Summary
Un protocolo para evaluar la destrucción cuantitativa de células tumorales por células Jurkat que expresan el receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido a un solo antígeno tumoral. Este protocolo se puede utilizar como plataforma de cribado para la optimización rápida de las construcciones de bisagras de CAR antes de la confirmación en células T derivadas de sangre periférica.
Abstract
Los linfocitos T con receptor de antígeno quimérico (CAR) están a la vanguardia de la oncología. Un CAR se construye a partir de un dominio diana (generalmente un fragmento variable de cadena única, scFv), con un enlazador intracadena que lo acompaña, seguido de un dominio bisagra, transmembrana y coestimulador. La modificación del enlazador intracadena y del dominio de bisagra puede tener un efecto significativo en la muerte mediada por CAR. Teniendo en cuenta las muchas opciones diferentes para cada parte de una construcción CAR, hay un gran número de permutaciones. La fabricación de células CAR-T es un proceso largo y costoso, y la fabricación y prueba de muchas construcciones requiere una gran inversión de tiempo y material. Este protocolo describe una plataforma para evaluar rápidamente las construcciones de CAR optimizadas para bisagras en células Jurkat (CAR-J). Las células Jurkat son una línea de células T inmortalizadas con una alta absorción de lentivirus, lo que permite una transducción eficiente de CAR. Aquí, presentamos una plataforma para evaluar rápidamente CAR-J utilizando un generador de imágenes fluorescente, seguido de la confirmación de la citólisis en células T derivadas de PBMC.
Introduction
La terapia de células CAR-T ha demostrado ser muy prometedora en neoplasias malignas hematológicas, lo que se evidencia en los 6 productos CAR-T aprobados por la FDA desde 2017, según lo informado por el Instituto Nacional del Cáncer1. Existen numerosas células CAR-T en ensayos clínicos para atacar tumores sólidos. La ingeniería de nuevos objetivos CAR y la optimización de la construcción de CAR son vitales para la eficacia de una célula CAR-T. La elección de la construcción de CAR ideal para cada aplicación es esencial para una orientación precisa de los antígenos asociados al tumor (TAA) y, al mismo tiempo, evitar niveles bajos de expresión de TAA en los tejidos normales2.
Una construcción de CAR se compone principalmente de cinco compartimentos: (1) dominio extracelular de fragmento variable de cadena única (scFv) dirigido al antígeno tumoral; (2) dominio de bisagra; (3) dominio transmembrana; (4) dominio coestimulador intracelular de células T citoplasmáticas; y (5) dominio de señalización. La modificación de cada uno de estos dominios afecta a la precisión de la célula CAR-T que interactúa con su célula diana3. Por lo tanto, la evaluación de la citotoxicidad y la reactividad cruzada de estas construcciones de CAR in vitro es fundamental para elegir la construcción correcta para avanzar hacia experimentos in vivo. Los métodos actuales para evaluar la citólisis por células T incluyen el ensayo de liberación de 51Cr, el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa, el ensayo de imágenes bioluminiscentes, el análisis celular basado en impedancia en tiempo real y el ensayo de citometría de flujo basado en células 4,5. La plataforma basada en imágenes fluorescentes descrita aquí identifica el número de células vivas frente a las muertas, que es una cuantificación directa de la citólisis de células T en lugar de un método indirecto de evaluación de la citólisis por parte de las células T.
Esta es una técnica fácil, rentable, rápida y de alto rendimiento con una intervención mínima para evaluar la citotoxicidad de las células Jurkat que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) CAR contra las células de cáncer de mama triple negativo (TNBC) MDA-MB-231 y las células EGFR CRISPR knock out MDA-MB-231. Las células Jurkat son células de linfocitos T humanos inmortalizadas6 que se han utilizado ampliamente para estudiar la activación de las células T y los mecanismos de señalización7. Además, las células Jurkat se han utilizado para pruebas in vitro de CAR en múltiples estudios 8,9,10,11. Las células Jurkat son fácilmente transducidas por lentivirus y tienen una proliferación sostenida, y este sistema se aprovechó para optimizar el dominio de bisagra de varias construcciones de EGFR CAR.
