Summary
Ett protokoll för att utvärdera kvantitativ avdödning av tumörceller av Jurkat-celler som uttrycker chimär antigenreceptor (CAR) riktad mot enstaka tumörantigen. Detta protokoll kan användas som en screeningplattform för snabb optimering av CAR-gångjärnskonstruktioner före bekräftelse i perifera blodderiverade T-celler.
Abstract
Chimär antigenreceptor (CAR) T-celler ligger i framkant inom onkologi. En CAR är uppbyggd av en måldomän (vanligtvis ett fragment med en enda kedjevariabel, scFv), med en tillhörande intrakedjelänkare, följt av en gångjärns-, transmembran- och kostnadsdomän. Modifiering av intrakedjelänkaren och gångjärnsdomänen kan ha en betydande effekt på CAR-medierat dödande. Med tanke på de många olika alternativen för varje del av en CAR-konstruktion finns det ett stort antal permutationer. Att tillverka CAR-T-celler är en tidskrävande och dyr process, och att tillverka och testa många konstruktioner är en tung tids- och materialinvestering. Detta protokoll beskriver en plattform för att snabbt utvärdera gångjärnsoptimerade CAR-konstruktioner i Jurkat-celler (CAR-J). Jurkat-celler är en odödliggjord T-cellinje med högt lentivirusupptag, vilket möjliggör effektiv CAR-transduktion. Här presenterar vi en plattform för att snabbt utvärdera CAR-J med hjälp av en fluorescerande kamera, följt av bekräftelse av cytolys i PBMC-härledda T-celler.
Introduction
CAR-T-cellterapi har visat sig vara mycket lovande vid hematologiska maligniteter, vilket framgår av de 6 FDA-godkända CAR-T-produkterna sedan 2017, enligt National Cancer Institute1. Det finns många CAR-T-celler i kliniska prövningar för att rikta in sig på solida tumörer. Att konstruera nya CAR-mål och optimera CAR-konstruktionen är avgörande för effektiviteten hos en CAR-T-cell. Att välja den ideala CAR-konstruktionen för varje applikation är avgörande för korrekt inriktning av tumörassocierade antigener (TAA) samtidigt som man undviker låga nivåer av TAA-uttryck i normala vävnader2.
En CAR-konstruktion består huvudsakligen av fem fack: (1) extracellulärt enkelkedjigt variabelt fragment (scFv) domän som riktar sig mot tumörantigen; (2) Gångjärnsdomän; (3) transmembran domän; (4) intracellulär cytoplasmatisk T-cells-costimulatorisk domän; och (5) signaleringsdomän. Modifiering av var och en av dessa domäner påverkar precisionen hos CAR-T-cellen som interagerar med sin målcell3. Därför är det viktigt att utvärdera cytotoxiciteten och korsreaktiviteten hos dessa CAR-konstruktioner in vitro för att välja rätt konstruktion för att gå vidare mot in vivo-experiment. Nuvarande metoder för att utvärdera cytolys med T-celler inkluderar 51Cr-frisättningsanalys, laktatdehydrogenasfrisättningsanalys, bioluminescerande avbildningsanalys, realtidsimpedansbaserad cellanalys och cellbaserad flödescytometrianalys 4,5. Den fluorescerande avbildningsbaserade plattformen som beskrivs här identifierar antalet levande kontra döda celler, vilket är en direkt kvantifiering av T-cellscytolys i motsats till en indirekt metod för att utvärdera cytolysen av T-celler.
Här är en enkel, kostnadseffektiv, snabb och hög genomströmningsteknik med minimalt ingrepp för att utvärdera cytotoxiciteten hos Jurkat-celler som uttrycker epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) CAR mot MDA-MB-231 trippelnegativ bröstcancer (TNBC) celler och EGFR CRISPR slår ut MDA-MB-231-celler. Jurkat-celler är odödliga humana T-lymfocytceller6 som har använts i stor utsträckning för att studera T-cellsaktivering och signaleringsmekanismer7. Dessutom har Jurkat-celler använts för in vitro CAR-testning i flera studier 8,9,10,11. Jurkat-celler transduceras lätt av lentivirus och har en fördröjd proliferation, och detta system utnyttjades för att optimera gångjärnsdomänen för olika EGFR CAR-konstruktioner.
