Summary
在这里，我们描述了构建一个基本的三维（3D）肠道细胞系模型系统和一个石蜡包埋方案，用于固定肠道当量的光学显微评估。对选定的蛋白质进行染色可以分析来自单个实验的多个视觉参数，以潜在地用于临床前药物筛选研究。
Abstract
体内和体外肠道模型在研究炎症性肠道疾病的病理生理学、潜在有益物质的药理学筛选以及潜在有害食品成分的毒性研究方面的使用有所增加。与此相关的是，目前需要开发基于细胞的体外模型来替代动物模型。在这里，提出了一个使用细胞系的基本“健康组织”三维（3D）肠道等效模型的方案，具有提供实验简单性（标准化和易于重复的系统）和生理复杂性（Caco-2肠细胞与U937单核细胞和L929成纤维细胞的支持免疫成分）的双重好处。该协议还包括用于固定肠道当量的光学显微镜评估的石蜡包埋，从而提供了从单个实验中分析多个视觉参数的优势。苏木精和伊红 （H&E） 染色切片显示 Caco-2 柱状细胞在对照处理中形成紧密且规则的单层，用于验证该模型作为实验系统的功效。使用麸质作为促炎食品成分，从切片中分析的参数包括单层厚度减少，以及与底层基质 （H&E） 的破坏和分离、闭合蛋白染色所示的紧密连接蛋白表达降低（可统计学量化），以及迁移的 U937 细胞的免疫激活，如分化簇 14 （CD14） 染色和 CD11b 相关分化为巨噬细胞所证明的那样。如使用脂多糖模拟肠道炎症所示，可以测量的其他参数是粘液染色和细胞因子表达增加（如中间因子），这些参数可以在固定前从培养基中提取。基本的三维 （3D） 肠粘膜模型和固定切片可推荐用于炎症状态和屏障完整性研究，并可以分析多个视觉可量化参数。
Introduction
肠上皮屏障是包含不同类型上皮细胞的单细胞厚内膜，构成了身体外部和内部环境之间的第一个物理防御屏障或界面 1,2。柱状肠细胞是最丰富的上皮细胞类型。它们负责通过包括紧密连接 （TJ） 在内的多个屏障组件之间的相互作用来维持上皮屏障的完整性，在屏障收紧中起着重要作用 1,3。TJ 结构由细胞内斑块蛋白组成，例如闭塞带 （ZO） 和扣带蛋白，与跨膜蛋白（包括闭塞蛋白、claudins 和连接粘附分子 （JAM））合作，形成紧密连接相邻细胞的拉链状结构 3,4。跨膜蛋白调节小化合物的被动细胞旁扩散，排除有毒的大分子。
潜在有毒的食物化合物和食物污染物会刺激炎性细胞因子的产生，从而破坏上皮通透性，激活免疫细胞并引起慢性肠道组织炎症 5,6,7。相比之下，据报道，各种抗氧化和抗炎植物化学物质可通过恢复 TJ 蛋白表达和组装来降低炎性细胞因子表达并增强肠道 TJ 屏障完整性 4,6,8。因此，有益和有害化合物对上皮屏障完整性的调节已经看到体内和体外模型的使用增加，这些模型旨在模拟肠道屏障进行药物筛选和毒性研究。鉴于人们对了解肠病 （IBD）、坏死性小肠结肠炎和癌症的病理生理学的兴趣日益浓厚，这一点尤其重要，这些都可以在实验模型中模拟 8、9、10。
为了实现动物试验中“3R”的目标，人们一直需要开发基于细胞的体外模型。这些措施包括替代使用动物的替代品，减少使用的动物数量，以及改进采用减轻痛苦的方法11,12,13。此外，人类和小鼠模型（啮齿动物是使用最广泛的物种）之间的潜在分子、细胞和生理机制是独特的，导致关于小鼠模型作为人类反应预测因子的功效的争议12,13。体外人类细胞系模型的众多优点包括靶标限制实验、直接观察和连续分析13。
二维 （2D） 培养物中的单细胞型单层已成为强大的模型。然而，这些不能精确地再现人体组织的生理复杂性8,13,14。因此，3D培养系统正在开发中，并不断改进，以概括健康和患病肠道组织的生理复杂性，作为下一代风险评估工具箱13,14。这些模型包括具有不同细胞系的 3D Transwell 支架、类器官培养物和使用细胞系和类器官（来自健康和患病组织）的微流体装置（肠芯片）8,13,14。
本研究中提出的 3D“健康组织”肠道等效方案基于在生理复杂性和实验简单性之间取得平衡13。该模型代表了 3D Transwell 支架，由三种细胞系（肠细胞 [金标准结肠腺癌 Caco-2 系]和支持免疫成分 [U937 单核细胞和 L929 成纤维细胞]）组成，构成了一个标准化且易于重复的系统，适用于初步筛选对肠上皮屏障完整性和免疫反应感兴趣的膳食分子。该协议包括石蜡包埋，用于使用固定肠道等效物对上皮屏障完整性进行光学显微镜评估。本方法的优点是可以使包埋组织的许多切片从单个实验中对多个参数进行染色。
