Summary
Ein Protokoll zur Bewertung der quantitativen Abtötung von Tumorzellen durch Jurkat-Zellen, die chimären Antigenrezeptor (CAR) exprimieren, der auf ein einzelnes Tumorantigen abzielt. Dieses Protokoll kann als Screening-Plattform für die schnelle Optimierung von CAR-Scharnierkonstrukten vor der Bestätigung in aus dem peripheren Blut gewonnenen T-Zellen verwendet werden.
Abstract
Chimäre Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen stehen an der Spitze der Onkologie. Ein CAR besteht aus einer Zieldomäne (in der Regel ein einzelnes kettenvariables Fragment, scFv) mit einem begleitenden Intra-Ketten-Linker, gefolgt von einem Scharnier, einer Transmembran und einer kostimulatorischen Domäne. Die Modifikation des Intra-Chain-Linkers und der Scharnierdomäne kann einen signifikanten Einfluss auf die CAR-vermittelte Tötung haben. In Anbetracht der vielen verschiedenen Optionen für jeden Teil eines CAR-Konstrukts gibt es eine große Anzahl von Permutationen. Die Herstellung von CAR-T-Zellen ist ein zeitaufwändiger und teurer Prozess, und die Herstellung und das Testen vieler Konstrukte ist eine hohe Zeit- und Materialinvestition. Dieses Protokoll beschreibt eine Plattform zur schnellen Evaluierung scharnieroptimierter CAR-Konstrukte in Jurkat-Zellen (CAR-J). Jurkat-Zellen sind eine immortalisierte T-Zelllinie mit hoher Lentivirus-Aufnahme, die eine effiziente CAR-Transduktion ermöglicht. Hier stellen wir eine Plattform zur schnellen Evaluierung von CAR-J mit einem Fluoreszenz-Imager vor, gefolgt von der Bestätigung der Zytolyse in PBMC-abgeleiteten T-Zellen.
Introduction
Die CAR-T-Zelltherapie hat sich bei hämatologischen Malignomen als vielversprechend erwiesen, wie die 6 von der FDA zugelassenen CAR-T-Produkte seit 2017 zeigen, wie das National Cancer Instituteberichtet 1. Es gibt zahlreiche CAR-T-Zellen in klinischen Studien zur Bekämpfung solider Tumore. Die Entwicklung neuartiger CAR-Targets und die Optimierung des CAR-Konstrukts sind entscheidend für die Wirksamkeit einer CAR-T-Zelle. Die Wahl des idealen CAR-Konstrukts für jede Anwendung ist entscheidend für ein genaues Targeting von tumorassoziierten Antigenen (TAA) bei gleichzeitiger Vermeidung einer niedrigen TAA-Expression in normalem Gewebe2.
Ein CAR-Konstrukt besteht hauptsächlich aus fünf Kompartimenten: (1) extrazelluläre einkettige variable Fragmente (scFv)-Domäne, die auf das Tumorantigen abzielt; (2) Scharnier-Domäne; (3) Transmembran-Domäne; (4) intrazelluläre zytoplasmatische T-Zell-komdimulatorische Domäne; und (5) Signalisierungsdomäne. Die Modifikation jeder dieser Domänen beeinflusst die Präzision der CAR-T-Zelle, die mit ihrer Zielzelle3 interagiert. Daher ist die Bewertung der Zytotoxizität und Kreuzreaktivität dieser CAR-Konstrukte in vitro entscheidend, um das richtige Konstrukt für In-vivo-Experimente auszuwählen. Zu den aktuellen Methoden zur Bewertung der Zytolyse durch T-Zellen gehören der 51-Cr-Freisetzungstest, der Laktatdehydrogenase-Freisetzungstest, der biolumineszierende Bildgebungstest, die impedanzbasierte Echtzeit-Zellanalyse und der zellbasierte Durchflusszytometrie-Assay 4,5. Die hier beschriebene auf Fluoreszenzbildgebung basierende Plattform identifiziert die Anzahl lebender vs. toter Zellen, was eine direkte Quantifizierung der T-Zell-Zytolyse im Gegensatz zu einer indirekten Methode zur Bewertung der Zytolyse durch T-Zellen darstellt.
Hier ist eine einfache, kosteneffiziente, schnelle und hochdurchsatztechnische Technik mit minimalen Eingriffen zur Bewertung der Zytotoxizität von Jurkat-Zellen, die den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) CAR exprimieren, gegen MDA-MB-231 triple-negative Brustkrebszellen (TNBC) und EGFR CRISPR knock-out MDA-MB-231-Zellen. Jurkat-Zellen sind immortalisierte menschliche T-Lymphozyten-Zellen6, die häufig für die Untersuchung von T-Zell-Aktivierungs- und Signalmechanismen verwendet werden7. Darüber hinaus wurden Jurkat-Zellen in mehreren Studien für In-vitro-CAR-Tests verwendet 8,9,10,11. Jurkat-Zellen werden leicht durch Lentiviren transduziert und weisen eine anhaltende Proliferation auf, und dieses System wurde genutzt, um die Scharnierdomäne verschiedener EGFR-CAR-Konstrukte zu optimieren.