Este ensayo se puede utilizar para el cribado de múltiples construcciones de CAR dirigidas a varios antígenos tumorales y se puede utilizar contra múltiples líneas celulares tumorales adherentes y en varias proporciones efectora-tumoral (E:T). Además, se pueden evaluar múltiples puntos de tiempo y se puede modificar el número de réplicas para identificar la mejor eliminación entre las diversas construcciones de CAR. Los mejores constructos deben confirmarse utilizando células T CD3 derivadas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). El objetivo general detrás del desarrollo de este método es optimizar rápidamente la geometría de la bisagra CAR de una manera de alto rendimiento, superando barreras como la baja eficiencia de transducción, seguida de la confirmación en células T derivadas de PBMC.
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Protocol
NOTA: Todo el trabajo de cultivo celular se realiza en una cabina de bioseguridad con bata de laboratorio, guantes y siguiendo las técnicas asépticas estándar.
1. Generación de CAR que expresa Jurkats (CAR-J)
- Compre células Jurkat, clon E6-1 de ATCC. Descongelar 1 x 106 células en un matraz T-75 y cultivarlas en matraces T-75. Manténgalos en suspensión a 0,6 x 106 células por ml utilizando medios del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suplementados con 10% de FBS en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2.
- Placa 1 x 105 células Jurkat por pocillo de un cultivo de tejidos tratado Placa de 24 pocillos en 500 μL de medio de crecimiento RPMI que contiene 4 μg/mL de polibreno que mejora la eficiencia lentiviral. Cuente las células con un analizador de células de sobremesa de detección fluorescente basado en láser. El número de pozos depende del número de constructos a evaluar. En este ejemplo se utilizarán 4 construcciones y un control sin transducir. El diseño de la construcción del CAR se muestra en la Tabla 1.
- Agregue 10 μL de lentivirus/pocillo de cada construcción de CAR. El diseño de la construcción de la CAR y la producción de lentivirus se realizó como se describió anteriormente12.
- Al día siguiente, agregue 1 mL de medio RPMI de crecimiento a cada pocillo y continúe cultivando en la incubadora a 37 °C con 5% de CO2.
- Recoja las células 2 días después (total 72 h después de la transducción de Jurkat) y cuéntelas.
- Tome 1 x 104 celdas para el flujo continuo para confirmar la expresión de CAR en las celdas Jurkat. Lavar brevemente las células 2 veces con solución de tinción FACS (FSS) antes de etiquetar el CAR-J con anticuerpos dirigidos a la etiqueta Flag utilizada para detectar la positividad de CAR durante 30 minutos en la oscuridad a 4 °C. Lavar 2 veces de nuevo con FSS y pasar las células a través de un citómetro de flujo como se describió anteriormente12. Use la concentración de anticuerpos según lo recomendado por el fabricante.
- Las células Jurkat se transducen fácilmente y casi siempre muestran una expresión de CAR del >90%. Producir CAR-J mucho antes del ensayo de citotoxicidad de cocultivo y congelar para su uso posterior.
2. Siembra de células tumorales marcadas con CFSE
NOTA: LAS CÉLULAS MDA-MB-231 (de ATCC, HTB-26) fueron un regalo de un colaborador, y las EGFR KO MDA-MB-231 se crearon como se describió anteriormente12.
- Descongelar 1 x 106 células en un matraz T-75 y cultivarlas en matraces T-75. Mantener las células tumorales MDA-MB-231 y las células tumorales CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 en 14 ml del medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 y dividido cuando aproximadamente el 70% confluye.
- Observe las células tumorales adherentes bajo un microscopio de campo claro regular para garantizar una confluencia de casi el 70%.
- Retire el medio de crecimiento del matraz con una pipeta serológica. Añadir 3 ml de tripsina al matraz T75 y colocarlo en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 3-5 min para separar las células del matraz.
- Neutralice la tripsina usando la misma cantidad (3 mL) de medio de crecimiento. Recoja la suspensión celular en un tubo de centrífuga y gire las celdas a 400 x g durante 4 minutos para granular las celdas.
- Deseche el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender las células en 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Determine la concentración de células utilizando un contador de células.
- Transfiera 8 x 105 células a otro tubo de 15 ml y agregue PBS para obtener un volumen de 1 ml.
- Añadir 2 μL de éster de carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE; 5 μM de concentración de stock) en cada tubo y mezclar bien con una pipeta de 1 mL.