Denna analys kan användas för screening av flera CAR-konstruktioner som riktar sig mot olika tumörantigener och användas mot flera vidhäftande tumörcellinjer och i olika effektor-till-tumör-förhållanden (E:T). Dessutom kan flera tidpunkter utvärderas, och antalet replikat kan modifieras för att identifiera bästa dödande bland de olika CAR-konstruktionerna. De bästa konstruktionerna måste bekräftas med hjälp av perifera mononukleära celler (PBMC) härledda CD3 T-celler. Det övergripande målet bakom utvecklingen av denna metod är att snabbt optimera CAR-gångjärnsgeometrin på ett sätt med hög genomströmning och övervinna hinder som låg transduktionseffektivitet, följt av bekräftelse i PBMC-härledda T-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Allt cellodlingsarbete utförs i ett biosäkerhetsskåp med labbrock, handskar och enligt standard aseptiska tekniker.
1. Generering av CAR som uttrycker Jurkats (CAR-J)
- Köp Jurkat-celler, klona E6-1 från ATCC. Tina 1 x 106 celler i en T-75-kolv och odla dem i T-75-kolvar. Behåll dem i suspension vid 0,6 x 106 celler per ml med hjälp av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media kompletterat med 10 % FBS i en inkubator vid 37 °C med 5 % CO2 .
- Platta 1 x 105 Jurkat-celler per brunn i en vävnadskultur som behandlats med 24 brunnar i 500 μl RPMI-odlingssubstrat innehållande 4 μg/ml polybren som ökar lentiviral effektivitet. Räkna celler med hjälp av en laserbaserad bänkcellanalysator för fluorescerande detektion. Antalet brunnar beror på antalet konstruktioner som ska utvärderas. I det här exemplet används 4 konstruktioner och en kontroll som inte transduceras. CAR-konstruktionens konstruktion visas i tabell 1.
- Tillsätt 10 μl lentivirus/brunn i varje CAR-konstruktion. CAR konstruktion design och lentivirusproduktion gjordes som beskrivits tidigare12.
- Tillsätt nästa dag 1 ml tillväxt-RPMI-media till varje brunn och fortsätt odlingen i inkubatorn vid 37 °C med 5 % CO2 .
- Samla in cellerna 2 dagar senare (totalt 72 timmar efter Jurkat-transduktionen) och räkna dem.
- Ta 1 x 104 celler för löpande flöde för att bekräfta CAR-uttrycket på Jurkat-cellerna. Tvätta kortfattat cellerna 2 gånger med FACS-färgningslösning (FSS) innan du märker CAR-J med antikroppar riktade mot Flag-taggen som används för att upptäcka CAR-positivitet i 30 minuter i mörker vid 4 °C. Tvätta 2 gånger igen med FSS och kör cellerna genom en flödescytometer som tidigare beskrivits12. Använd antikroppskoncentration enligt tillverkarens rekommendationer.
- Jurkat-celler är lätta att transducera och visar nästan alltid >90% CAR-uttryck. Producera CAR-J långt före samodlingens cytotoxicitetstest och frys ned för senare användning.
2. Plätering av CFSE-märkta tumörceller
OBS: MDA-MB-231 (från ATCC, HTB-26) celler var en gåva från en medarbetare, och EGFR KO MDA-MB-231 skapades som tidigare beskrivits12.
- Tina 1 x 106 celler i en T-75-kolv och odla dem i T-75-kolvar. Behåll MDA-MB-231 tumörceller och CRISPR EGFR KO MDA-MB-231 tumörceller i 14 ml av Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS) i en inkubator vid 37 °C med 5 % CO2 och dela när cirka 70 % konfluent.
- Observera vidhäftande tumörceller under vanligt ljusfältsmikroskop för att säkerställa nästan 70 % sammanflöde.
- Avlägsna odlingssubstratet från kolven med hjälp av en serologisk pipett. Tillsätt 3 ml trypsin till T75-kolven och placera i en inkubator vid 37 °C med 5 % CO2 i 3–5 minuter för att lossa cellerna från kolven.
- Neutralisera trypsin med lika stor mängd (3 ml) odlingssubstrat. Samla upp cellsuspensionen i ett centrifugrör och snurra ner cellerna med 400 x g i 4 minuter för att pelletera ner cellerna.
- Kassera supernatanten med hjälp av en pipett och återsuspendera cellerna i 2 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Bestäm cellkoncentrationen med hjälp av en cellräknare.
- Överför 8 x 105 celler till ett annat 15 ml rör och tillsätt PBS för att göra det till en volym av 1 ml.
