Summary
En protokoll for å evaluere kvantitativ tumorcelledrap av Jurkat-celler som uttrykker kimær antigenreseptor (CAR) rettet mot enkelttumorantigen. Denne protokollen kan brukes som en screeningplattform for rask optimalisering av CAR-hengselkonstruksjoner før bekreftelse i perifere blodavledede T-celler.
Abstract
Chimeric antigen receptor (CAR) T-celler er i forkant av onkologi. En CAR er konstruert av et målrettingsdomene (vanligvis et enkelt kjedevariabelfragment, scFv), med en tilhørende intrakjedekobling, etterfulgt av et hengsel, transmembran og kostimulerende domene. Modifikasjon av intra-chain linker og hengseldomene kan ha en betydelig effekt på CAR-mediert drap. Tatt i betraktning de mange forskjellige alternativene for hver del av en CAR-konstruksjon, er det et stort antall permutasjoner. Å lage CAR-T-celler er en tidkrevende og kostbar prosess, og å lage og teste mange konstruksjoner er en tung tids- og materialinvestering. Denne protokollen beskriver en plattform for raskt å evaluere hengseloptimaliserte CAR-konstruksjoner i Jurkat-celler (CAR-J). Jurkat-celler er en udødeliggjort T-cellelinje med høyt lentivirusopptak, noe som muliggjør effektiv CAR-transduksjon. Her presenterer vi en plattform for rask evaluering av CAR-J ved hjelp av et fluorescerende bildeapparat, etterfulgt av bekreftelse av cytolyse i PBMC-avledede T-celler.
Introduction
CAR-T-celleterapi har vist stort løfte om hematologiske maligniteter, tydelig fra de 6 FDA-godkjente CAR-T-produktene siden 2017, som rapportert av National Cancer Institute1. Det er mange CAR-T-celler i kliniske studier for å målrette solide svulster. Utvikling av nye CAR-mål og optimalisering av CAR-konstruksjonen er avgjørende for effektiviteten til en CAR-T-celle. Å velge den ideelle CAR-konstruksjonen for hver applikasjon er avgjørende for nøyaktig målretting av tumorassosierte antigener (TAA), samtidig som man unngår lave nivåer av TAA-uttrykk i normalt vev2.
En CAR-konstruksjon er hovedsakelig laget av fem rom: (1) ekstracellulært enkeltkjede variabelt fragment (scFv) domene rettet mot tumorantigen; (2) hengsel domene; (3) transmembran domene; (4) intracellulært cytoplasmatisk T-celle costimulatorisk domene; og (5) signaldomene. Endring av hvert av disse domenene påvirker presisjonen til CAR-T-cellen som engasjerer seg i målcellen3. Derfor er evaluering av cytotoksisiteten og kryssreaktiviteten til disse CAR-konstruksjonene in vitro avgjørende for å velge riktig konstruksjon for å komme videre mot in vivo-eksperimenter. Nåværende metoder for evaluering av cytolyse av T-celler inkluderer 51Cr release assay, laktat dehydrogenase release assay, bioluminescerende imaging assay, real-time impedansbasert celleanalyse og cellebasert flowcytometrianalyse 4,5. Den fluorescerende bildebaserte plattformen beskrevet her identifiserer antall levende vs. døde celler, som er en direkte kvantifisering av T-cellecytolyse i motsetning til en indirekte metode for å evaluere cytolyse av T-celler.
Her er en enkel, kostnadseffektiv, rask og høy gjennomstrømningsteknikk med minimal intervensjon for å evaluere cytotoksisiteten til Jurkat-celler som uttrykker epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) CAR mot MDA-MB-231 trippel-negativ brystkreft (TNBC) celler og EGFR CRISPR slår ut MDA-MB-231-celler. Jurkatceller er udødeliggjorte humane T-lymfocyttceller6 som har blitt mye brukt til å studere T-celleaktivering og signalmekanismer7. Videre har Jurkat-celler blitt brukt til in vitro CAR-testing i flere studier 8,9,10,11. Jurkat-celler blir lett transdusert av lentivirus og har vedvarende spredning, og dette systemet ble utnyttet for å optimalisere hengseldomenet til forskjellige EGFR CAR-konstruksjoner.