- Incubar las células con CFSE durante 20 min en la incubadora a 37 °C con 5% de CO2. Retire los tubos de la incubadora después de 20 minutos y agregue 5 ml de medio de crecimiento al tubo.
- Centrifugar los tubos a 400 x g durante 4 min para granular las células marcadas con CFSE. Deseche el sobrenadante con una pipeta y agregue 1 ml de medio fresco para resuspender las células.
- Vuelva a evaluar la concentración de células utilizando un contador de células. Transfiera 4 x 105 células a un depósito de reactivo de 25 ml y agregue medios para un volumen total de 8 ml.
- Para garantizar un volumen suficiente para sembrar 5000 células tumorales/pocillo en 100 μl de medio, el volumen necesario para poder pipetear con la pipeta multicanal y, para compensar la pérdida de unas pocas células durante el paso 1.7, prepare entre un 10 % y un 20 % de células adicionales y volumen de medios.
- Mezclar bien la suspensión celular con una pipeta serológica de 5 ml. Con una pipeta multicanal de 100 μL, pipetee 100 μL de la suspensión celular en cada fila de la placa negra de 96 pocillos de fondo plano transparente en la mitad izquierda. En la Tabla 2 se puede encontrar un ejemplo de estrategia de siembra.
- Pipetea las células EGFR KO de forma similar en la mitad derecha de la placa. Una vez que toda la placa esté plateada, arrastre la placa hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado en la plataforma de la campana de cultivo de tejidos para garantizar una distribución uniforme de las células tumorales en los pocillos.
- Incubar la placa durante 4 h en la incubadora a 37 °C con 5% de CO2 para que las células tumorales se adhieran.
3. Cocultivo de Jurkats que expresan CAR con células tumorales marcadas con CFSE
- Utilizando los recuentos de células Jurkat no transducidas y que expresan CAR, transfiera 4 x 105 células de cada CAR-J a un depósito de 25 ml. Agregue medios de crecimiento DMEM para un volumen total de 2 ml.
- Para E:T de 4:1, se añadieron 2 x 104 CAR-J por pocillo en 100 μL de medio utilizando una pipeta multicanal suavemente a lo largo del costado de cada pocillo para no alterar las células tumorales adheridas.
- Agregue otros 100 μL de medio de crecimiento con una pipeta multicanal al lado de los pocillos que contienen células tumorales y células Jurkat. Los grupos de tumores solo reciben 200 μL de medio para un total de 300 μL de medio en todos los pocillos.
- Arrastre la placa a lo largo de la plataforma con movimientos hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado para garantizar una distribución uniforme de las células Jurkat en las células tumorales.
- Permitir el cocultivo en la incubadora a 37 °C con 5% de CO2 durante 48 h.
4. Preparación de la placa para la obtención de imágenes
- Prepare una solución de yoduro de propidio (PI) a 1 μg/mL en medios de baja fluorescencia de fondo en función del número de pocillos y cada uno obtenga 100 μL de medio.
- Para 84 pocillos, prepare 9 mL de medio que contenga PI. Mezcle bien el medio con una pipeta.
- Prepare 10 ml de solución de Triton-X al 20% diluyendo Triton-X con agua desionizada. Después de 48 h de cocultivo, deseche el sobrenadante que contiene CAR-J mediante una sola inversión de la placa y golpeando una toalla de papel.
- A continuación, añada 100 μL de los medios preparados anteriormente (paso 4.2) que contengan IP en cada pocillo utilizando una pipeta multicanal con cuidado para no alterar las células tumorales adheridas.
- Agregue 20 μL de solución de Triton-X al 20% al primer pocillo de cada tipo de tumor, lo que funciona como un control muerto total.
- Deje la placa en la incubadora durante 20 min. Tome imágenes de la placa con el citómetro de imágenes fluorescentes. Los datos se almacenan en la computadora y se pueden analizar en un momento posterior.
5. Análisis de imágenes fluorescentes
- Use una de las células tumorales para establecer el canal fluorescente verde.
- Disminuya la máscara del pocillo al 98% para eliminar las celdas en el borde del pozo, ya que la señal no es perfecta en el borde.
- Identificar las células tumorales marcadas con CFSE en el canal verde fluorescente de CFSE. Modifique el valor del umbral de intensidad de fluorescencia para recoger todas las células del pocillo.