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Protocol
1. 基本3D重建肠黏膜模型的制备
注意：整个过程必须在无菌层流罩中进行。涉及使用细胞培养箱的程序中的所有步骤都意味着将培养物在含有5%CO2 的湿润气氛中在37°C下孵育（除非方案中另有说明）。
- 肠道模型系统中使用的细胞系的预先制备
- 在 F25 烧瓶中以 5 x 105 的浓度接种 L929 小鼠成纤维细胞，在 5 mL 含有 2 mM L-谷氨酰胺、10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素-链霉素 （Pen-Strep） 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中，并在构建肠道模型前 4 天在培养箱中培养。48小时后，使用移液管除去培养基。然后加入新鲜培养基（5mL），并将细胞进一步孵育48小时。
注意：细胞在使用前必须达到 80% 汇合。 - 在F75细胞瓶中的10mL DMEM培养基（含有10%FBS和1%Pen-Strep）中接种Caco-2细胞（浓度为2×10,6），并在构建肠粘膜模型前4天在培养箱中培养。48小时后，按照步骤1.1.1中的说明更换培养基，并进一步孵育48小时至汇合度为80%。
注意：细胞必须处于活跃的增殖阶段：不要太稀疏，也不要太汇合。建议汇合率为 50-60%。细胞不能在制作模型的前一天播种，因为这可能会减慢细胞的增殖能力，从而无法在重建的 3D 模型中完美地扎根。 - 在模型设置前 2 天，将悬浮液（浓度为 1 x 106）的 U937 细胞加入 10 mL 罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI） 培养基（含有 2 mM L-谷氨酰胺、1% 丙酮酸钠、10% FBS 和 1% Pen-Strep）的 F75 细胞瓶中，并置于培养箱中 48 小时。
- 在 F25 烧瓶中以 5 x 105 的浓度接种 L929 小鼠成纤维细胞，在 5 mL 含有 2 mM L-谷氨酰胺、10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 青霉素-链霉素 （Pen-Strep） 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中，并在构建肠道模型前 4 天在培养箱中培养。48小时后，使用移液管除去培养基。然后加入新鲜培养基（5mL），并将细胞进一步孵育48小时。
- Transwell共培养板插件的制备
- 选择包含带有 0.4 μm 过滤器的插入物的 24 孔板。
注：0.4 μm 过滤器是药物转运研究的标准选择。不建议使用 3 μm 和 8 μm 的过滤器尺寸，以防止胶原包埋细胞的任何可能损失。 - 使用移液管，在过滤器插件下方和上方用 500 μL Hanks 平衡盐溶液 （HBSS） 水合 Transwell 过滤器（以下称为膜插件）。
- 关闭多孔板并将其置于培养箱中至少2小时。
注：膜插入物可在HBSS中停留长达24小时。此操作可以在构建模型的前一天执行。重要的是，膜插件必须完全水合，并且过滤器不会变干，因为这会使样品更难正确粘附。 - 2小时（或24小时）后从培养箱中取出板。使用移液管小心地从膜插入物的上方和下方吸出HBSS，并使其干燥10分钟。
- 选择包含带有 0.4 μm 过滤器的插入物的 24 孔板。
- 基本 3D 肠道模型系统的无细胞胶原蛋白固有层的制备（第 1 天）
- 在冰上的50 mL无菌管中制备无细胞胶原溶液，其中含有DMEM中的以下成分：10%胎牛血清（FBS），200mM L-谷氨酰胺，1%碳酸氢钠和1.35mg / mL1型大鼠尾胶原。
注意： 所有这些组件必须保持在冰上，并用冷却的移液器吸头添加到 DMEM 中。1 型大鼠尾胶原蛋白必须最后添加，因为它会随着温度和 pH 值的升高而聚合。制备的无细胞胶原蛋白溶液的量将取决于所需的肠道当量的数量。 - 向每个板插入物（膜过滤器上方）中加入 250 μL 溶液，以获得所选的肠道当量数量，并将盖子放在多孔板上。让胶原溶液在室温 （RT） 下在层流罩下聚合。