Denne analysen kan brukes til screening av flere CAR-konstruksjoner rettet mot forskjellige tumorantigener og brukes mot flere adherente tumorcellelinjer og i forskjellige effektor til tumor (E: T) forhold. I tillegg kan flere tidspunkter evalueres, og antall replikater kan endres for å identifisere beste drap blant de forskjellige CAR-konstruksjonene. De beste konstruksjonene må bekreftes ved bruk av mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) avledet CD3 T-celler. Det overordnede målet bak utviklingen av denne metoden er å raskt optimalisere CAR-hengselgeometrien på en høy gjennomstrømningsmåte som overvinner barrierer som lav transduksjonseffektivitet, etterfulgt av bekreftelse i PBMC-avledede T-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alt cellekulturarbeid gjøres i et biosikkerhetsskap med laboratoriefrakk, hansker og etter standard aseptiske teknikker.
1. Generere CAR uttrykke Jurkats (CAR-J)
- Kjøp Jurkat-celler, klon E6-1 fra ATCC. Tine 1 x 106 celler i en T-75 kolbe og dyrke dem i T-75 kolber. Vedlikehold dem i suspensjon ved 0,6 x 106 celler per ml ved bruk av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media supplert med 10% FBS i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2.
- Plate 1 x 105 Jurkat-celler per brønn i en vevskultur behandlet 24 brønnplate i 500 μL RPMI vekstmedium inneholdende 4 μg / ml polybren som forbedrer lentiviral effektivitet. Telle celler ved hjelp av en laserbasert fluorescerende deteksjonscelleanalysator på benken. Antall brønner avhenger av antall konstruksjoner som skal evalueres. Dette eksemplet vil bruke 4 konstruksjoner og en ikke-transdusert kontroll. CAR-konstruksjonsdesignet er vist i tabell 1.
- Tilsett 10 μL lentivirus/brønn av hver CAR-konstruksjon. CAR construct design og lentivirus produksjon ble gjort som beskrevet tidligere12.
- Neste dag tilsettes 1 ml RPMI-vekstmedier til hver brønn og fortsetter dyrkingen i inkubatoren ved 37 °C med 5 % CO2.
- Samle celler 2 dager senere (totalt 72 timer etter Jurkat-transduksjon) og tell dem.
- Ta 1 x 104 celler for løpende flyt for å bekrefte CAR-uttrykk på Jurkat-cellene. Vask cellene kort 2x med FACS fargeløsning (FSS) før du merker CAR-J med antistoffer rettet mot flaggmerke som brukes til å oppdage CAR-positivitet i 30 minutter i mørket ved 4 °C. Vask 2x igjen med FSS og kjør celler gjennom et flowcytometer som tidligere beskrevet12. Bruk antistoffkonsentrasjon som anbefalt av produsenten.
- Jurkat-celler er enkle å omsette og viser nesten alltid >90% CAR-uttrykk. Produser CAR-J lenge før kokulturcytotoksisitetsanalysen og frys ned for senere bruk.
2. Plating CFSE merkede tumorceller
MERK: MDA-MB-231 (fra ATCC, HTB-26) celler var en gave fra en samarbeidspartner, og EGFR KO MDA-MB-231 ble opprettet som tidligere beskrevet12.
- Tine 1 x 106 celler i en T-75 kolbe og dyrke dem i T-75 kolber. Opprettholde MDA-MB-231 tumorceller og CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 tumorceller i 14 ml av Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og splittes når ca. 70% konfluerende.
- Observer adherente tumorceller under vanlig brightfield-mikroskop for å sikre nesten 70% sammenløp.
- Fjern vekstmedier fra kolben ved hjelp av en serologisk pipette. Tilsett 3 ml trypsin til T75-kolben og sett i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 i 3-5 minutter for å løsne cellene fra kolben.
- Nøytraliser trypsinet med like mye (3 ml) vekstmedier. Samle cellesuspensjonen i et sentrifugerør og spinn ned cellene ved 400 x g i 4 minutter for å pelletere ned cellene.
- Kast supernatanten med en pipette og resuspender cellene i 2 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Bestem cellekonsentrasjonen ved hjelp av en celleteller.
- Overfør 8 x 105 celler til et annet 15 ml rør og legg til PBS for å gjøre det til et volum på 1 ml.
- Tilsett 2 μL karboksyfluorescein succinimidylester (CFSE; 5 μM stamkonsentrasjon) i hver tube og bland godt med en 1 ml pipette.