- Establezca el diámetro mínimo de la celda en 25 μm para eliminar cualquier residuo detectado en el canal CFSE. Esto varía según el tipo de célula que se analice.
- Habilite Separar objetos táctiles para identificar células individuales cuando están en contacto entre sí.
- Seleccione CFSE en la pantalla de la imagen y observe la superposición gráfica para averiguar qué está eligiendo el sistema.
- Una vez que las células marcadas con CFSE se recojan correctamente, establezca puertas para definir la población de células vivas frente a las muertas.
- Seleccionando las celdas marcadas con CFSE, genere un histograma de recuentos en el eje Y frente a la intensidad media de PI en el eje X.
- Basándonos en el pocillo en el que añadimos Triton-X (paso 4.5), dibuje un divisor para diferenciar las células con tinción de PI bajo y las de tinción con PI alto. Este pocillo debe tener la mayoría de las células en una región con alta tinción de PI.
NOTA: PI muestra la señal basal en las células vivas. Por lo tanto, la adición de Triton-X mata todas las células y se tiñen de brillo en el canal fluorescente rojo. Esto facilita el dibujo de puertas para separar las células muertas de las células vivas. - Ajuste el valor del eje x para poder ver mejor las celdas. Ahora etiquete las células teñidas con PI bajo como células vivas.
- Al seleccionar las celdas vivas, establezca otro histograma con el área en el eje x y los recuentos en el eje y.
- Dibuje otro divisor usando el tumor solo bien para capturar células y no desechos. Los pozos tratados con Jurkat comenzarán a acumular escombros que se teñirán con CFSE y deberán eliminarse de los conteos. El resto de los que no son escombros se etiquetan como "células grandes".
- Ejecute el análisis en toda la placa y exporte la hoja de cálculo que contiene los números.
- Grafique los recuentos grandes para identificar el número de células tumorales vivas marcadas con CFSE que permanecen en el pocillo después de la exposición a CAR-J. Determine estadísticas mediante ANOVA de un factor.
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Representative Results
Se evaluó un rango de relación E:T entre 1:8 y 8:1 para CAR-J1 a las 72 h que se dirigió a EGFR en células TNBC MDA-MB-231. Las células Jurkat se transducieron con lentivirus CAR con polibreno para generar células CAR-J como se describe en el paso 2. La citotoxicidad de CAR-J1 aumentó significativamente con una mayor relación E:T sin diferencias en la relación de muerte a 1:8 (Figura 1). Se observó más del 50% de muertes a 4:1 E:T durante 72 h. Este E:T se utilizó para experimentos posteriores con una duración reducida a 48 h para la evaluación rápida de la citotoxicidad de múltiples construcciones de CAR. Se diseñaron construcciones CAR dirigidas a EGFR con el dominio de bisagra modificado (Tabla 1). Las 4 bisagras diferentes utilizadas son IgG larga, IgG media, IgG corta y CD8a como se describe aquí13. Estos 3 constructos se expresaron en las células Jurkat y la positividad de CAR se determinó mediante la evaluación del porcentaje de células marcadas con Flag mediante citometría de flujo (Figura 2A-D) como se describe aquí12. Se utilizaron células Jurkat no transducidas como grupo control para determinar la expresión de CAR y la estrategia de activación se muestra en la (Figura 2E). Se evaluó la citotoxicidad de estas 4 construcciones CAR expresadas en células Jurkat frente a células MDA-MB-231 que expresan EGFR y células CRISPR EGFR KO MDA-MB-231. La muerte específica del antígeno fue observada por todos los constructos (Figura 3A), mientras que no se observó ninguna muerte significativa contra las células KO de EGFR (Figura 3B), lo que sugiere que la muerte fue mediada específicamente a través del scFv solamente. No hubo matanza por parte de las células Jurkat no transducidas. También se muestran imágenes representativas de la destrucción tumoral en las que la superposición de células tumorales marcadas con CFSE con núcleo muerto teñido con PI hace que aparezcan amarillas (Figura 4). Los datos son representativos de 3 experimentos independientes con 6 réplicas técnicas por grupo.