Dieser Assay kann für das Screening mehrerer CAR-Konstrukte verwendet werden, die auf verschiedene Tumorantigene abzielen und gegen mehrere adhärente Tumorzelllinien und in verschiedenen Effektor-zu-Tumor-Verhältnissen (E:T) verwendet werden. Darüber hinaus können mehrere Zeitpunkte ausgewertet und die Anzahl der Replikate geändert werden, um die beste Tötung unter den verschiedenen CAR-Konstrukten zu identifizieren. Die besten Konstrukte müssen mit CD3-T-Zellen aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) bestätigt werden. Das übergeordnete Ziel hinter der Entwicklung dieser Methode ist es, die CAR-Scharniergeometrie schnell und mit hohem Durchsatz zu optimieren, um Barrieren wie eine geringe Transduktionseffizienz zu überwinden, gefolgt von einer Bestätigung in PBMC-abgeleiteten T-Zellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Alle Zellkulturarbeiten werden in einer Biosicherheitswerkbank mit Laborkittel, Handschuhen und unter Einhaltung der aseptischen Standardtechniken durchgeführt.
1. Generierung von CAR, das Jurkats (CAR-J) exprimiert
- Kaufen Sie Jurkat-Zellen, Klon E6-1 von ATCC. 1 x 106 Zellen in einem T-75-Kolben auftauen und in T-75-Kolben kultivieren. Halten Sie sie in Suspension bei 0,6 x 106 Zellen pro ml unter Verwendung von Medien des Roswell Park Memorial Institute (RPMI), die mit 10 % FBS angereichert sind, in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2.
- Platte 1 x 105 Jurkat-Zellen pro Well einer mit Gewebekultur behandelten 24-Well-Platte in 500 μl RPMI-Wachstumsmedien mit 4 μg/ml Polybrene, das die lentivirale Effizienz verbessert. Zählen Sie Zellen mit einem laserbasierten Tischzellanalysator mit Fluoreszenzdetektion. Die Anzahl der Wells hängt von der Anzahl der zu bewertenden Konstrukte ab. In diesem Beispiel werden 4 Konstrukte und ein nicht transduziertes Steuerelement verwendet. Der Entwurf des CAR-Konstrukts ist in Tabelle 1 dargestellt.
- Fügen Sie 10 μl Lentivirus/Wells von jedem CAR-Konstrukt hinzu. Das Design des CAR-Konstrukts und die Lentivirus-Produktion erfolgten wie zuvor beschrieben12.
- Geben Sie am nächsten Tag 1 ml RPMI-Wachstumsmedium in jede Vertiefung und setzen Sie die Kultivierung im Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 fort.
- Entnehmen Sie die Zellen 2 Tage später (insgesamt 72 Stunden nach der Jurkat-Transduktion) und zählen Sie sie.
- Entnehmen Sie 1 x 104 Zellen, um die CAR-Expression auf den Jurkat-Zellen zu bestätigen. Kurz gewaschen werden die Zellen 2x mit FACS-Färbelösung (FSS), bevor Sie das CAR-J mit Antikörpern markieren, die auf den Flag-Tag abzielen, der zum Nachweis der CAR-Positivität verwendet wird, 30 Minuten lang im Dunkeln bei 4 °C. Waschen Sie die Zellen erneut 2x mit FSS und lassen Sie die Zellen wie zuvor beschrieben durch ein Durchflusszytometer laufen12. Verwenden Sie die vom Hersteller empfohlene Antikörperkonzentration.
- Jurkat-Zellen sind leicht transduziert und zeigen fast immer eine CAR-Expression von >90%. Produzieren Sie CAR-J lange vor dem Zytotoxizitätstest in der Co-Kultur und frieren Sie es für die spätere Verwendung ein.
2. Beschichtung von CFSE-markierten Tumorzellen
ANMERKUNG: MDA-MB-231 (von ATCC, HTB-26) Zellen waren ein Geschenk eines Mitarbeiters, und EGFR KO MDA-MB-231 wurde wie zuvor beschriebenhergestellt 12.