- Inkuber cellene med CFSE i 20 minutter i inkubatoren ved 37 ° C med 5% CO2. Fjern rørene fra inkubatoren etter 20 minutter og tilsett 5 ml vekstmedier til røret.
- Sentrifuger rørene ved 400 x g i 4 minutter for å pelletere ned CFSE-merkede celler. Kast supernatanten med en pipette og tilsett 1 ml ferske medier for å resuspendere cellene.
- Evaluer cellekonsentrasjonen ved hjelp av en celleteller. Overfør 4 x 105 celler til et 25 ml reagensreservoar og tilsett medier for et totalt volum på 8 ml.
- For å sikre tilstrekkelig volum til å frø 5000 tumorceller/brønn i 100 μL medier, volum som trengs for å kunne pipette ved hjelp av flerkanalspipetten, og for å kompensere for tap av noen få celler i trinn 1.7, klargjøre 10%-20% ekstra celler og medievolum.
- Bland cellesuspensjonen grundig med en 5 ml serologisk pipette. Ved hjelp av en 100 μL flerkanals pipette, pipett 100 μL av cellesuspensjonen i hver rad av den klare flatbunnede svarte 96-brønnplaten på venstre halvdel. En prøvepletteringsstrategi finnes i tabell 2.
- Pipette EGFR KO-celler på samme måte på høyre halvdel av platen. Når hele platen er belagt, dra platen frem og tilbake og side til side på vevskulturhetteplattformen for å sikre jevn fordeling av tumorcellene i brønnene.
- Inkuber platen i 4 timer i inkubatoren ved 37 °C med 5% CO2 for tumorcellene å feste.
3. Samdyrking av CAR som uttrykker Jurkats med CFSE-merkede tumorceller
- Ved å bruke tellingen av ikke-transduserte og CAR-uttrykkende Jurkat-celler, overfør 4 x 105 celler av hver CAR-J til et 25 ml reservoar. Legg til DMEM vekstmedier for et totalt volum på 2 ml.
- For E:T på 4:1 ble 2 x 104 CAR-J tilsatt per brønn i 100 μL medier ved hjelp av en flerkanalspipette forsiktig langs siden av hver brønn for ikke å forstyrre de påmonterte tumorcellene.
- Legg til ytterligere 100 μL vekstmedier ved hjelp av en flerkanalspipett til siden av brønner som inneholder tumorceller og Jurkat-celler. Tumorgruppene får 200 μL medier for å gjøre det totalt 300 μL medier i alle brønner.
- Dra platen langs plattformen frem og tilbake og fra side til side bevegelse for å sikre jevn fordeling av Jurkat-cellene på tumorcellene.
- Tillat kokultur i inkubatoren ved 37 °C med 5% CO2 i 48 timer.
4. Klargjøring av plate for avbildning
- Lag en løsning av propidiumjodid (PI) ved 1 μg / ml i lavt bakgrunnsfluorescensmedium basert på antall brønner og hver får 100 μL media.
- For 84 brønner klargjøres 9 ml medier som inneholder PI. Bland mediet grundig med en pipette.
- Lag 10 ml 20% Triton-X-løsning ved å fortynne Triton-X med avionisert vann. Etter 48 timer med co-kultur, kast supernatanten som inneholder CAR-J med en enkelt inversjon av tallerkenen og banke på papirhåndkle.
- Tilsett nå 100 μL av ovennevnte forberedte medier (trinn 4.2) som inneholder PI i hver brønn ved hjelp av en flerkanalspipette forsiktig for ikke å forstyrre de festede tumorcellene.
- Tilsett 20 μL 20% Triton-X-løsning til den første brønnen i hver tumortype, som fungerer som en total død kontroll.
- La platen stå i inkubatoren i 20 minutter. Bilde platen ved hjelp av fluorescerende imaging cytometer. Data lagres på datamaskinen og kan analyseres på et senere tidspunkt.
5. Analysere fluorescerende bilder
- Bruk en av svulstens eneste brønn av celler for å sette den grønne fluorescerende kanalen.
- Reduser brønnmasken til 98% for å fjerne cellene på kanten av brønnen, da signalet ikke er perfekt på kanten.
- Identifiser CFSE-merkede tumorceller på den grønne, fluorescerende CFSE-kanalen. Endre terskelverdien for fluorescensintensitet for å plukke opp alle cellene på brønnen.
