Large-Scale-Bildschirme von Metagenombanken

Summary

Abstract

Metagenombanken Archivierung großer Fragmente des angrenzenden genomischen Sequenzen von Mikroorganismen ohne vorherige Kultivierung. Erstellen eines vereinfachten Verfahrens für die Erstellung und Screening Metagenombanken ist daher für eine effiziente Hochdurchsatz-Untersuchungen der genetischen und metabolischen Eigenschaften von unkultivierten Mikroorganismen Assemblagen nützlich. Hier werden die wichtigsten Protokolle auf Video, was wir vorschlagen, ist die nützlichste Format für die genaue Beschreibung eines langen Prozesses, der abwechselnd hängt von Roboter-Instrumenten und (menschlichen) manuelle Eingriffe vorgestellt. Zunächst beschäftigten wir Robotik bis zur Bibliothek Klone auf High-Density-Makroarray Membranen, von denen jedes Duplikat Kolonien 20-4 384-well Platten-Bibliothek enthalten kann vor Ort. Automation ist für dieses Verfahren nicht nur für die Genauigkeit und Geschwindigkeit, sondern auch aufgrund der Miniaturisierung der Maßstab erforderlich, um die große Anzahl von Bibliotheks-Klone in sehr dichten räumlichen Anordnungen fit. Einmal erstellt, wir als nächstes gezeigt, wie die Makroarray Membranen für Gene von Interesse unter Verwendung von modifizierten Versionen der Standard-Protokolle für Sondenmarkierung, Membran-Hybridisierung und Signalerkennung gescreent werden können. Wir ergänzten die bildliche Darstellung dieser Verfahren mit ausführlichen schriftlichen Beschreibungen der einzelnen Schritte und die benötigten Materialien, die alle online verfügbar neben dem Video sind.

Protocol

1. Hybridisierung Verfahren

Eine Hybridisierung Rohr dauert 1 oder 2 Membranen (Größe 22 x 22 cm). Verwenden Sie 50 ml der Hybridisierung Mischung und 0,5 mg DNA-Sonde (10 ng / ml Endkonzentration) pro Hybridisierung Röhre. Für die besten Ergebnisse erzielen Sie mit Gel-gereinigtes DNA als Sonde. Wenn Scaling-up-Sonde Vorbereitung, Erhöhung der Anzahl der Röhren anstatt die Erhöhung der Menge von Reagenzien pro Röhre.

Probe Vorbereitung (0,5 mg DNA):

1. Verdünnen Sie 15 ul Vernetzer-Lösung mit 60 l Wasser.
2. Verdünnen DNA zu 10 ng / ul mit Wasser auf 50 ul Gesamtvolumen in einem Schraubverschluss Mikroröhrchen.
3. Denaturieren DNA für 5 min in kochendem Wasser.
4. Schnell auf Eis zu übertragen und lassen Sie für 5 min abkühlen lassen. Spin kurz.
5. Dann werden 50 ul Reaktionspuffer und vorsichtig mischen.
6. Add 10 ul Markierungsreagens und vorsichtig mischen.
7. Dann werden 50 ul der verdünnten Vernetzer-Lösung aus Schritt 1 und vorsichtig mischen. Vortexen und Spin kurz.
8. Bei 37 ° C für 30 min.
9. Keep on ice für bis zu 2 h oder fügen Sie ein gleiches Volumen von 100% Glycerin und bei -20 ° C.
   
   Hinweis: Verwenden Sie das Wasser mit dem Kit geliefert. Bewahren Sie alle Reagenzien auf Eis soweit nicht anders angegeben.