注意：除了过渡到更固态的相外，聚合也从颜色从黄色变为粉红色中显而易见。聚合通常在10-15分钟内完成。
- 在冰上的50 mL无菌管中制备无细胞胶原溶液，其中含有DMEM中的以下成分：10%胎牛血清（FBS），200mM L-谷氨酰胺，1%碳酸氢钠和1.35mg / mL1型大鼠尾胶原。
- 制备、细胞计数以及将成纤维细胞 （L929） 和单核细胞 （U937） 添加到模型系统中（第 1 天）
- 从培养箱中取出L929细胞培养物（步骤1.1.1）。使用真空泵吸出培养基，用 5 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS;不含 Ca 和 Mg）替换，然后冲洗细胞。
- 使用真空泵吸出 PBS。加入 2 mL 预制的胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.05% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 的 PBS 溶液），放入培养箱中 3-5 分钟。
- 使用倒置显微镜（例如，Eclipse Ts2，尼康）确定细胞是否从粘附表面脱落。如果发生这种情况，请立即加入 2 mL DMEM（含 10% FBS）以阻断胰蛋白酶反应并冲洗细胞。
- 将细胞溶液转移到无菌的 15 mL 管中，并以 645 x g 离心 5 分钟。使用真空泵吸出上清液。
注意： 需要注意不要打扰颗粒。DMEM在L929和U937细胞上进行了测试，未显示对生长有不利影响。 - 向沉淀中加入 1 mL DMEM 并悬浮细胞。
注意：细胞必须均匀悬浮在溶液中。 - 在DMEM中取出20μL细胞，并加入20μL台盼蓝溶液。取出 20 μL 混合物，并使用细胞计数室在显微镜下评估细胞密度。
- 从培养箱中取出U937细胞培养物（步骤1.1.3）。将细胞溶液以645× g 离心5分钟。使用真空泵吸出上清液以避免干扰沉淀。
- 将细胞悬浮在 1 mL RPMI 中。与 L929 细胞一样，确保细胞均匀悬浮在溶液中。
- 类似地，建立步骤1.4.6中报告的细胞密度。
- 按照步骤1.3.1中的说明制备胶原蛋白溶液。
注：要制备的溶液量必须考虑每个插入片段（或型号）的 450 μL。 - 制备DMEM溶液，分别含有50,000个L929细胞和15,000个U937细胞，体积为50μL，用于构建每个肠道等效模型。
注意：细胞数量是一个关键因素。这两种细胞类型过多会导致固有层过多地充满细胞，而这些细胞将没有得到充分的组织。较少数量的成纤维细胞（产生胶原蛋白）会导致固有层不那么紧凑，而单核细胞太少会阻碍对刺激的免疫反应。如果每 50 μL 等分试样中存在正确的细胞计数，则可以为每个 24 孔板中存在的 12 个过滤器插入物制备 600 μL 的总体积。 - 在步骤1.4.10中，将含有细胞的每50μL等分试样加入到450μL胶原溶液中。充分混合。
- 为每个模型用 500 μL 含胶原蛋白的细胞溶液覆盖预包被的无细胞胶原蛋白固有层。
注意：快速增加每个插入物的体积很重要，因此，建议一次将重建的肠粘膜模型的数量限制为 12 个或更少。 - 关闭板并将其置于培养箱中2小时，以使溶液凝固。
- 制备、细胞计数和将上皮 Caco-2 细胞添加到肠道模型中（第 1 天）
- 从培养箱中取出Caco-2细胞培养物（步骤1.1.2）。重复步骤1.4.1中的步骤，使用10mL PBS进行初步冲洗。然后加入 5 mL 预制的胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.05% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 的无钙和无镁 PBS 溶液），并置于培养箱中 5-8 分钟。
- 重复步骤 1.4.3（但使用 5 mL DMEM 阻断胰蛋白酶反应）至 1.4.6，使用细胞计数室对细胞进行计数。
- 制备DMEM溶液，在50μL中含有150,000个Caco-2细胞。