- Tillsätt 2 μl karboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE; 5 μM stamkoncentration) i varje rör och blanda väl med en 1 ml pipett.
- Inkubera cellerna med CFSE i 20 minuter i inkubatorn vid 37 °C med 5 % CO2 . Ta ut rören ur inkubatorn efter 20 minuter och tillsätt 5 ml odlingsmedia till röret.
- Centrifugera rören vid 400 x g i 4 minuter för att pelletera ner de CFSE-märkta cellerna. Kassera supernatanten med en pipett och tillsätt 1 ml färskt medium för att återsuspendera cellerna.
- Omvärdera cellkoncentrationen med hjälp av en cellräknare. Överför 4 x 105 celler till en 25 ml reagensbehållare och tillsätt media för en total volym på 8 ml.
- För att säkerställa tillräcklig volym för att så 5000 tumörceller/brunn i 100 μL media, volym som behövs för att kunna pipettera med flerkanalspipetten, och för att kompensera för förlusten av några celler under steg 1.7, förbered 10%-20% extra celler och mediavolym.
- Blanda cellsuspensionen noggrant med en 5 ml serologisk pipett. Använd en 100 μL flerkanalspipett och pipettera 100 μL av cellsuspensionen i varje rad på den genomskinliga platta svarta 96-brunnsplattan med platt botten på den vänstra halvan. Ett exempel på en pläteringsstrategi finns i tabell 2.
- Pipettera EGFR KO-celler på samma sätt på den högra halvan av plattan. När hela plattan är pläterad, dra plattan fram och tillbaka och sida till sida på vävnadsodlingskåpans plattform för att säkerställa jämn fördelning av tumörcellerna i brunnarna.
- Inkubera plattan i 4 timmar i inkubatorn vid 37 °C med 5 % CO2 för tumörcellerna att fästa.
3. Samodling av CAR-uttryckande Jurkats med CFSE-märkta tumörceller
- Med hjälp av räkningen av icke-transducerade och CAR-uttryckande Jurkat-celler, överför 4 x 105 celler av varje CAR-J till en 25 ml reservoar. Tillsätt DMEM-odlingsmedia för en total volym på 2 ml.
- För E:T på 4:1 tillsattes 2 x 104 CAR-J per brunn i 100 μL media med hjälp av en flerkanalspipett försiktigt längs sidan av varje brunn för att inte störa de tumörceller som är fästa.
- Tillsätt ytterligare 100 μl odlingssubstrat med hjälp av en flerkanalspipett vid sidan av brunnar som innehåller tumörceller och Jurkat-celler. Tumörgrupperna får endast 200 μL media för att få totalt 300 μL media i alla brunnar.
- Dra plattan längs plattformen fram och tillbaka och från sida till sida för att säkerställa en jämn fördelning av Jurkat-cellerna på tumörcellerna.
- Låt samodlingen ske i inkubatorn vid 37 °C med 5 % CO2 i 48 timmar.
4. Förberedelse av plåt för avbildning
- Gör en lösning av propidiumjodid (PI) vid 1 μg/ml i lågbakgrundsfluorescensmedium baserat på antalet brunnar och var och en får 100 μL media.
- För 84 brunnar bereds 9 ml media som innehåller PI. Blanda mediet ordentligt med en pipett.
- Gör 10 ml 20 % Triton-X-lösning genom att späda Triton-X med avjoniserat vatten. Efter 48 timmars samodling kasseras supernatanten som innehåller CAR-J genom att vända upp och ner på plattan och knacka på hushållspapper.
- Tillsätt nu 100 μl ovan preparerat medium (steg 4.2) som innehåller PI i varje brunn med hjälp av en flerkanalspipett försiktigt för att inte störa de vidhäftade tumörcellerna.
- Tillsätt 20 μl 20 % Triton-X-lösning till den första brunnen av varje tumörtyp som fungerar som en total död kontroll.
- Låt tallriken stå i inkubatorn i 20 min. Avbilda plattan med hjälp av den fluorescerande avbildningscytometern. Data lagras på datorn och kan analyseras vid ett senare tillfälle.
5. Analysera fluorescerande bilder
- Använd en av tumörens enda brunn av celler för att ställa in den gröna fluorescerande kanalen.
- Minska brunnsmasken till 98 % för att ta bort cellerna på brunnens kant eftersom signalen inte är perfekt på kanten.