- 1 x 106 Zellen in einem T-75-Kolben auftauen und in T-75-Kolben kultivieren. MDA-MB-231-Tumorzellen und CRISPR-EGFR-KO-MDA-MB-231-Tumorzellen werden in 14 ml modifiziertem Adlermedium (DMEM) von Dulbecco, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS), in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 aufbewahrt und bei etwa 70 % Konfluenz gespalten.
- Beobachten Sie adhärente Tumorzellen unter dem normalen Hellfeldmikroskop, um eine Konfluenz von fast 70 % sicherzustellen.
- Nährmedien mit einer serologischen Pipette aus dem Kolben entfernen. 3 ml Trypsin in den T75-Kolben geben und 3-5 Minuten lang bei 37 °C mit 5 %CO2 in einen Inkubator geben, um die Zellen aus dem Kolben zu lösen.
- Neutralisieren Sie das Trypsin mit der gleichen Menge (3 ml) Wachstumsmedien. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem Zentrifugenröhrchen und schleudern Sie die Zellen 4 Minuten lang bei 400 x g herunter, um die Zellen zu pelletieren.
- Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Bestimmen Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzähler.
- Überführen Sie 8 x 105 Zellen in ein weiteres 15-ml-Röhrchen und fügen Sie PBS hinzu, um ein Volumen von 1 ml zu erreichen.
- Geben Sie 2 μl Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE; 5 μM Stammkonzentration) in jedes Röhrchen und mischen Sie es mit einer 1-ml-Pipette gut durch.
- Inkubieren Sie die Zellen mit CFSE für 20 min im Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2. Nehmen Sie die Röhrchen nach 20 Minuten aus dem Inkubator und geben Sie 5 ml Wachstumsmedien in das Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 x g für 4 Minuten, um die CFSE-markierten Zellen zu pelletieren. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette und fügen Sie 1 ml frisches Medium hinzu, um die Zellen zu resuspendieren.
- Bewerten Sie die Zellkonzentration mit einem Zellzähler neu. 4 x 105 Zellen in ein 25-ml-Reagenzreservoir überführen und Medien für ein Gesamtvolumen von 8 ml hinzufügen.
- Um ein ausreichendes Volumen für die Aussaat von 5000 Tumorzellen/Wells in 100 μl Medien zu gewährleisten, muss das Volumen mit der Mehrkanalpipette pipetiert werden können, und um den Verlust einiger Zellen in Schritt 1.7 zu kompensieren, bereiten Sie 10 % bis 20 % zusätzliches Zell- und Medienvolumen vor.
- Mischen Sie die Zellsuspension gründlich mit einer serologischen Pipette von 5 ml. Pipettieren Sie mit einer 100-μl-Mehrkanalpipette 100 μl der Zellsuspension in jede Reihe der durchsichtigen, flachen schwarzen 96-Well-Platte auf der linken Hälfte. Ein Beispiel für eine Beschichtungsstrategie ist in Tabelle 2 zu finden.
- Piprimieren Sie EGFR KO-Zellen auf die rechte Hälfte der Platte. Sobald die gesamte Platte plattiert ist, ziehen Sie die Platte auf der Plattform der Gewebekulturhaube hin und her und von einer Seite zur anderen, um eine gleichmäßige Verteilung der Tumorzellen in den Vertiefungen zu gewährleisten.
- Inkubieren Sie die Platte für 4 h im Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2 , damit sich die Tumorzellen anheften können.
3. Co-Kultivierung von CAR, die Jurkats exprimieren, mit CFSE-markierten Tumorzellen
- Unter Verwendung der Anzahl der nicht transduzierten und CAR-exprimierenden Jurkat-Zellen werden 4 x 105 Zellen jedes CAR-J in ein 25-ml-Reservoir überführt. Fügen Sie DMEM-Wachstumsmedien hinzu, um ein Gesamtvolumen von 2 ml zu erhalten.
- Für E:T von 4:1 wurden 2 x 104 CAR-J pro Vertiefung in 100 μl Medien unter Verwendung einer Mehrkanalpipette vorsichtig an der Seite jedes Wells entlang zugegeben, um die anhaftenden Tumorzellen nicht zu stören.
- Geben Sie weitere 100 μl Wachstumsmedien mit einer Mehrkanalpipette an die Seite von Wells, die Tumorzellen und Jurkat-Zellen enthalten. Die reinen Tumorgruppen erhalten 200 μl Medien, so dass insgesamt 300 μl Medien in allen Wells vorhanden sind.
- Ziehen Sie die Platte entlang der Plattform in Hin- und Her- und Seitwärtsbewegungen, um eine gleichmäßige Verteilung der Jurkat-Zellen auf den Tumorzellen zu gewährleisten.
- Die Co-Kultur im Inkubator bei 37 °C mit 5 %CO2 für 48 h zulassen.