注意：使用的单元格数量是一个临界点。超过 150,000 个细胞可能导致致密的杂乱无章的上皮层，而太少（小于 100,000 个）的细胞难以生长并且不能充分覆盖基底膜，从而形成不连续的肠上皮层。确保细胞有效悬挂。200 μL 移液器的吸头可用于确保均匀分布。鉴于在任何给定时间可以构建 12 个模型，可以制备 600 μL 细胞溶液。 - 在步骤 1.4.14 中要求的 2 小时后，将 50 μL 悬浮在 DMEM 中的 Caco-2 细胞添加到每个基底膜的中间。关闭多孔板的盖子。
- 在无菌层流罩下孵育10分钟。然后转移到培养箱中30分钟。
- 制备含有 10% FBS 和 1% Pen/Strep 的 DMEM 溶液。
注意：准备足够的溶液以使用每个模型 1 mL 体积。 - 在重建模型上方加入 500 μL 培养基，在过滤器下方加入 500 μL。
注意： 在过滤器上方添加介质时需要小心，以避免分离或对细胞施加压力。 - 关闭多孔板系统并将其放入培养箱中。
- 模型准备/形成和使用（第 2 天至第 6 天）
- 第2天：使用移液管小心地从重建模型上方和过滤器下方取出溶液。分别在过滤器上方和下方更换新鲜的 500 μL 新鲜 DMEM（10% FBS 和 1% Pen/Strep）。
- 第 3 天：重复上述步骤 1.6.1。
- 第 4 天：重复上述步骤 1.6.1。
注意：该肠道模型是静态细胞模型;因此，为了有利于分子的释放以及细胞的生长和刺激，每天更换培养基非常重要。 - 第 5 天：此时，模型已完全形成/开发。使用这些模型进行进一步的研究。
注意：使用该模型的最佳时间是 5 天。虽然细胞可以在培养箱中维持更长的时间，但时间越长，上皮细胞以不受控制的方式生长的可能性就越大，从而导致难以使用的无组织和紧凑层。 - 5天后，将模型与有毒（麸质或脂多糖[LPS]）或感兴趣的有益成分（多酚）一起孵育。将它们添加到悬浮在DMEM介质中的重建模型的上部。
注意：必须计算每种目标组分的合适浓度并将其悬浮在 DMEM 培养基中。必须设置仅包含DMEM培养基的未处理对照，以便与实验模型进行比较。 - 将对照和实验模型在培养箱中孵育24小时。
- 第 6 天：用移液管去除过滤器上方和下方的介质。
注：培养基可用于后续的酶联免疫吸附测定 （ELISA） 型测试，以测量炎性细胞因子的释放。为此，必须将培养基添加到无菌小瓶中并储存在-20°C以进行进一步分析。
2. 重建肠粘膜模型的石蜡包埋
注意： 整个过程必须在化学通风橱下进行。必须严格遵守每个步骤和相应的时间分配。因此，提前准备好所有试剂非常重要。
- 将石蜡机设置为58°C，以便可以使用。
- 在无菌 24 孔板中使用钳子将膜插入物转移到清洁孔中。
- 在过滤器上方加入 500 μL 37% 缓冲福尔马林的 PBS 溶液，在过滤器下方加入 1 mL。盖上盖子，在室温下将其放在化学通风橱下2小时。
注意：作为替代方案，4%缓冲福尔马林可以在室温下使用1小时。 - 取出福尔马林，在过滤器上方和下方加入HBSS溶液。然后移除 HBSS。
- 从膜插入物上拆下固有层。
注意：肠粘膜的细胞通常很容易从膜插入物上分离，因为它们不附着在膜插入物上。此外，两个样品室（顶端和基部）保持连接，保留 3D 结构。如果由于某种原因，它们不容易分离，则使用无菌的一次性手术刀刀片从膜插入物中去除肠粘膜非常重要。膜插入物可以被切割，从而将其与塑料分离。注意不要用手术刀接触样品。从胶原包埋细胞中去除膜插入物的动机是，该过滤器可能会在随后的固定或石蜡包埋阶段脱落，从而使肠粘膜模型之间的比较不成比例。此外，嵌入切片内的膜插入物具有不同的稠度，这可能会干扰切片。 - 将 100 mL 烧杯放在化学通风橱下方，每个烧杯都正确标记以包括一个正在研究的重建肠粘膜模型系统。向每个烧杯中加入 25 mL 35% ETOH，然后加入重建的肠粘膜。孵育 10 分钟。
- 用 25 mL 的 50% 乙醇代替 35% 乙醇并孵育 10 分钟。
- 用 25 mL 70% 乙醇代替 50% 乙醇并孵育 10 分钟。
- 用 25 mL 80% 乙醇代替 70% 乙醇并孵育 10 分钟。
- 用 25 mL 95% 乙醇代替 80% 乙醇并孵育 10 分钟。
- 用 25 mL 的 100% 乙醇代替 95% 乙醇并孵育 10 分钟。
- 用另外 25 mL 的 100% 乙醇替换 100% 乙醇并孵育 10 分钟。