- Identifiera CFSE-märkta tumörceller på den gröna, fluorescerande CFSE-kanalen. Ändra tröskelvärdet för fluorescensintensitet för att plocka upp alla celler i brunnen.
- Ställ in den minsta celldiametern till 25 μm för att ta bort eventuellt skräp som upptäcks på CFSE-kanalen. Detta varierar beroende på vilken celltyp som analyseras.
- Aktivera Separata beröringsobjekt för att identifiera enskilda celler när de är i kontakt med varandra.
- Välj CFSE på bildvisningen och titta på det grafiska överlägget för att ta reda på vad som väljs av systemet.
- När CFSE-märkta celler plockas upp på rätt sätt, ställ in grindar för att definiera levande kontra döda cellpopulationer.
- Välj de CFSE-märkta cellerna och generera ett histogram över antalet på y-axeln jämfört med genomsnittlig PI-intensitet på x-axeln.
- Baserat på brunnen där vi tillsatte Triton-X (steg 4.5), rita en splitter för att skilja celler med låg PI-färgning och celler med hög PI-färgning. Denna brunn bör ha de flesta cellerna i ett område med hög PI-färgning.
OBS: PI visar basalsignalen på levande celler. Att tillsätta Triton-X dödar därför alla celler och de färgas starkt i den röda fluorescerande kanalen. Detta gör det lättare att dra grindar för att separera döda celler från levande celler. - Justera x-axelns värde för att bättre kunna visa cellerna. Märk nu de låga PI-färgade cellerna som levande celler.
- Markera Live-cellerna och ange ett annat histogram med area på x-axeln och antal på y-axeln.
- Rita en annan splitter med hjälp av tumören bara väl för att fånga celler och inte skräp. Jurkat-behandlade brunnar kommer att börja ackumulera skräp som kommer att vara CFSE-färgade och måste tas bort från räkningarna. De återstående icke-skräpen är märkta som "stora celler".
- Kör analysen på hela plattan och exportera kalkylbladet som innehåller siffrorna.
- Plotta de stora räkningarna för att identifiera antalet levande CFSE-märkta tumörceller som finns kvar i brunnen efter exponering för CAR-J. Bestäm statistik med hjälp av envägs ANOVA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett intervall av E:T-kvot mellan 1:8 och 8:1 för CAR-J1 utvärderades vid 72 timmar, vilket riktade sig mot EGFR på TNBC MDA-MB-231-celler. Jurkat-celler transducerades med CAR-lentivirus med polybrene för att generera CAR-J-celler enligt beskrivningen i steg 2. Cytotoxiciteten för CAR-J1 ökade signifikant med högre E:T-kvot utan skillnad i avdödning vid förhållandet 1:8 (Figur 1). Mer än 50 % avlivning observerades vid 4:1 E:T under 72 timmar. Denna E:T användes för efterföljande experiment med varaktighet reducerad till 48 timmar för snabb cytotoxicitetsutvärdering av multipla CAR-konstruktioner. EGFR som riktar sig mot CAR-konstruktioner med modifierad gångjärnsdomän utformades (tabell 1). De 4 olika gångjärnen som används är IgG lång, IgG medium, IgG kort och CD8a som beskrivs här13. Dessa 3 konstruktioner uttrycktes på Jurkat-celler och CAR-positivitet bestämdes genom att utvärdera procentandelen Flag-märkta celler med flödescytometri (Figur 2A-D) som beskrivs här12. Otransducerade Jurkat-celler användes som kontrollgrupp för att bestämma CAR-uttryck och gating-strategin visas i (Figur 2E). Cytotoxiciteten hos dessa 4 CAR-konstruktioner uttryckta på Jurkat-celler utvärderades mot EGFR-uttryckande MDA-MB-231-celler och CRISPR EGFR KO MDA-MB-231-celler. Antigenspecifik avdödning observerades av alla konstruktörer (Figur 3A) medan det inte observerades någon signifikant avdödning mot EGFR KO-celler (Figur 3B), vilket tyder på att avdödandet specifikt förmedlades enbart genom scFv. Det förekom inget dödande av de icke-transducerade Jurkat-cellerna. Representativa bilder av tumördödande visas också där överlappningen av CFSE-märkta tumörceller med PI-färgade döda kärnor gör att de ser gula ut (Figur 4). Data är representativa för 3 oberoende experiment med 6 tekniska replikat per grupp.