Esto se confirmó aún más mediante la expresión de estas construcciones de CAR en células T CD3 derivadas de PBMC. Hay una baja expresión de CAR en las células T CD3 que luego se enriquecen mediante la clasificación de flujo estéril (Figura 5). Sin embargo, no hubo expresión de bisagra CD8 que contuviera EGFR CAR. Por lo tanto, se evaluó el potencial citotóxico de las otras 3 construcciones de CAR que contenían IgG larga, IgG media e IgG corta. Existe una tendencia similar de matanza, siendo la IgG corta la que tiene la menor potencia citotóxica en comparación con las otras 2 construcciones (Figura 6). Para identificar el mejor constructo entre las células CAR-T largas e IgG medias, se evaluó su activación con y sin exposición a células tumorales TNBC mediante tinción intracelular de citocinas como se describió anteriormente12. MDA-MB-436 tiene niveles bajos de EGFR y MDA-MB-468 tiene la expresión más alta de la proteína EGFR basada en un western blot con un panel de 13 líneas celulares TNBC12. Las células CAR-T largas IgG presentaron los menores niveles de activación basal (TNFa, 4-1BB) y baja liberación de gránulos citotóxicos (perforina y granzima B)14 sin ninguna exposición a las células tumorales (Figura 7). Tras la exposición a células MDA-MB-468 con alta expresión de EGFR, las células CAR-T largas de IgG tuvieron la mayor activación basada en TNFa y 4-1BB.
Figura 1: Evaluación citotóxica de EGFR CAR-J1 a lo largo de un rango de E:T. Las células tumorales MDA-MB-231 marcadas con CFSE se sembraron con células Jurkat no transducidas o EGFR dirigidas a CAR-J1 en una relación E:T de 1:8, 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 y 8:1, lo que mostró un aumento de la citotoxicidad con células efectoras más altas. Los datos se representan como media ± DE y la significación estadística se evaluó mediante la prueba t de Student. 1:8 E:T no fue significativo, 1:4 E:T tuvo ***p<0.001 y el resto ****p<0.0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Producción de Jurkat de EGFR CAR para la evaluación citotóxica in vitro . (A-D) Casi 90%-100% de expresión de CAR de 4 construcciones diferentes: CAR IgG larga, CAR IgG media, CAR IgG corta, CAR CD8a. (E) Estrategia de compuerta para la determinación de la positividad de CAR: Escombros excluidos en la parcela SSC-A vs FSC-A; Celdas individuales seleccionadas en el gráfico FSC-H vs FSC-A; y células vivas seleccionadas por compuerta negativa de colorante DAPI de viabilidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación de la citotoxicidad en el cocultivo de células tumorales marcadas con CAR-J y CFSE. (A) Las células MDA MB 231 marcadas con CFSE se sembraron con CAR-J en una relación E:T de 4:1 durante 48 h y mostraron una eficacia variable en la destrucción de células tumorales. (B) Las células CRISPR EGFR KO MDA MB 231 marcadas con CFSE no experimentaron ninguna muerte por ninguna de las células CAR-J. Los datos se representan como media ± DE y la significación estadística se evaluó mediante ANOVA de un factor. **p<0,01; p<0,0001; NS: No es significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Representación visual de las imágenes después de 48 h de cocultivo. (A) Grupo de tumor solo con células tumorales marcadas con CFSE (verde). (B) Adición de células Jurkat no transducidas con glóbulos rojos que son las células Jurkat muertas y (C) superposición de verde y rojo que indica células tumorales muertas (amarillo) como se muestra con flechas. Se cuantifica el número de celdas verdes que no son amarillas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Enriquecimiento de células CAR-T CD3 de EGFR. (A-B) La expresión de CAR se evaluó determinando el porcentaje de células Flag positivas e IgG positivas antes del enriquecimiento y (C) después del enriquecimiento mediante clasificación de flujo estéril. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Evaluación de la citotoxicidad en cocultivo de células tumorales marcadas con CD3 CAR-T y CFSE. Las células MDA MB 231 marcadas con CFSE se sembraron con CAR-J en una relación E:T de 4:1 durante 48 h, mostrando una eficacia variable en la destrucción de células tumorales. Los datos se representan como media ± DE y la significación estadística se evaluó mediante ANOVA de un factor. **p<0,01; p<0,0001; NS: No es significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Activación de las células CAR-T CD3 de EGFR. Las células CAR-T se expusieron a células tumorales y se evaluaron los niveles de citocinas intracelulares para (A) TNFa, (B) 4-1BB, (C) perforina y (D) granzima B. Los datos se representan como media ± DE y la significación estadística se evaluó mediante ANOVA de una vía *p<0,05; **p<0,01; **p<0,001; p<0,0001; NS: No es significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| No. de PA EGFR806 scFv | Enlazador Vh-VL | Bisagra/Espaciador | TM | Citoplasmático |