4. Vorbereitung der Platte für die Bildgebung
- Stellen Sie eine Lösung von Propidiumiodid (PI) mit 1 μg/ml in Medien mit niedriger Hintergrundfluoreszenz her, basierend auf der Anzahl der Vertiefungen und erhalten Sie jeweils 100 μl Medien.
- Für 84 Vertiefungen 9 ml PI-haltige Medien vorbereiten. Mischen Sie das Medium gründlich mit einer Pipette.
- Stellen Sie 10 ml 20%ige Triton-X-Lösung her, indem Sie Triton-X mit deionisiertem Wasser verdünnen. Nach 48 Stunden Kokultur wird der CAR-J-haltige Überstand durch eine einmalige Inversion der Platte und Klopfen auf Papiertuch entsorgt.
- Geben Sie nun 100 μl des oben vorbereiteten PI-haltigen Mediums (Schritt 4.2) mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig in jede Vertiefung, um die anhaftenden Tumorzellen nicht zu stören.
- Geben Sie 20 μl 20%ige Triton-X-Lösung in die erste Vertiefung jedes Tumortyps, die als totale Totkontrolle fungiert.
- Lassen Sie die Platte 20 Minuten im Inkubator. Bilden Sie die Platte mit dem Fluoreszenz-Imaging-Zytometer ab. Die Daten werden auf dem Computer gespeichert und können zu einem späteren Zeitpunkt analysiert werden.
5. Analyse von Fluoreszenzbildern
- Verwenden Sie eine der Tumorzellen, um den grün fluoreszierenden Kanal einzustellen.
- Verkleinern Sie die Well-Maske auf 98%, um die Zellen am Rand des Wells zu entfernen, da das Signal am Rand nicht perfekt ist.
- Identifizierung von CFSE-markierten Tumorzellen auf dem grünen, fluoreszierenden CFSE-Kanal. Ändern Sie den Schwellenwert für die Fluoreszenzintensität, um alle Zellen im Well aufzunehmen.
- Stellen Sie den minimalen Zelldurchmesser auf 25 μm ein, um alle auf dem CFSE-Kanal erkannten Ablagerungen zu entfernen. Dies variiert je nach Zelltyp, der analysiert wird.
- Aktivieren Sie "Separate sich berührende Objekte ", um einzelne Zellen zu identifizieren, wenn sie miteinander in Kontakt stehen.
- Wählen Sie CFSE auf der Bildanzeige aus und sehen Sie sich das grafische Overlay an, um herauszufinden, was vom System ausgewählt wird.
- Sobald CFSE-markierte Zellen ordnungsgemäß erfasst werden, setzen Sie Gatter, um die Population lebender und toter Zellen zu definieren.
- Wählen Sie die CFSE-markierten Zellen aus und generieren Sie ein Histogramm der Anzahl auf der y-Achse im Vergleich zur mittleren PI-Intensität auf der x-Achse.
- Basierend auf der Vertiefung, in der wir Triton-X hinzugefügt haben (Schritt 4.5), zeichnen Sie einen Splitter, um niedrig PI-gefärbte und hoch PI-gefärbte Zellen zu unterscheiden. In dieser Vertiefung sollten sich die meisten Zellen in einer stark PI-gefärbten Region befinden.
HINWEIS: PI zeigt ein basales Signal auf lebenden Zellen. Daher tötet die Zugabe von Triton-X alle Zellen ab und sie färben sich hell im roten Fluoreszenzkanal. Dies erleichtert das Ziehen von Toren, um tote Zellen von lebenden Zellen zu trennen. - Passen Sie den Wert der X-Achse an, um die Zellen besser anzeigen zu können. Markieren Sie nun die niedrig PI-gefärbten Zellen als Lebendzellen.
- Wählen Sie die Live-Zellen aus, und legen Sie ein weiteres Histogramm mit Fläche auf der X-Achse und Zählungen auf der Y-Achse fest.
- Zeichnen Sie einen weiteren Splitter, indem Sie nur den Tumor verwenden, um Zellen und keine Trümmer einzufangen. In den mit Jurkat behandelten Brunnen sammeln sich Trümmer an, die CFSE-gefärbt sind und aus den Zählungen entfernt werden müssen. Die verbleibenden Nicht-Trümmer werden als "Big Cells" bezeichnet.
- Führen Sie die Analyse für die gesamte Platte durch und exportieren Sie die Tabelle mit den Zahlen.