Detta bekräftades ytterligare genom att uttrycka dessa CAR-konstruktioner på PBMC-härledda CD3 T-celler. Det finns lågt uttryck av CAR på CD3 T-celler som sedan anrikas genom steril flödessortering (figur 5). Det fanns dock inget uttryck för CD8-gångjärn som innehöll EGFR CAR. Därför utvärderades de andra 3 CAR-konstruktionerna innehållande IgG long, IgG medium och IgG short för deras cytotoxiska potential mot MDA-MB-231-celler. Det finns en liknande trend av dödande där IgG-kort har den lägsta cytotoxiska styrkan jämfört med de andra 2 konstruktionerna (Figur 6). För att identifiera den bästa konstruktionen bland IgG långa och IgG medium CAR-T-celler, utvärderades deras aktivering med och utan exponering för TNBC-tumörceller genom intracellulär färgning av cytokiner som beskrivits tidigare12. MDA-MB-436 har låga nivåer av EGFR och MDA-MB-468 har det högsta EGFR-proteinuttrycket baserat på en western blot med en panel av 13 TNBC-cellinjer12. IgG långa CAR-T-celler hade de lägsta basala aktiveringsnivåerna (TNFa, 4-1BB) och låg frisättning av cytotoxiska granuler (perforin och granzym B)14 utan någon exponering för tumörceller (Figur 7). Vid exponering för MDA-MB-468-celler som uttrycker hög EGFR hade IgG långa CAR-T-celler den högsta aktiveringen baserat på TNFa och 4-1BB.
Figur 1: EGFR CAR-J1 cytotoxisk utvärdering längs ett intervall av E:T. CFSE-märkta MDA-MB-231-tumörceller pläterades med icke-transducerade Jurkat-celler eller EGFR riktade mot CAR-J1 vid E:T-förhållandet 1:8, 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1 och 8:1 som visade ökande cytotoxicitet med högre effektorceller. Data representeras som medelvärde ± SD och statistisk signifikans utvärderades med hjälp av Students t-test. 1:8 E:T var icke-signifikant, 1:4 E:T hade ***p<0.001 och vila ****p<0.0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: EGFR CAR Jurkat-produktion för cytotoxisk utvärdering in vitro . (A-D) Nästan 90%-100% CAR-uttryck av 4 olika konstruktioner CAR IgG lång, CAR IgG medium, CAR IgG kort, CAR CD8a. E) Gating-strategi för bestämning av CAR-positivitet: Vrakdelar uteslutna i SSC-A-området jämfört med FSC-A-området. Enstaka celler valda i FSC-H vs FSC-A-diagrammet; och levande celler selekterade genom viabilitetsfärgämne DAPI negativ gating. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Cytotoxicitetsutvärdering vid samodling av CAR-J- och CFSE-märkta tumörceller. (A) CFSE-märkta MDA MB 231-celler pläterades med CAR-J vid 4:1 E:T-förhållande under 48 timmar, vilket visade varierande effekt vid avdödning av tumörceller. (B) CFSE-märkta CRISPR EGFR KO MDA MB 231-celler avlivades inte av någon av CAR-J-cellerna. Data representeras som medelvärde ± SD och statistisk signifikans utvärderades med hjälp av envägs ANOVA. **p<0,01; s<0,0001; NS: Inte signifikant. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Visuell representation av bilder efter 48 timmars samodling. (A) Grupp med enbart tumör med CFSE-märkta (gröna) tumörceller. (B) Addition av icke-transducerade Jurkat-celler med röda blodkroppar som de döda Jurkat-cellerna och (C) överlagring av gröna och röda indikerar döda tumörceller (gula) som visas med pilar. Antalet gröna blodkroppar som inte är gula kvantifieras. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: EGFR CD3 CAR-T-cellanrikning. (A-B) CAR-uttryck utvärderat genom bestämning av procentandelen Flag-positiva och IgG-positiva celler före anrikning och (C) efter anrikning genom steril flödessortering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Cytotoxicitetsutvärdering vid samodling av CD3 CAR-T- och CFSE-märkta tumörceller. CFSE-märkta MDA MB 231-celler pläterades med CAR-J vid 4:1 E:T-förhållande i 48 timmar, vilket visar varierande effektivitet vid avdödning av tumörceller. Data representeras som medelvärde ± SD och statistisk signifikans utvärderades med hjälp av envägs ANOVA. **p<0,01; s<0,0001; NS: Inte signifikant. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Aktivering av EGFR CD3 CAR-T-celler. CAR-T-celler exponerades för tumörceller och intracellulära cytokinnivåer för (A) TNFa, (B) 4-1BB, (C) perforin och (D) granzym B utvärderades. Data representeras som medelvärde ± SD och statistisk signifikans utvärderades med hjälp av envägs ANOVA *p<0,05; **p<0,01; **p<0,001; s<0,0001; NS: Inte signifikant. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Nej. av PA EGFR806 scFv | Vh-Vl Linker | Gångjärn/distans | TM | Cytoplasmatisk |