- Sett minste cellediameter til 25 μm for å fjerne rusk som oppdages på CFSE-kanalen. Dette varierer avhengig av celletypen som analyseres.
- Aktiver separate berøringsobjekter for å identifisere individuelle celler når de er i kontakt med hverandre.
- Velg CFSE på bildevisningen og se på grafisk overlegg for å finne ut hva som blir plukket av systemet.
- Når CFSE-merkede celler blir riktig plukket opp, sett porter for å definere levende vs døde cellepopulasjoner.
- Ved å velge CFSE-merkede celler, generer et histogram med tellinger på y-aksen vs gjennomsnittlig PI-intensitet på x-aksen.
- Basert på brønnen der vi la til Triton-X (trinn 4.5), tegner du en splitter for å skille lave PI-fargede vs høye PI-fargede celler. Denne brønnen skal ha de fleste cellene i et høyt PI-farget område.
MERK: PI viser basalsignal på levende celler. Derfor dreper tilsetning av Triton-X alle cellene, og de flekker sterkt i den røde fluorescerende kanalen. Dette gjør det lettere å tegne porter for å skille døde celler fra levende celler. - Juster x-akseverdien for å gjøre det enklere å vise cellene. Merk nå de lave PI-fargede cellene som levende celler.
- Merke de levende cellene, angi et nytt histogram med område på x-aksen og telle på y-aksen.
- Tegn en annen splitter ved hjelp av svulst bare godt for å fange celler og ikke rusk. Jurkat-behandlede brønner vil begynne å samle opp rusk som vil bli CFSE-farget og må fjernes fra tellingene. De resterende ikke-ruskene er merket som "Store celler".
- Kjør analysen på hele platen og eksporter regnearket som inneholder tallene.
- Plott de store tellingene for å identifisere antall levende CFSE-merkede tumorceller som er igjen i brønnen etter eksponering for CAR-J. Bestem statistikk ved hjelp av enveis ANOVA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et område av E: T-forhold mellom 1: 8 og 8: 1 for CAR-J1 ble evaluert ved 72 timer, som målrettet EGFR på TNBC MDA-MB-231-celler. Jurkat-celler ble transdusert med CAR lentivirus med polybren for å generere CAR-J-celler som beskrevet i trinn 2. Cytotoksisiteten av CAR-J1 økte signifikant med høyere E:T-ratio uten forskjell i drap ved forholdet 1:8 (figur 1). Mer enn 50% drap ble observert ved 4:1 E:T over 72 timer. Denne E:T ble brukt i påfølgende eksperimenter med varighet redusert til 48 timer for rask cytotoksisitetsevaluering av flere CAR-konstruksjoner. EGFR rettet mot CAR-konstruksjoner med hengseldomenet modifisert ble designet (tabell 1). De 4 forskjellige hengslene som brukes er IgG lang, IgG medium, IgG kort og CD8a som beskrevet her13. Disse 3 konstruksjonene ble uttrykt på Jurkat-celler og CAR-positivitet bestemt ved å evaluere prosentandelen av flaggmerkede celler ved flowcytometri (figur 2A-D) som beskrevet her12. Ikke-transducerte Jurkat-celler ble brukt som kontrollgruppe for å bestemme CAR-uttrykk, og gatingstrategien er vist i (figur 2E). Cytotoksisiteten til disse 4 CAR-konstruksjonene uttrykt på Jurkat-celler ble evaluert mot EGFR som uttrykker MDA-MB-231-celler og CRISPR EGFR KO MDA-MB-231-celler. Antigenspesifikt drap ble observert av alle konstruksjonene (figur 3A), mens det ikke var observert signifikant drap mot EGFR KO-celler (figur 3B), noe som tyder på at drap kun var mediert gjennom scFv. Det var ingen drap av de ikke-transducerte Jurkat-cellene. Representative bilder av tumordrap vises også der overlappingen av CFSE-merkede tumorceller med PI-farget død kjerne får dem til å se gule ut (figur 4). Data er representative for 3 uavhengige eksperimenter med 6 tekniske replikater per gruppe.