- Tragen Sie die Big-Zählungen auf, um die Anzahl der lebenden CFSE-markierten Tumorzellen zu identifizieren, die nach der Exposition gegenüber CAR-J im Well verbleiben. Ermitteln Sie Statistiken mithilfe der unidirektionalen ANOVA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ein Bereich des E:T-Verhältnisses zwischen 1:8 und 8:1 für CAR-J1 wurde nach 72 Stunden untersucht, der auf EGFR auf TNBC MDA-MB-231-Zellen abzielte. Jurkat-Zellen wurden mit CAR-Lentivirus mit Polybrene transduziert, um CAR-J-Zellen zu erzeugen, wie in Schritt 2 beschrieben. Die Zytotoxizität von CAR-J1 nahm mit höherem E:T-Verhältnis signifikant zu, ohne dass sich die Abtötung im Verhältnis 1:8 unterschied (Abbildung 1). Mehr als 50% Tötung wurde bei 4:1 E:T über 72 h beobachtet. Dieses E:T wurde für nachfolgende Experimente verwendet, wobei die Dauer auf 48 h reduziert wurde, um die Zytotoxizität mehrerer CAR-Konstrukte schnell zu bewerten. EGFR-Targeting-CAR-Konstrukte mit modifizierter Scharnierdomäne wurden entworfen (Tabelle 1). Die 4 verschiedenen Scharniere, die verwendet werden, sind IgG lang, IgG mittel, IgG kurz und CD8a, wie hier beschrieben13. Diese 3 Konstrukte wurden auf Jurkat-Zellen exprimiert und die CAR-Positivität wurde durch die Auswertung des Prozentsatzes der Flag-markierten Zellen mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 2A-D) bestimmt, wie hier beschrieben12. Untransduzierte Jurkat-Zellen wurden als Kontrollgruppe verwendet, um die CAR-Expression zu bestimmen, und die Gating-Strategie ist in (Abbildung 2E) dargestellt. Die Zytotoxizität dieser 4 CAR-Konstrukte, die auf Jurkat-Zellen exprimiert wurden, wurde gegen EGFR-exprimierende MDA-MB-231-Zellen und CRISPR EGFR-KO-MDA-MB-231-Zellen untersucht. Eine antigenspezifische Abtötung wurde von allen Konstrukten beobachtet (Abbildung 3A), während keine signifikante Abtötung gegen EGFR-KO-Zellen beobachtet wurde (Abbildung 3B), was darauf hindeutet, dass die Abtötung spezifisch nur durch das scFv vermittelt wurde. Es gab keine Tötung durch die nicht transduzierten Jurkat-Zellen. Es werden auch repräsentative Bilder der Tumorabtötung gezeigt, bei denen die Überlappung von CFSE-markierten Tumorzellen mit PI-gefärbtem toten Zellkern diese gelb erscheinen lässt (Abbildung 4). Die Daten sind repräsentativ für 3 unabhängige Experimente mit 6 technischen Replikaten pro Gruppe.
Dies wurde durch die Expression dieser CAR-Konstrukte auf PBMC-abgeleiteten CD3-T-Zellen weiter bestätigt. Es gibt eine geringe Expression von CAR auf CD3-T-Zellen, die dann durch Sterilflusssortierung angereichert werden (Abbildung 5). Es gab jedoch keine Expression eines CD8-Scharniers, das EGFR CAR enthielt. Daher wurden die anderen 3 CAR-Konstrukte, die IgG-lang, IgG-Medium und IgG-kurz enthalten, auf ihr zytotoxisches Potenzial gegen MDA-MB-231-Zellen untersucht. Es gibt einen ähnlichen Trend der Abtötung, wobei IgG short im Vergleich zu den anderen 2 Konstrukten die geringste zytotoxische Potenz aufweist (Abbildung 6). Um das beste Konstrukt zwischen langen IgG- und IgG-mittleren CAR-T-Zellen zu identifizieren, wurde ihre Aktivierung mit und ohne Exposition gegenüber TNBC-Tumorzellen durch intrazelluläre Färbung von Zytokinen untersucht, wie zuvor beschrieben12. MDA-MB-436 weist niedrige EGFR-Spiegel auf und MDA-MB-468 weist die höchste EGFR-Proteinexpression auf, basierend auf einem Western Blot mit einem Panel von 13 TNBC-Zelllinien12. IgG-Zellen mit langen CAR-T-Zellen wiesen die geringsten basalen Aktivierungsniveaus (TNFa, 4-1BB) und eine geringe Freisetzung von zytotoxischen Granula (Perforin und Granzym B)14 auf, ohne dass sie Tumorzellen ausgesetzt waren (Abbildung 7). Nach Exposition bei MDA-MB-468-Zellen mit hoher EGFR-Expression wiesen IgG-Zellen mit langer CAR-T-Expression die höchste Aktivierung auf Basis von TNFa und 4-1BB auf.