| BIL IgG Lång | Whitlow (18 aa) | IgG4 EQ CH2 CH3 (229 aa) | CD4 | 4-1BB / CD3z |
| BIL IgG Medium | Whitlow (Väkting) | IgG4 CH3 (129 aa) | CD28 | 4-1BB / CD3z |
| CAR IgG Kort | Whitlow (Väkting) | IgG kort (12 aa) | CD4 | 4-1BB / CD3z |
| BIL CD8a | Whitlow (Väkting) | CD8 (45 aa) | CD8a | 4-1BB / CD3z |
Tabell 1: CAR-konstruktionskonstruktioner. Förkortningar: aa = aminosyror; TM = Transmembran.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | Triton-X | Endast MDA MB 231 | Triton-X | MDA MB 231 EGFR KO Endast | ||||||||
| B | MB231 + Mock 4:1 | MB231 EGFR KO + Mock 4:1 | ||||||||||
| C | MB231 + EGFR IgG Lång 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Lång 4:1 | ||||||||||
| D | MB231 + EGFR IgG Medium 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Medel 4:1 | ||||||||||
| E | MB231 + EGFR IgG Kort 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR IgG Kort 4:1 | ||||||||||
| F | MB231 + EGFR CD8a 4:1 | MB231 EGFR KO + EGFR CD8a 4:1 | ||||||||||
| G | ||||||||||||
| H | ||||||||||||
Tabell 2: Exempel på pläteringsstrategi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi föreslagit en snabb metod för att effektivt utvärdera den målspecifika cytolytiska aktiviteten som induceras av CAR-uttryck i Jurkat-celler. Alla CAR-konstruktioner har samma scFv men olika gångjärns- och transmembrandomäner som har visat sig påverka CAR-T-cellernas styrka13. Ytterligare utvärdering av icke-specifik avdödning av dessa CAR-J gjordes genom att odla dem med antigen knock out (KO) celler. Detta visar att avdödandet är tumörantigenspecifikt och inte beror på basal aktivering av CAR-J. Den cytotoxiska potentialen för en rad E:T-förhållanden kan enkelt bestämmas genom att identifiera det minsta antalet effektorceller som krävs för att eliminera tumörceller vid specifika tidpunkter. Flera cellinjer från samma eller olika cancertyper och normala celler kan också användas för att utvärdera specificiteten hos dessa konstruktioner. De mest potenta kandidaterna som identifierats av CAR-J-plattformen kan sedan karakteriseras ytterligare genom att uttrycka CAR på PBMC-härledda CD3 T-celler och utföra liknande dödande analyser och utvärdera utmattning och aktivering vid exponering för antigenpositiva och negativa tumörceller.
Det måste noteras att Jurkat-celler är CD4+-celler med en förändrad T-cellsreceptor (TCR) signalväg15. Därför bör intracellulär optimering av CAR-konstruktörer helst göras med CD3 T-celler16 och kanske inte fungerar bäst med Jurkat-celler. Intressant nog uppvisar CD4 T-celler cytotoxicitet, vilket visats i en tidigare publikation där EGFR riktade mot CD4 CAR-T-celler med IgG långa gångjärn helt kan utrota TNBC-tumörer i en intrakraniell tumörmodell12. Dessutom visar CD4 CAR T-celler långsiktig styrka och bättre dödning jämfört med blandning av CD4- och CD8 T-celler eller CD8 T-celler ensamma i GBM-tumörmodellen, vilket gör dem till kliniskt viktiga T-celler för effektiv CAR-T-terapi17.
Jurkat-celler producerar IL2 och uppreglerar CD69 vid aktivering, även om de inte utsöndrar alla cytokiner för primär T-cellsaktivering 8,18. Utvärdering av IL2- och CD69-nivåer informerar dock om att Jurkat-cellerna aktiveras och inte om den direkta cytolysen av målceller som kvantifieras i absoluta tumörcellantal genom detta tillvägagångssätt. Utvärdering av cytotoxicitet och aktivering är dock viktigt för att fullt ut förstå effekterna av nya CAR-molekyler.
