ड्रोसोफिला पुरुष गौण ग्रंथि विच्छेदन: माध्यमिक कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विधि

Overview

यह वीडियो पुरुष मक्खियों से सहायक ग्रंथियों के विच्छेदन का वर्णन करता है और एक उदाहरण दिखाता है जिसमें अलग ग्रंथि को एक एकल कोशिका निलंबन में अलग किया जाएगा।

Protocol

यह प्रोटोकॉल Immarigeon एट अलसे एक अंश है, एक FACS आधारित प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला पुरुष गौण ग्रंथियों, जे विस Exp. (२०१९) की माध्यमिक कोशिकाओं से आरएनए को अलग करने के लिए ।

1. समाधान और सामग्री की तैयारी

1. निम्नलिखित समाधान तैयार करें।
   1. सीरम सप्लीमेंटेड मीडियम (एसएसएम): श्नाइडर के ड्रोसोफिला माध्यम को 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरित किया गया है।
   2. 1x ट्राइप्सिन एंजाइम (जैसे, ट्रिप्ले एक्सप्रेस एंजाइम) के एलिकोट तैयार करें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
   3. पैपिन [50 यू/एमएल] (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और केवल एक बार गल) के aliquots तैयार करें ।
   4. 1x फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस, कमरे के तापमान पर संग्रहीत) तैयार करें।
2. गौण ग्रंथियों के शारीरिक वियोजन के लिए कई लौ गोल पिपेट युक्तियां तैयार करें।
   नोट: सहायक ग्रंथियों से निपटने के लिए कम प्रतिधारण युक्तियों का उपयोग करें क्योंकि वे अनुपचारित प्लास्टिक का पालन करते हैं। ज्वाला-गोलाई की प्रक्रिया टिप खोलने को कम करती है और टिप के किनारों को चिकना करती है। यह कोशिका झिल्ली को कतरन के बिना पेप्टिडास पाचन के बाद एक कुशल वियोजन सुनिश्चित करता है।
   1. एक तेज ब्लेड के साथ एक 200 μL टिप काटें और धीरे-धीरे इसे अपनी नोक को गोल करने के लिए एक लौ पर पास करें ताकि चरण 2.7 के दौरान हैंडलिंग के लिए उद्घाटन व्यापक लेकिन चिकनी हो।
   2. एक सेकंड से भी कम समय के लिए एक लौ के पास टिप खोलने गुजर द्वारा कई १,० μL युक्तियों के उद्घाटन संकीर्ण । अधिक पिघलने या क्लोजिंग से बचने के लिए टिप को थोड़ा घुमाएं। संकरा से व्यापक करने के लिए किए गए सुझावों को सॉर्ट करें। यह आकांक्षा की गति को समय से किया जा सकता है। संकीर्ण सुझावों की दक्षता का परीक्षण करने के लिए एजीएस के छोटे पैमाने पर नमूने को अलग करने का प्रयास करें।
      नोट: ये टिप्स यांत्रिक आंदोलन के लिए महत्वपूर्ण हैं । गुणवत्ता लौ गोल पिपेट युक्तियां कोशिका व्यवहार्यता को संरक्षित करते समय पूर्ण वियोजन के लिए अनुमति देती हैं। जैसे, इन युक्तियों को पुन: उपयोग के लिए प्रक्रिया के अंत में पानी के साथ अच्छी तरह से धोया जाता है। यह दिन-प्रतिदिन प्रजनन योग्य वियोजन की अनुमति देता है।