| COCHE IgG Largo | Whitlow (18 aa) | IgG4 EQ CH2 CH3 (229 aa) | CD4 | 4-1BB / CD3z |
| CAR IgG Medio | Whitlow | IgG4 CH3 (129 aa) | CD28 | 4-1BB / CD3z |
| CAR IgG Corto | Whitlow | IgG corta (12 aa) | CD4 | 4-1BB / CD3z |
| COCHE CD8a | Whitlow | CD8 (45 aa) | CD8a | 4-1BB / CD3z |
Tabla 1: Diseños de construcción de CAR. Abreviaturas: aa = aminoácidos; TM = Transmembrana.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Un | Tritón-X | Solo MDA MB 231 | Tritón-X | MDA MB 231 EGFR KO solamente | ||||||||
| B | MB231 + Simulacro 4:1 | MB231 EGFR KO + Simulacro 4:1 | ||||||||||
| C | MB231 + EGFR IgG Largo 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Largo 4:1 | ||||||||||
| D | MB231 + EGFR IgG Medio 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Medio 4:1 | ||||||||||
| E | MB231 + EGFR IgG Corto 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Corto 4:1 | ||||||||||
| F | MB231 + EGFR CD8a 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR CD8a 4:1 | ||||||||||
| G | ||||||||||||
| H | ||||||||||||
Tabla 2: Estrategia de enchapado de muestras.
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Discussion
Aquí hemos propuesto un método rápido para evaluar eficientemente la actividad citolítica específica de la diana inducida por la expresión de CAR en células Jurkat. Todas las construcciones de CAR tienen el mismo scFv pero diferentes dominios bisagra y transmembrana que se ha demostrado que afectan a la potencia de las células CAR-T13. La evaluación adicional de la destrucción inespecífica por parte de estos CAR-J se realizó mediante el cultivo con células knock-out de antígenos (KO). Esto demuestra que la muerte es específica del antígeno tumoral y no se debe a la activación basal por el CAR-J. El potencial citotóxico de un rango de relaciones E:T se puede determinar fácilmente identificando el menor número de células efectoras necesarias para eliminar las células tumorales en puntos de tiempo específicos. También se pueden utilizar múltiples líneas celulares del mismo o diferente tipo de cáncer y células normales para evaluar la especificidad de estas construcciones. Los candidatos más potentes identificados por la plataforma CAR-J se pueden caracterizar aún más mediante la expresión de CAR en células T CD3 derivadas de PBMC y la realización de ensayos de eliminación similares y la evaluación del agotamiento y la activación tras la exposición a células tumorales positivas y negativas de antígenos.
Hay que tener en cuenta que las células Jurkat son células CD4+ con una vía de señalización del receptor de células T (TCR) alterada15. Por lo tanto, la optimización del dominio de señalización intracelular de las construcciones de CAR idealmente debe realizarse con células T CD316 y puede no funcionar mejor con células Jurkat. Curiosamente, los linfocitos T CD4 muestran citotoxicidad, como se demostró en una publicación anterior en la que el EGFR dirigido a los linfocitos CAR-T CD4 con bisagra larga de IgG es capaz de erradicar completamente los tumores TNBC en un modelo tumoral intracraneal12. Además, las células T con CAR CD4 muestran una potencia a largo plazo y una mejor eliminación en comparación con la mezcla de células T CD4 y CD8 o las células T CD8 solas en el modelo tumoral GBM, lo que las convierte en un subconjunto de células T clínicamente importantes para una terapia CAR-T eficaz17.
Las células Jurkat producen IL2 y regulan al alza CD69 tras la activación, aunque no secretan todas las citocinas de la activación primaria de las células T 8,18. Sin embargo, la evaluación de los niveles de IL2 y CD69 informa sobre la activación de las células Jurkat y no sobre la citólisis directa de las células diana que se cuantifican en números absolutos de células tumorales mediante este enfoque. Sin embargo, la evaluación de la citotoxicidad y la activación es importante para comprender completamente los efectos de las nuevas moléculas de CAR.