Dette ble ytterligere bekreftet ved å uttrykke disse CAR-konstruksjonene på PBMC-avledede CD3 T-celler. Det er lavt uttrykk av CAR på CD3 T-celler som deretter berikes ved steril strømningssortering (figur 5). Det var imidlertid ikke noe uttrykk for CD8-hengsel som inneholdt EGFR CAR. Derfor ble de andre 3 CAR-konstruksjonene som inneholdt IgG lang, IgG-medium og IgG kort evaluert for deres cytotoksiske potensial mot MDA-MB-231-celler. Det er en lignende tendens til at drap med IgG short har minst cytotoksisk potens sammenlignet med de andre 2 konstruksjonene (figur 6). For å identifisere den beste konstruksjonen blant IgG lange og IgG medium CAR-T-celler, ble deres aktivering med og uten eksponering for TNBC-tumorceller evaluert ved intracellulær farging av cytokiner som beskrevet tidligere12. MDA-MB-436 har lave nivåer av EGFR og MDA-MB-468 har det høyeste EGFR-proteinuttrykket basert på en western blot med et panel på 13 TNBC-cellelinjer12. IgG lange CAR-T-celler hadde minst basal aktiveringsnivå (TNFa, 4-1BB) og lav frigjøring av cytotoksiske granulater (perforin og granzyme B)14 uten eksponering for tumorceller (figur 7). Ved eksponering for høye EGFR-uttrykkende MDA-MB-468-celler hadde IgG lange CAR-T-celler den høyeste aktiveringen basert på TNFa og 4-1BB.
Figur 1: EGFR CAR-J1 cytotoksisk evaluering langs et område av E:T. CFSE-merkede MDA-MB-231-tumorceller ble belagt med ikke-transducerte Jurkat-celler eller EGFR rettet mot CAR-J1 i E:T-forholdet 1:8, 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 og 8:1 som viste økende cytotoksisitet med høyere effektorceller. Data er representert som gjennomsnitt ± SD og statistisk signifikans ble evaluert ved hjelp av Student t-test. 1:8 E:T var ikke-signifikant, 1:4 E:T hadde ***p<0,001, og resten ****p<0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: EGFR CAR Jurkat produksjon for in vitro cytotoksisk evaluering. (AD) Nesten 90% -100% CAR uttrykk av 4 forskjellige konstruksjoner CAR IgG lang, CAR IgG medium, CAR IgG kort, CAR CD8a. (E) Gating strategi for bestemmelse av CAR positivitet: Rusk ekskludert i SSC-A vs FSC-A plot; Enkeltceller valgt i FSC-H vs FSC-A-plott; og Levende celler valgt av levedyktighet fargestoff DAPI negativ gating. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Cytotoksisitetsevaluering i samkultur av CAR-J- og CFSE-merkede tumorceller. (A) CFSE-merkede MDA MB 231-celler ble belagt med CAR-J ved 4:1 E:T-forhold i 48 timer som viste varierende effekt ved tumorcelledrap. (B) CFSE-merkede CRISPR EGFR KO MDA MB 231-celler opplevde ingen drap av noen av CAR-J-cellene. Data er representert som gjennomsnitt ± SD og statistisk signifikans ble evaluert ved hjelp av enveis ANOVA. **p<0,01; s<0.0001; NS: Ikke signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Visuell fremstilling av bilder etter 48 timer med samkultur. (A) Tumor bare gruppe med CFSE (grønn) merkede tumorceller. (B) Tilsetning av ikke-transducerte Jurkat-celler med røde blodlegemer som de døde Jurkat-cellene og (C) overlegg av grønt og rødt som indikerer døde tumorceller (gul) som vist med piler. Antall grønne celler som ikke er gule kvantifiseres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: EGFR CD3 CAR-T-celleanrikning. (A-B) CAR-uttrykk evaluert ved å bestemme prosentandelen av flaggpositive og IgG-positive celler før anrikning og (C) postberikelse etter steril strømningssortering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Cytotoksisitetsevaluering i samkultur av CD3-, CAR-T- og CFSE-merkede tumorceller. CFSE-merkede MDA MB 231-celler ble belagt med CAR-J ved 4:1 E:T-forhold i 48 timer og viste varierende effekt ved dreping av tumorceller. Data er representert som gjennomsnitt ± SD og statistisk signifikans ble evaluert ved hjelp av enveis ANOVA. **p<0,01; s<0.0001; NS: Ikke signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: EGFR CD3 CAR-T-celleaktivering. CAR-T-celler ble eksponert for tumorceller og intracellulære cytokinnivåer for (A) TNFa, (B) 4-1BB, (C) perforin og (D) granzym B ble evaluert. Data er representert som gjennomsnitt ± SD og statistisk signifikans ble evaluert ved hjelp av enveis ANOVA *p<0,05; **p<0,01; **p<0.001; s<0.0001; NS: Ikke signifikant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Nei. av PA EGFR806 scFv | Vh-Vl Linker | Hengsel/avstandsstykke | TM | Cytoplasmatisk |