Samkulturens varaktighet i det här experimentet kan modifieras baserat på de konstruktioner som används. CFSE-märkning på tumörceller visade sig vara detekterbar fram till 4 dagar efter plätering. För att uppnå ett högt signal-brusförhållande utfördes experiment inom 72 timmar. Eftersom CFSE-intensiteten minskar vid delning av tumörceller, kan mängden CFSE som används och varaktigheten behöva ändras beroende på vilka tumörceller som används. Eftersom detta är ett experiment med hög genomströmning för att analysera flera konstruktioner åt gången, måste såddtätheten för målceller i en 96-brunnsplatta också optimeras. Målcellerna måste underhållas så att de inte växer för mycket eller har en konkurrenskraftig tillväxtbegränsning i slutet av analysen utan att behöva byta medium för att minimera eventuella ingrepp. Större brunnsplattor kan användas för att rymma fler celler och öka experimentets livslängd. Bilderna måste dock sys för att få en fullständig bild av brunnen och varje brunn måste bearbetas individuellt, vilket kanske inte gör det snabbt och högt genomströmning.
Ett annat tillvägagångssätt för långvarig fluorescerande märkning av tumörceller är genom lentiviral transduktion med grönt fluorescerande protein (GFP) eller rött fluorescerande protein (RFP). Korrekt klonalt urval måste göras för att välja höganrikade (nästan 100%) ljusaste kolonier för bästa signal-brusförhållande. Viabilitetsfärgämnet måste väljas på lämpligt sätt baserat på fluorescerande detektorer i bildinstrumentet.
Bakgrundsfluorescens beror på vilket medium som används och måste därför kontrolleras för att undvika signalförlust vid bildtagning. Vanliga medier innehåller komponenter som avger betydande fluorescens när de exciteras. Vi rekommenderar att du använder ett material med låg bakgrundsnivå19. PBS kan användas men det kan påverka cellerna under bildhämtning eftersom det tar ungefär 20 minuter att hämta bilder beroende på inställningarna för att ta bilder.
En av begränsningarna med denna analys är att inte kunna ta bilder vid flera tidpunkter av samma 96-brunnsplatta efter tillsats av ett livskraftsfärgämne. Effekten av tillsats av PI över lång tid utvärderades inte för denna publikation. Det skulle dock vara idealiskt att kunna detektera levande och döda/döende målceller under en period med hjälp av samma platta. Det kan vara svårt att separera enskilda celler om cellerna blir för sammanflytande. Arean av cellens monolager och fluorescensintensiteten kan användas för att jämföra procent av cellerna levande/döda enligt beskrivningen20.
Alternativa metoder som används för att detektera cytolys med CAR-T-celler mäter inte direkt det absoluta antalet döda och levande celler, utan utvärderar snarare styrkan med indirekta metoder som beskrivs i detalj på annan plats 4,5. Så denna metod ger en absolut redogörelse för effektorceller och kan användas i samodling av 3 celltyper samt beroende på kapaciteten hos avbildningsinstrumentet. Det krävs väldigt få celler (5000 per brunn) som kan förändras tillsammans med friheten att välja en tidpunkt, vilket är stora fördelar med att använda denna analys. Målceller i suspension och i 3-dimensionell sfäroidodling kan också användas i odling med effektorceller och cytolys bestäms enligt beskrivningen på annan plats21. Dessutom kan denna plattform användas för att screena stora bibliotek av små molekyler och föreningar för att avgränsa de mest effektiva molekylerna och multipel dosering kan göras vid flera tidpunkter.