La duración del cocultivo en este experimento puede modificarse en función de los constructos que se utilicen. Se encontró que el marcaje de CFSE en las células tumorales era detectable hasta 4 días después de la colocación de placas. Por lo tanto, para lograr una alta relación señal/ruido, los experimentos se realizaron en 72 h. Dado que la intensidad de la CFSE disminuye con la división de las células tumorales, es posible que sea necesario cambiar la cantidad de CFSE utilizada y la duración según las células tumorales utilizadas. Dado que se trata de un experimento de alto rendimiento para analizar múltiples construcciones a la vez, también es necesario optimizar la densidad de siembra de las células objetivo en una placa de 96 pocillos. Las células diana deben mantenerse de manera que no crezcan sobreconfluentes o tengan una restricción de crecimiento competitiva al final del ensayo sin necesidad de cambiar el medio para minimizar cualquier intervención. Se pueden usar placas de pocillos más grandes para acomodar más células y aumentar la longevidad del experimento. Sin embargo, las imágenes deben coserse para obtener una imagen completa del pocillo y cada pocillo debe trabajarse individualmente, lo que puede no hacer que sea rápido y de alto rendimiento.
Otro enfoque de marcaje fluorescente a largo plazo de las células tumorales es la transducción lentiviral con proteína fluorescente verde (GFP) o proteína fluorescente roja (RFP). Se debe realizar una selección clonal adecuada para seleccionar las colonias más brillantes altamente enriquecidas (casi el 100%) para obtener la mejor relación señal/ruido. El colorante de viabilidad debe seleccionarse adecuadamente en función de los detectores fluorescentes del instrumento de imagen.
La fluorescencia de fondo depende del medio que se utilice y, por lo tanto, debe comprobarse para evitar la pérdida de señal durante la adquisición de imágenes. Los medios regulares contienen componentes que emiten una fluorescencia significativa cuando se excitan. Se recomienda utilizar un medio de fondo bajo19. Se puede utilizar PBS, pero puede afectar a las celdas durante la adquisición de imágenes, ya que se tarda aproximadamente 20 minutos en adquirir imágenes, dependiendo de la configuración establecida para capturar imágenes.
Una de las limitaciones de este ensayo es no poder tomar imágenes en múltiples puntos de tiempo de la misma placa de 96 pocillos después de agregar un tinte de viabilidad. En esta publicación no se evaluó el efecto de la adición de IP durante mucho tiempo. Sin embargo, lo ideal sería poder detectar células diana vivas y muertas/moribundas durante un periodo de tiempo utilizando la misma placa. Puede ser difícil segregar células individuales si las células se vuelven demasiado confluentes. El área de la monocapa celular y la intensidad de fluorescencia se pueden utilizar para comparar el porcentaje de células vivas/muertas como se describe20.
Los métodos alternativos utilizados para detectar la citólisis por células CAR-T no miden directamente el número absoluto de células muertas y vivas, sino que evalúan la potencia mediante métodos indirectos que se describen en detalle en otra parte 4,5. Por lo tanto, este método da una cuenta absoluta de las células efectoras y también se puede utilizar en el cocultivo de 3 tipos de células, dependiendo de la capacidad del instrumento de imagen. Se requieren muy pocas celdas (5000 por pocillo) que pueden cambiar junto con la libertad de elegir un punto de tiempo, que son grandes ventajas de usar este ensayo. Las células diana en suspensión y en cultivo de esferoides tridimensionales también pueden utilizarse en cultivo con células efectoras y en citólisis determinada como se describe en otra parte21. Además, esta plataforma se puede utilizar para examinar grandes bibliotecas de moléculas y compuestos pequeños para delinear las moléculas más efectivas y se puede realizar una dosificación múltiple en múltiples puntos de tiempo.
Además de la velocidad y la flexibilidad del sistema, el beneficio final es el costo. La máquina de imágenes fluorescentes, las placas y los reactivos son comunes y asequibles de comprar, especialmente en comparación con los dispositivos que son más sofisticados e incluso pueden usar metales preciosos en sus placas de un solo uso.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
MDA-MB-231 fue un amable regalo del Dr. Shane Stecklein. Los autores agradecen la financiación del Centro Oncológico de la Universidad de Kansas para llevar a cabo esta investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Methods in Cell Biology. 167, Academic Press. 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D. Jr, Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis. , https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023).
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