| BIL IgG Long | Whitlow (18 aa) | IgG4 EQ CH2 CH3 (229 aa) | CD4 | 4-1BB / CD3Z |
| BIL IgG Medium | Whitlow | IgG4 CH3 (129 aa) | CD28 | 4-1BB / CD3Z |
| BIL IgG kort | Whitlow | IgG kort (12 aa) | CD4 | 4-1BB / CD3Z |
| BIL CD8a | Whitlow | CD8 (45 aa) | CD8a | 4-1BB / CD3Z |
Tabell 1: CAR konstruere design. Forkortelser: aa = aminosyrer; TM = Transmembran.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| En | Triton-X | Bare MDA MB 231 | Triton-X | Bare MDA MB 231 EGFR KO | ||||||||
| B | MB231 + Spott 4:1 | MB231 EGFR KO + Mock 4: 1 | ||||||||||
| C | MB231 + EGFR IgG lang 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Lang 4:1 | ||||||||||
| D | MB231 + EGFR IgG Medium 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Medium 4:1 | ||||||||||
| E | MB231 + EGFR IgG kort 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG kort 4:1 | ||||||||||
| F | MB231 + EGFR CD8a 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR CD8a 4:1 | ||||||||||
| G | ||||||||||||
| H | ||||||||||||
Tabell 2: Strategi for prøveplating.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi foreslått en rask metode for effektivt å evaluere den målspesifikke cytolytiske aktiviteten indusert av CAR-ekspresjon i Jurkat-celler. Alle CAR-konstruksjoner har samme scFv, men forskjellige hengsel- og transmembrandomener som har vist seg å påvirke CAR-T-cellers styrke13. Videre evaluering av uspesifikke drap av disse CAR-J ble gjort ved å dyrke dem med antigen knock out (KO) celler. Dette viser at drapet er tumorantigenspesifikt og ikke skyldes basal aktivering av CAR-J. Cytotoksisk potensial for en rekke E: T-forhold kan enkelt bestemmes ved å identifisere det minste antall effektorceller som kreves for å eliminere tumorceller på bestemte tidspunkter. Flere cellelinjer fra samme eller forskjellig krefttype og normale celler kan også brukes til å evaluere spesifisiteten til disse konstruksjonene. De mest potente kandidatene identifisert av CAR-J-plattformen kan deretter karakteriseres ytterligere ved å uttrykke CAR på PBMC-avledede CD3 T-celler og utføre lignende drapsanalyser og evaluere utmattelse og aktivering ved eksponering for antigenpositive og negative tumorceller.
Det må bemerkes at Jurkat-celler er CD4+-celler med en endret T-cellereseptor (TCR) signalvei15. Derfor bør intracellulær signaldomeneoptimalisering av CAR-konstruksjoner ideelt sett gjøres med CD3 T-celler16 og fungerer kanskje ikke best med Jurkat-celler. Interessant nok viser CD4 T-celler cytotoksisitet som demonstrert i en tidligere publikasjon der EGFR rettet mot CD4 CAR-T-celler med IgG langt hengsel er i stand til å fullstendig utrydde TNBC-svulster i en intrakranial tumormodell12. I tillegg viser CD4 CAR T-celler langsiktig styrke og bedre drap sammenlignet med blanding av CD4- og CD8 T-celler eller CD8 T-celler alene i GBM-tumormodell, noe som gjør dem klinisk viktige T-celler undergruppe for effektiv CAR-T-terapi17.
Jurkat-celler produserer IL2 og oppregulerer CD69 ved aktivering, selv om de ikke skiller ut alle cytokinene ved primær T-celleaktivering 8,18. Imidlertid informerer evaluering av IL2- og CD69-nivåene om at Jurkat-cellene blir aktivert og ikke om direkte cytolyse av målceller som kvantifiseres i absolutte tumorcelletall ved denne tilnærmingen. Imidlertid er evaluering av cytotoksisitet og aktivering viktig for å forstå effekten av nye CAR-molekyler fullt ut.