Abbildung 1: Zytotoxische Bewertung des EGFR CAR-J1 entlang eines E:T-Bereichs. CFSE-markierte MDA-MB-231-Tumorzellen wurden mit nicht transduzierten Jurkat-Zellen oder EGFR-gerichteten CAR-J1-Zellen in einem E:T-Verhältnis von 1:8, 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 und 8:1 plattiert, wobei eine zunehmende Zytotoxizität mit höheren Effektorzellen gezeigt wurde. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt und die statistische Signifikanz wurde mit dem Student's t-Test bewertet. 1:8 E:T war nicht signifikant, 1:4 E:T hatte ***p<0,001 und Rest ****p<0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: EGFR CAR Jurkat Produktion für die zytotoxische In-vitro-Bewertung . (A-D) Nahezu 90%-100% CAR-Expression von 4 verschiedenen Konstrukten: CAR IgG lang, CAR IgG mittel, CAR IgG kurz, CAR CD8a. (E) Gating-Strategie für die Bestimmung der CAR-Positivität: Trümmer, die im SSC-A- vs. FSC-A-Diagramm ausgeschlossen sind; Einzelne Zellen, die im FSC-H vs. FSC-A-Diagramm ausgewählt wurden; und lebende Zellen, die durch DAPI-negatives Gating des Viabilitätsfarbstoffs ausgewählt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bewertung der Zytotoxizität in Co-Kultur von CAR-J- und CFSE-markierten Tumorzellen. (A) CFSE-markierte MDA MB 231-Zellen wurden 48 Stunden lang mit CAR-J im Verhältnis 4:1 E:T plattiert, was eine unterschiedliche Wirksamkeit bei der Abtötung von Tumorzellen zeigte. (B) CFSE-markierte CRISPR EGFR KO MDA MB 231-Zellen wurden von keiner der CAR-J-Zellen abgetötet. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt und die statistische Signifikanz wurde mit Hilfe der unidirektionalen ANOVA ausgewertet. **p<0,01; S<0,0001; NS: Nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Visuelle Darstellung der Bilder nach 48 h Co-Kultur. (A) Tumorgruppe nur mit CFSE-markierten Tumorzellen (grün). (B) Zugabe von nicht transduzierten Jurkat-Zellen, wobei rote Blutkörperchen die toten Jurkat-Zellen sind, und (C) Überlagerung von Grün und Rot, was auf tote Tumorzellen (gelb) hinweist, wie durch Pfeile dargestellt. Die Anzahl der grünen Zellen, die nicht gelb sind, wird quantifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Anreicherung von EGFR CD3 CAR-T-Zellen. (A-B) CAR-Expression, bewertet durch Bestimmung des Prozentsatzes der Flag-positiven und IgG-positiven Zellen vor der Anreicherung und (C) nach der Anreicherung durch Sterilflusssortierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Zytotoxizitätsbewertung in Kokultur von CD3 CAR-T und CFSE-markierten Tumorzellen. CFSE-markierte MDA MB 231 Zellen wurden 48 Stunden lang mit CAR-J im Verhältnis 4:1 E:T plattiert, was eine unterschiedliche Wirksamkeit bei der Abtötung von Tumorzellen zeigte. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt und die statistische Signifikanz wurde mit Hilfe der unidirektionalen ANOVA ausgewertet. **p<0,01; S<0,0001; NS: Nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: EGFR CD3 CAR-T-Zellaktivierung. CAR-T-Zellen wurden Tumorzellen ausgesetzt und die intrazellulären Zytokinspiegel für (A) TNFa, (B) 4-1BB, (C) Perforin und (D) Granzym B wurden untersucht. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt und die statistische Signifikanz wurde mit einer unidirektionalen ANOVA *p<0,05 bewertet; **p<0,01; **p<0,001; S<0,0001; NS: Nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Nein. von PA EGFR806 scFv | Vh-Vl Linker | Scharnier/Abstandshalter | TM | Zellplasmatisches |
| CAR IgG Lang | Whitlow (18 aa) | IgG4 EQ CH2 CH3 (229 aa) | CD4-KARTON | 4-1BB / CD3z |
| CAR-IgG-Mittel | Umlauf | IgG4 CH3 (129 aa) | CD28-KARTON | 4-1BB / CD3z |
| CAR IgG Kurz | Umlauf | IgG kurz (12 aa) | CD4-KARTON | 4-1BB / CD3z |