Präparation und Hybridisierung

1. Vorheizen 50 ml Hybridisierungspuffer und Hybridisierung Rohr bis 60 ° C.
2. Fügen Sie die Hybridisierungspuffer auf die Hybridisierung Röhre. Roll up-Membran (s) und fügen Sie die Hybridisierung Röhre. (Wenn man 2 Membranen pro Röhre, zuerst aufrollen einer Membran vollständig, dann rollen die andere Membran auf der Oberseite in die gleiche Richtung.)
3. Inkubieren Hybridisierung Rohr bei 60 ° C für mindestens ½ h. (Stellen Sie sicher, Membran (en) gründlich zu bekommen getränkt.)
4. Transfer ca. 1 ml Hybridisierungspuffer mit einer langen Pipette aus der Hybridisierung Rohr auf die Tube mit der markierten Sonde. Vortexen und Spin kurz. Transfer-Mischung zurück zur Hybridisierung Röhre.
5. Inkubation bei 60 ° C über Nacht.
   
   Hinweis: Verwenden einer Pinzette und Handschuhe beim Umgang mit Membranen. Mix Inhalt der Hybridisierung Röhrchen leicht, weil zu viel Unruhe verursachen permanente Bildung von unerwünschten Schaum. Die Membranen sollten im nassen Zustand hinzugefügt werden; einweichen in Hybridisierungspuffer oder Wasser, wenn nötig und abtropfen überschüssige Flüssigkeit vor der Zugabe.

2. Nachweisverfahren

Washing Membranen

1. Vorheizen primären Waschpuffer bis 60 ° C. (Verwenden Mikrowelle und / oder Heizplatte.)
2. Wenn es 2 Membranen in einer Hybridisierung Rohr, Transfer einer Membran auf eine saubere, vorgewärmte, leere Hybridisierung Röhre.
3. Kurz spülen Hybridisierung Rohr mit etwa 50 ml des primären Waschpuffer.
4. Fügen Sie etwa 100 ml des primären Waschpuffer Hybridisierung Rohr und Inkubieren bei 60 ° C für 10 min.
5. Wiederholen Sie die Schritte 3 und 4.
6. Transfer-Membran Spülbehälters und inkubieren mit mindestens 250 ml des sekundären Waschpuffer bei Raumtemperatur für 5 min.
7. Wiederholen Sie Schritt 6.
   
   Hinweis: Die Membranen können in der sekundären Waschpuffer bei Raumtemperatur aufbewahrt werden bis zu ½ h vor Signalerzeugung.

Signalerzeugung und Detektion (Verfahren für eine Membran)

1. Band zwei Stücke von SaranWrap flach auf die Tischplatte (für Stufe 2 und eine für Schritt 4).
2. Sorgfältig abtropfen überschüssige Puffer von der Membran durch Berühren der Ecken der Membran gegen die Seite des Behälters und der Membranfilter auf die SaranWrap (sample Seite nach oben).
3. Gießen Sie 6-7 ml der ECF-Reagenz über Membran und falten Saran Wrap über Membran. Sorgfältig verteilen ECF Reagenz über Membran durch leichtes Verschieben einer Kimwipe über die SaranWrap. Inkubieren für 5 min.
4. Ablassen über ECF-Reagenz von der Membran und übertragen sie auf neue SaranWrap, Falteinschlag über Membran, und die Ränder mit Klebeband. Decken Sie die Membran mit Aluminiumfolie. Inkubieren für 1-2 Stunden.
5. Bereiten Sie den Scanner Glasplatte durch die Verteilung von 1-2 ml ECF-Reagenz auf die Glasplatte. Übertragen Sie anschließend die Membran auf die Glasplatte (sample Seite nach unten) und verteilen noch 1-2 ml ECF-Reagenz über die Membran. Overlay mit SaranWrap und vorsichtig drücken alle Luftblasen entfernt von der Membran. (Sie können statt einer steifen Platte auf der Oberseite des SaranWrap die Membran gegen die Glasplatte gedrückt halten.)
6. Verwenden Sie den Fuji FLA-5100 Fluoreszenz-Scanner ("1-Laser 1 Bild"-Modus) mit folgenden Einstellungen: Anregung 473 nm, Filter zur Erkennung von LPB (510 nm), Auflösung 50 um, 16-Bit-Signal Abschluss CH1 400 V. (Scan dauert ca. 15-20 min pro Membran der Größe 22 x 22 cm.)
   
