redegørelse for effektorceller og kan også anvendes i co-kultur af 3 celletyper afhængigt af billeddannelsesinstrumentets kapacitet. Der kræves meget få celler (5000 pr. Brønd), som kan ændre sig sammen med friheden til at vælge et tidspunkt, hvilket er enorme fordele ved at bruge dette assay. Målceller i suspension og i 3-dimensionel sfærisk kultur kan også anvendes i kultur med effektorceller og cytolyse bestemt som beskrevet andetsteds21. Desuden kan denne platform bruges til at screene store biblioteker af små molekyler og forbindelser for at afgrænse de mest effektive molekyler, og flere doser kan udføres på flere tidspunkter.
Ud over systemets hastighed og fleksibilitet er den endelige fordel omkostningerne. Den fluorescerende billeddannelsesmaskine, plader og reagenser er alle almindelige og overkommelige at købe, især sammenlignet med enheder, der er mere sofistikerede og måske endda bruger ædle metaller i deres engangsplader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
MDA-MB-231 var en venlig gave fra Dr. Shane Stecklein. Forfatterne anerkender finansiering fra University of Kansas Cancer Center til at udføre denne forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Methods in Cell Biology. 167, Academic Press. 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D. Jr, Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis. , https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023).
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