Varigheten av samkultur i dette eksperimentet kan endres basert på konstruksjonene som brukes. CFSE-merking på tumorceller ble funnet å være påviselig inntil 4 dager etter plating. Derfor, for å oppnå et høyt signal / støyforhold, ble eksperimenter utført innen 72 timer. Siden CFSE-intensiteten reduseres ved deling av tumorceller, kan mengden CFSE som brukes og varigheten måtte endres i henhold til de anvendte tumorcellene. Siden dette er et eksperiment med høy gjennomstrømning for å analysere flere konstruksjoner om gangen, må såtettheten til målceller i en 96-brønnplate også optimaliseres. Målceller må opprettholdes slik at de ikke blir overkonfluente eller har konkurransedyktig vekstbegrensning ved slutten av analysen uten behov for å bytte media for å minimere noen inngrep. Større brønnplater kan brukes til å imøtekomme flere celler og øke levetiden til forsøket. Bildene må imidlertid sys for å få et fullstendig bilde av brønnen, og hver brønn må bearbeides individuelt, noe som kanskje ikke gjør det raskt og høyt gjennomstrømning.
En annen tilnærming til langvarig fluorescerende merking tumorceller er ved lentiviral transduksjon med grønt fluorescerende protein (GFP) eller rødt fluorescerende protein (RFP). Riktig klonalt utvalg må gjøres for å velge høyt berikede (nesten 100%) lyseste kolonier for det beste signal-støyforholdet. Levedyktighetsfargen må velges riktig basert på fluorescerende detektorer i bildebehandlingsinstrumentet.
Bakgrunnsfluorescens avhenger av mediet som brukes, og må derfor kontrolleres for å unngå tap av signal mens du anskaffer bilder. Vanlige medier inneholder komponenter som avgir betydelig fluorescens når de er opphisset. Det anbefales å bruke et lavt bakgrunnsmedium19. PBS kan brukes, men det kan påvirke cellene under bildeinnsamling, da det tar omtrent 20 minutter å skaffe bilder, avhengig av innstillingene som er angitt for å ta bilder.
En av begrensningene i denne analysen er ikke å kunne ta bilder på flere tidspunkter av samme 96-brønnplate etter å ha tilsatt et levedyktighetsfargestoff. Effekten av tillegg av PI over lang tid ble ikke evaluert for denne publikasjonen. Det ville imidlertid være ideelt å kunne oppdage levende og døde / døende målceller over en periode ved hjelp av samme plate. Det kan være vanskelig å skille individuelle celler hvis cellene blir overflytende. Arealet av cellemonolag og fluorescensintensitet kan brukes til å sammenligne prosent av celler levende/døde som beskrevet20.
Alternative metoder for å påvise cytolyse fra CAR-T-celler måler ikke direkte det absolutte antall døde og levende celler, men evaluerer styrken ved indirekte metoder som er beskrevet i detalj andre steder 4,5. Så denne metoden gir en absolutt redegjørelse for effektorceller og kan også brukes i samkultur av 3 celletyper, avhengig av kapasiteten til bildeinstrumentet. Det er svært få celler som kreves (5000 per brønn) som kan endres sammen med friheten til å velge et tidspunkt som er store fordeler ved å bruke denne analysen. Målceller i suspensjon og i 3-dimensjonal sfæroidkultur kan også brukes i kultur med effektorceller og cytolyse bestemt som beskrevet andre steder21. Videre kan denne plattformen brukes til å skjerme store biblioteker av små molekyler og forbindelser for å avgrense de mest effektive molekylene, og flere doseringer kan gjøres på flere tidspunkter.
Foruten hastigheten og fleksibiliteten til systemet, er den endelige fordelen kostnadene. Den fluorescerende bildebehandlingsmaskinen, platene og reagensene er alle vanlige og rimelige å kjøpe, spesielt sammenlignet med enheter som er mer sofistikerte og kan til og med bruke edle metaller i sine engangsplater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
MDA-MB-231 var en snill gave fra Dr. Shane Stecklein. Forfatterne anerkjenner finansiering fra University of Kansas Cancer Center for å gjennomføre denne forskningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Methods in Cell Biology. 167, Academic Press. 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D. Jr, Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis. , https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023).
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