2. सहायक ग्रंथियों का विच्छेदन

1. बर्फ पर कांच की डिश में 20 से 25 नर ड्रोसोफिला डालें।
2. एसएसएम में 1 पुरुष विच्छेदन। इसके प्रजनन पथ को उतारें और स्खलन वाहिनी के अलावा अन्य सभी ऊतकों से सहायक ग्रंथि जोड़ी को साफ करें।
   नोट: वृषण निकालें क्योंकि जारी शुक्राणु झुरमुट बना सकते हैं और वियोजन प्रक्रिया को परेशान कर सकते हैं। स्खलन बल्ब निकालें, जो तैरने पर हैंडलिंग मुश्किल बनाता है।
3. संदंश के साथ, कमरे के तापमान पर एसएसएम से भरी कांच की प्लेट में गौण ग्रंथियों को स्थानांतरित करें। एसएसएम में ग्रंथियों के 20 जोड़े का एक बैच प्राप्त करने के लिए 2.2-2.3 20 बार चरण दोहराएं।
   नोट: ये कदम 15 से 20 मिनट में हासिल किए जाएंगे एजीएस स्वस्थ दिखना चाहिए, और ग्रंथियों के आसपास मांसपेशियों की परत के परिस्तात्मक आंदोलन दिखाई देने चाहिए । जीएफपी पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके निगरानी की जा सकती है।
4. कमरे के तापमान पर 1-2 मिनट धोने के लिए 1x पीबीएस के लिए गौण ग्रंथियों को स्थानांतरित करें।
   नोट: बेहतर वियोजन के लिए, पीबीएस के साथ ग्रंथियों को कुल्ला करना अनिवार्य है। हालांकि, इस चरण की अवधि सीमित होनी चाहिए क्योंकि कोशिकाएं पीबीएस में तनाव के लक्षण दिखाती हैं; PBS में माध्यमिक कोशिकाओं को तेजी से प्रफुल्लित और मर जाते हैं ।
5. वियोजन समाधान प्राप्त करने के लिए 1x ट्राइपसिन एंजाइम के 180 माइक्रोन में 20 माइक्रोन पैपिन [50 यू/एमएलए] को पतला करें (ऊपर या नीचे स्केल करने के लिए ट्राइप्सिन के 9 माइक्रोन और प्रत्येक पुरुष के लिए पपीन के एंजाइम 1 माइक्रोन) रखें। संदंश के साथ, इस समाधान के लिए गौण ग्रंथियों को स्थानांतरित करें।
6. समीपस्थ भाग से गौण ग्रंथियों (माध्यमिक कोशिकाओं युक्त) की नोक को अलग करें। एक ग्रंथि पालि के बीच मजबूती से चुटकी लेने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें और एक दूसरे संदंश की तेज नोक के साथ काट दिया। वियोजन में सुधार और सेल छंटाई समय को कम करने के लिए गौण ग्रंथियों और स्खलन वाहिनी के समीपस्थ भाग को हटा दें।
   नोट: ग्रंथियों के 20 जोड़े से डिस्टल भाग विच्छेदन 15 से 20 मिनट लगेगा और पेप्टिडास द्वारा पाचन इस प्रकार कमरे के तापमान पर शुरू हो जाएगा ।
7. सभी ग्रंथि युक्तियों को विच्छेदित करने के बाद, चरण 1.2.1 पर तैयार एक विशेष 200 माइक्रोल पिपेट टिप का उपयोग करके उन्हें 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। ग्रंथियों को संभालने से पहले यह चौड़ा, गोल और गीला होना चाहिए।
   नोट: गौण ग्रंथि ऊतक पाइप करने के लिए, युक्तियां हमेशा उचित समाधान के साथ पूर्व गीला होना चाहिए (ट्रिप्सिन एंजाइम या एसएसएम, इस उद्देश्य के लिए प्रत्येक की एक ट्यूब रखें)। प्रदूषण से बचने के लिए नमूनों के बीच सावधानी से टिप्स कुल्ला करें।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular microscope for dissection
Binocular with light source for GFP
Bunsen
Plastic microtubes 1.5 mL	Eppendorf
Fine dissection forceps
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	heat inactivated prior to use
Glass dishes for dissection
Ice bucket
P1000	Gilson
P20	Gilson
P200	Gilson
Papain			50U/mL stock
PBS			home made
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Schneider’s Drosophila medium	Gibco	21720-001
Tipone 1250 μL graduated tip	Starlab	S1161-1820
Tipone 200 μL bevelled tip	Starlab	S1161-1800
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604013