   Optional:
   
   
7. Lassen Sie es 2-4 Stunden (oder länger).
8. Wiederholen Sie scannen wie in Schritt 6.

3. Stripping-und Speichervorgang (NUF Version)

1. Transfer-Membran zu 100% ethanol und Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min unter leichtem Schütteln.
2. Ersetzen Sie mit frischen 100% Ethanol und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. (Membran kann in Ethanol für mehrere Tage zu bleiben.)
3. Ersetzen Ethanol mit destilliertem Wasser und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min.
4. Add 100 ml Wasser und 5 ml 10% SDS (final 0,5% SDS) zu einer Hybridisierung Rohr und vorsichtig mischen. Add-Membran.
5. Inkubation bei 80 ° C für 1 h.
6. Transfer-Membran, um eine saubere, leere Container.
7. Add 500 ml Wasser und 5 ml 10% SDS (final 0,1% SDS) ein Becherglas und Wärme zu einem kräftigen Kochen in der Mikrowelle.
8. Gießen Sie die Nähe siedende 0,1% SDS-Lösung über die Membran und schonend für einige Minuten rühren. Lassen Sie sich auf Raumtemperatur abkühlen.
9. Spülen Sie in mindestens 250 ml sterile 100 mM Tris pH 8 für mindestens 10 min.
10. Wrap-Membran in SaranWrap und sorgfältig zu schließen Kanten mit Bändern. Lagerung bei 4 ° C. (Membranen darf nie austrocknen.)

Discussion

Das Strippen Verfahren nicht optimiert wurde. Allerdings ist das Stripping in der Anleitung des Herstellers (2 Wäschen je 10 min in 100% Ethanol, 1 Wäsche von 1 h bei 60 ° C in 0,5% SDS) gegeben unzureichend. Mindestens Inkubation über Nacht in 100% Ethanol ist notwendig, um den ECF Reaktionsprodukt aufzulösen; mehreren Tagen Inkubation in 100% Ethanol scheint keine negativen Auswirkungen auf die Fähigkeit der Membran reprobe haben. Die vom Hersteller SDS-Behandlung scheint auch nicht ausreichen. NUF hat 1 h bei 80 ° C versuchte mit 0,5% SDS, gefolgt von einer Behandlung mit fast kochendem 0,1% SDS mit Erfolg. Tracy hat gezeigt, dass einmal Gießen-over mit fast kochendem 0,1% SDS ist ausreichend.

Hilfreiche Hinweise:
Der Hybridisierungspuffer, Hybridisierung Rohr und primären Waschpuffer muss bis 60 ° C vorgeheizt werden vor der Verwendung, und muss bei dieser Temperatur während des ganzen Experiments gehalten werden. Zum Beispiel halten die Puffer auf einer Heizplatte mit einer eingetauchten Thermometer auf einem Corning-Heizplatte, eine Einstellung von ca. 3 Ergebnissen in 60 ° C.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
AlkPhos Direct Labelling Reagents	kit	Amersham	RPN3680	Contains labeling reagent, cross-linker solution, reaction buffer, water, control DNA, hybridization buffer, blocking reagent. Store hybridization buffer and blocking reagent at room temperature, other reagents at 2-8°C.
ECF Substrate	kit	Amersham	RPN3685	Contains ECF substrate, ECF substrate dilution buffer.Note: Pack contains total 60 ml reagent; aliquot into 10 ml samples in Falcon tube and store at 20°C. Use about 10 ml per membrane (size of 22 by 22 cm).
20x Secondary Wash Buffer	buffer			121 g Tris(final 1 M), 117 g NaCl(final 2 M).Adjust pH to 10. Adjust to 1 L with water. Store at 2-8°C for up to 4 months.
0.5 M NaH2PO4 buffer pH 7	buffer			69 g NaH2PO4.H2O. Adjust pH to 7 with NaOH. Adjust to 1 L with water. Store at room temperature.
1 M MgCl2				50.8 g MgCl2.6H2OAdjust to 250 ml with water. Store at room temperature.
10% (w/v) SDS				20 g SDSAdjust to 200 ml with water. Store at room temperatur
Combination pack RPN3692 = RPN3680 + RPN3685