| AUTO CD8a | Umlauf | CD8 (45 aa) | CD8a | 4-1BB / CD3z |
Tabelle 1: CAR-Konstrukte. Abkürzungen: aa = Aminosäuren; TM = Transmembran.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Ein | Triton-X | Nur MDA MB 231 | Triton-X | MDA MB 231 nur EGFR KO | ||||||||
| B | MB231 + Mock 4:1 | MB231 EGFR KO + Mock 4:1 | ||||||||||
| C | MB231 + EGFR IgG Lang 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Lang 4:1 | ||||||||||
| D | MB231 + EGFR IgG Medium 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Medium 4:1 | ||||||||||
| E | MB231 + EGFR IgG Kurz 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Kurz 4:1 | ||||||||||
| F | MB231 + EGFR CD8a 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR CD8a 4:1 | ||||||||||
| G | ||||||||||||
| H | ||||||||||||
Tabelle 2: Beispiel-Beschichtungsstrategie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier haben wir eine schnelle Methode vorgeschlagen, um die zielspezifische zytolytische Aktivität, die durch die CAR-Expression in Jurkat-Zellen induziert wird, effizient zu bewerten. Alle CAR-Konstrukte haben das gleiche scFv, aber unterschiedliche Scharnier- und Transmembrandomänen, von denen gezeigt wurde, dass sie die Potenz von CAR-T-Zellen beeinflussen13. Eine weitere Evaluierung der unspezifischen Abtötung durch diese CAR-J erfolgte durch Kultivierung mit Antigen-Knock-out-Zellen (KO). Dies zeigt, dass die Abtötung tumorantigenspezifisch ist und nicht auf eine basale Aktivierung durch das CAR-J zurückzuführen ist. Das zytotoxische Potenzial einer Reihe von E:T-Verhältnissen kann leicht bestimmt werden, indem die geringste Anzahl von Effektorzellen identifiziert wird, die für die Eliminierung von Tumorzellen zu bestimmten Zeitpunkten erforderlich sind. Mehrere Zelllinien von gleichen oder unterschiedlichen Krebsarten und normalen Zellen können ebenfalls verwendet werden, um die Spezifität dieser Konstrukte zu bewerten. Die wirksamsten Kandidaten, die von der CAR-J-Plattform identifiziert wurden, können dann weiter charakterisiert werden, indem CAR auf PBMC-abgeleiteten CD3-T-Zellen exprimiert und ähnliche Abtötungsassays durchgeführt und die Erschöpfung und Aktivierung bei Exposition gegenüber Antigen-positiven und -negativen Tumorzellen bewertet werden.
Es ist zu beachten, dass es sich bei Jurkat-Zellen um CD4+-Zellen mit einem veränderten T-Zell-Rezeptor (TCR)-Signalweghandelt 15. Daher sollte die intrazelluläre Signaldomänenoptimierung von CAR-Konstrukten idealerweise mit CD3-T-Zellendurchgeführt werden 16 und funktioniert möglicherweise nicht am besten mit Jurkat-Zellen. Interessanterweise zeigen CD4-T-Zellen Zytotoxizität, wie in einer früheren Veröffentlichung gezeigt wurde, in der EGFR, die auf CD4-CAR-T-Zellen mit IgG-Langscharnier abzielen, in der Lage sind, TNBC-Tumore in einem intrakraniellen Tumormodell vollständig zu eliminieren12. Darüber hinaus zeigen CD4-CAR-T-Zellen im Vergleich zu einer Mischung aus CD4- und CD8-T-Zellen oder CD8-T-Zellen allein im GBM-Tumormodell eine langfristige Wirksamkeit und eine bessere Abtötung, was sie zu einer klinisch wichtigen T-Zell-Untergruppe für eine wirksame CAR-T-Therapie macht17.
Jurkat-Zellen produzieren IL2 und regulieren CD69 bei Aktivierung hoch, obwohl sie nicht alle Zytokine der primären T-Zell-Aktivierung sezernieren 8,18. Die Auswertung der IL2- und CD69-Konzentrationen gibt jedoch Aufschluss über die Aktivierung der Jurkat-Zellen und nicht über die direkte Zytolyse der Zielzellen, die mit diesem Ansatz in absoluten Tumorzellzahlen quantifiziert werden. Die Bewertung der Zytotoxizität und Aktivierung ist jedoch wichtig, um die Auswirkungen neuartiger CAR-Moleküle vollständig zu verstehen.