Förutom systemets snabbhet och flexibilitet är den slutliga fördelen kostnaden. Den fluorescerande bildmaskinen, plattorna och reagenserna är alla vanliga och prisvärda att köpa, särskilt jämfört med enheter som är mer sofistikerade och till och med kan använda ädelmetaller i sina engångsplattor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
MDA-MB-231 var en vänlig gåva från Dr. Shane Stecklein. Författarna erkänner finansiering från University of Kansas Cancer Center för att genomföra denna forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Conical Tube (Sterile) | Midwest Scientific | #C15B | Any similar will work |
| 50 mL Conical Tube (Sterile) | Thermo Scientific | 339652 | Any similar will work |
| Black/Clear 96 well plate | Falcon | 353219 | Celligo has a list of compatible plates |
| Celigo 4 Channel Imaging Cytomenter | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | Any similar will work |
| Celigo Software | Nexcelcom Bioscience | Version 5.3.0.0 | Any similar will work |
| Cell Culture Incubator | Thermo Scientific | HeraCell 160i | Any similar will work |
| Cell Culture Treated Flasks (T75, various sizes, Sterile) | TPP | 90076 | Any similar will work |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | Any similar will work |
| Cytek Muse Cell Analyzer | Cytek | 0500-3115 | Any similar will work |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | Any similar will work |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | Any similar will work |
| Flow Cytometer | Cytek, BD, etc | Aurora, LSR II, etc | Any similar will work |
| FlowJo Sortware | Becton Dickinson & Company | Version 10.7.1 | Any similar will work |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | Any similar will work |
| GraphPad Software | GraphPad | Version 9.3.1 (471) | Any similar will work |
| Multichanel Pipette | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| PBS | Gibco | 10010-031 | Any similar will work |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | Any similar will work |
| Pipette tips (Sterile, filtered, 1 mL, Various sizes) | Pr1ma | PR-1250RK-FL, etc | Any similar will work |
| Pipettors | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | Any similar will work |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | Any similar will work |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | Any similar will work |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | Any similar will work |
| Serological Pipettes (Sterile, various sizes) | Pr1ma | PR-SERO-25, etc | Any similar will work |
| Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-CI | Any similar will work |
| Sterile Reservoirs | Midwest Scientific | RESE-2000 | Any similar will work |
| Table top centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any similar will work |
References
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049 (2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69 (2021).
- Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Methods in Cell Biology. 167, Academic Press. 81-98 (2022).
- Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
- Schneider, U., Schwenk, H. U., Bornkamm, G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma. Int J Cancer. 19 (5), 621-626 (1977).
- Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nat Rev Immunol. 4 (4), 301-308 (2004).
- Bloemberg, D., et al. A high-throughput method for characterizing novel chimeric antigen receptors in Jurkat cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 238-254 (2020).
- Lipowska-Bhalla, G., Gilham, D. E., Hawkins, R. E., Rothwell, D. G. Isolation of tumor antigen-specific single-chain variable fragments using a chimeric antigen receptor bicistronic retroviral vector in a Mammalian screening protocol. Hum Gene Ther Methods. 24 (6), 381-391 (2013).
- Alonso-Camino, V., et al. CARbodies: Human antibodies against cell surface tumor antigens selected from repertoires displayed on T cell chimeric antigen receptors. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (5), e93 (2013).
- Jahan, F., et al. Using the Jurkat reporter T cell line for evaluating the functionality of novel chimeric antigen receptors. Front Mol Med. 3, 1070384 (2023).
- Subham, S., et al. EGFR as a potent CAR T target in triple negative breast cancer brain metastases. Breast Cancer Res Treat. 197 (1), 57-69 (2023).
- Guedan, S., Calderon, H., Posey, A. D. Jr, Maus, M. V. Engineering and Design of Chimeric Antigen Receptors. Mol Ther Methods Clin Dev. 12, 145-156 (2019).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Rev Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Shan, X., et al. Deficiency of PTEN in Jurkat T cells causes constitutive localization of Itk to the plasma membrane and hyperresponsiveness to CD3 stimulation. Mol Cell Biol. 20 (18), 6945-6957 (2000).
- Wu, W., et al. Multiple signaling roles of CD3ε and its application in CAR-T cell therapy. Cell. 182 (4), 855-871 (2020).
- Wang, D. Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity. JCI Insight. 3 (10), e99048 (2018).
- Haggerty, T. J., Dunn, I. S., Rose, L. B., Newton, E. E., Kurnick, J. T. A screening assay to identify agents that enhance T-cell recognition of human melanomas. Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 187-201 (2012).
- Spencer, V. A., Kumar, S., Paszkiet, B., Fein, J., Zmuda, J. F. Cell culture media for fluorescence imaging: Striking the right balance between signal strength and long-term cell health. Genetic Engineer Biotech News. 34 (10), 16-18 (2014).
- Immune Cell Killing Assays for Live-Cell Analysis. , https://www.sartorius.com/en/applications/life-science-research/cell-analysis/live-cell-assays/cell-function/immune-cell-killing (2023).
- Kessel, S., et al. High-throughput 3D tumor spheroid screening method for cancer drug discovery using celigo image cytometry. SLAS Technol. 22 (4), 454-465 (2017).