Die Dauer der Co-Kultur in diesem Experiment kann basierend auf den verwendeten Konstrukten modifiziert werden. Es wurde festgestellt, dass die CFSE-Markierung auf Tumorzellen bis 4 Tage nach der Plattierung nachweisbar ist. Um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen, wurden daher Experimente innerhalb von 72 h durchgeführt. Da die CFSE-Intensität bei der Teilung der Tumorzellen abnimmt, müssen die Menge des verwendeten CFSE und die Dauer je nach den verwendeten Tumorzellen möglicherweise geändert werden. Da es sich um ein Hochdurchsatzexperiment handelt, bei dem mehrere Konstrukte gleichzeitig analysiert werden, muss auch die Seeding-Dichte der Zielzellen in einer 96-Well-Platte optimiert werden. Die Zielzellen müssen so gepflegt werden, dass sie am Ende des Assays nicht überkonfluent wachsen oder eine kompetitive Wachstumsbeschränkung aufweisen, ohne dass das Medium gewechselt werden muss, um Eingriffe zu minimieren. Größere Well-Platten können verwendet werden, um mehr Zellen unterzubringen und die Langlebigkeit des Experiments zu erhöhen. Die Bilder müssen jedoch zusammengefügt werden, um ein vollständiges Bild des Bohrlochs zu erhalten, und jedes Bohrloch muss einzeln bearbeitet werden, was möglicherweise nicht zu einem schnellen und hohen Durchsatz führt.
Ein weiterer Ansatz der Langzeit-Fluoreszenzmarkierung von Tumorzellen ist die lentivirale Transduktion mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder rot fluoreszierendem Protein (RFP). Die richtige klonale Selektion muss durchgeführt werden, um die stark angereicherten (fast 100%) hellsten Kolonien für das beste Signal-Rausch-Verhältnis auszuwählen. Der Viabilitätsfarbstoff muss auf der Grundlage der Fluoreszenzdetektoren im bildgebenden Instrument entsprechend ausgewählt werden.
Die Hintergrundfluoreszenz hängt vom verwendeten Medium ab und muss daher überprüft werden, um Signalverluste bei der Bildaufnahme zu vermeiden. Normale Medien enthalten Komponenten, die bei Anregung eine signifikante Fluoreszenz emittieren. Es wird empfohlen, ein niedriges Hintergrundmedium19 zu verwenden. PBS kann verwendet werden, kann sich jedoch während der Bildaufnahme auf die Zellen auswirken, da die Aufnahme von Bildern je nach den Einstellungen für die Bildaufnahme etwa 20 Minuten dauert.
Eine der Einschränkungen dieses Assays besteht darin, dass nach der Zugabe eines Viabilitätsfarbstoffs keine Bilder zu mehreren Zeitpunkten derselben 96-Well-Platte aufgenommen werden können. Der Effekt der Zugabe von PI über einen längeren Zeitraum wurde für diese Veröffentlichung nicht untersucht. Ideal wäre es jedoch, lebende und tote/sterbende Zielzellen über einen bestimmten Zeitraum mit derselben Platte nachweisen zu können. Es kann schwierig sein, einzelne Zellen zu trennen, wenn die Zellen überkonfluent werden. Die Fläche der Zellmonoschicht und die Fluoreszenzintensität können verwendet werden, um den Prozentsatz der lebenden/toten Zellen wie beschriebenzu vergleichen 20.
Alternative Methoden zum Nachweis der Zytolyse durch CAR-T-Zellen messen nicht direkt die absolute Anzahl toter und lebender Zellen, sondern bewerten die Wirksamkeit mit indirekten Methoden, die an anderer Stelle ausführlich beschrieben werden 4,5. Diese Methode liefert also eine absolute Darstellung von Effektorzellen und kann je nach Kapazität des bildgebenden Instruments auch in der Co-Kultur von 3 Zelltypen verwendet werden. Es sind nur sehr wenige Zellen erforderlich (5000 pro Well), die sich zusammen mit der Freiheit, einen Zeitpunkt zu wählen, ändern können, was enorme Vorteile der Verwendung dieses Assays sind. Zielzellen in Suspension und in 3-dimensionaler Sphäroidkultur können auch in Kultur mit Effektorzellen und Zytolyse bestimmt werden, wie an anderer Stelle beschrieben21. Darüber hinaus kann diese Plattform verwendet werden, um große Bibliotheken kleiner Moleküle und Verbindungen zu screenen, um die effektivsten Moleküle abzugrenzen, und es kann zu mehreren Zeitpunkten eine Mehrfachdosierung erfolgen.
Neben der Geschwindigkeit und der Flexibilität des Systems sind die Kosten der letztendliche Vorteil. Das Fluoreszenz-Bildgebungsgerät, die Platten und die Reagenzien sind alle üblich und erschwinglich in der Anschaffung, insbesondere im Vergleich zu Geräten, die anspruchsvoller sind und möglicherweise sogar Edelmetalle in ihren Einwegplatten verwenden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
MDA-MB-231 waren ein freundliches Geschenk von Dr. Shane Stecklein. Die Autoren danken dem University of Kansas Cancer Center für die Durchführung dieser Forschung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Methods in Cell Biology. 167, Academic Press. 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D. Jr, Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis. , https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023).
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