- 将 100 mL 烧杯放在通风橱下，每个烧杯都正确标记以包括一个正在调查的模型。加入 50 mL 二甲苯或组织学清除剂 10-20 分钟。
注意：建议使用 Histo-Clear（组织学清除剂），因为该剂可增强嗜酸性染色剂的透明度和活力。清除时间可能因一个重建的肠粘膜样本而异，必须每 2-3 分钟检查一次外观透明度。 - 一旦样品透明，将它们放入金属组织盒支架中，然后将其浸入加热机器内的液体石蜡中 45 分钟。
- 更换石蜡，将样品留在加热的机器内再放置 45 分钟。
- 取下纸巾盒支架，放在冰上冷却。当冷却的样品块从金属支架上分离时，可以在室温下进一步冷却。
- 将块存储在室温下。
注意：如果目标是立即准备切片，则可以将块放置在4°C下，以便在使用时充分冷却。 - 使用切片机切割 4 μm 切片。
- 将切割部分放在载玻片上，并在37°C的烤箱中干燥24小时。
- 幻灯片已准备就绪。将它们储存在室温下，直到进行 H&E 组织学染色或免疫组织化学反应染色（抗原抗体类型）。
- 对于免疫组织化学染色，选择感兴趣的抗体（用于研究 TJ 蛋白（如闭合蛋白或用于单核细胞活化、迁移和分化）并使用商业试剂盒检测表达（通过染色）。
- 同样，使用阿尔新蓝和高碘酸-希夫 （PAS） 染色试剂盒测量粘液。
- 通过计算从显微镜拍摄的显微照片上阳性像素的百分比来量化感兴趣的染色 TJ 蛋白，例如闭合素。
- 使用图像分析软件（例如，ImageJ2软件[Wayne Rasband，版本2.9.0 / 1.53t]）分析细胞的图像。
- 要执行像素分析，请将数字图像处理为 300 像素/英寸并将其转换为 8 位。然后，通过 Color Deconvolution 插件处理二值图像，以分析目标蛋白质的染色，在本例中为闭塞素的永久红色染色。
- 将所选图片另存为 tiff，并使用图形编辑器（例如，Adobe PhotoshopCC [版本 20.0.4]）对其进行“清理”程序以消除伪影。
- 此后，使用应用程序 Analyze Particle of ImageJ2 测量所有感兴趣的字段，并将数据报告为像素数。
注意：每个实验应一式三份进行，并针对每个重复分析三个内部重复字段。为了量化粘液，测量像素的相同原理可以分别应用于紫色洋红色染色的中性粘蛋白和明亮的蓝色染色酸性粘液的图像。
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Representative Results
第一个重要方面是确定用于实验目的的基本 3D 肠道等效粘膜的可接受性。这是使用组织学和组织病理学实验室中最广泛使用的染色剂进行的，即苏木精（染色核材料深蓝紫色）和伊红（染色细胞质材料深浅不一的粉红色）。首先对未经处理的对照进行H&E染色，该对照在与实验处理相同的条件和时间范围内培养。通过可视化细胞的模式、形状和结构，该肠道细胞模型系统的成功取决于 Caco-2 细胞在 5 天后在富含细胞外基质 （ECM） 的固有层上方形成紧密且规则的单层（图 1A）。被认为无法进行进一步分析的模型系统的例子包括那些显示过度生长和上皮层杂乱无章的模型系统，如10天后所示（图1B）。另一个例子是上皮层太厚且杂乱无章（图1C），这是由过量的Caco-2细胞的接种或过度孵育引起的。畸形（图1D），归因于未处于增殖活跃期的接种细胞，或固有层的制备或石蜡固定期间的问题（细胞脱落/破坏），也是不可接受的重建肠粘膜的一个例子。同样不可接受的是缺乏上皮层形成（图1E），表明接种的Caco-2细胞太少或固有层的制备存在问题。使用可接受的 3D 肠道当量，从中可以生成多个切片，然后可以从单个实验中研究各种参数。
在可以分析的各种参数中，可以可视化响应促炎诱导剂的屏障完整性，并对TJ蛋白进行染色和定量，并与未经处理的对照模型系统进行比较。在这里，我们证明了来自高麸质含量7 的硬质小麦来源的 40 μg/mL 总小麦蛋白对细胞完整性和 TJ 闭塞蛋白含量的促炎作用（图 2A）。使用 H&E 组织学染色，对照模型系统显示 Caco-2 柱状细胞形成紧密且规则的单层。相比之下，含麸质蛋白质样品的作用被证明会导致单层的破坏，更多的非特异性伊红染色（图2A）。此外，可以测量上皮层的厚度，并且在暴露于促炎麸质后显示显着减少（图2A，B）。使用闭塞蛋白抗体（与红色染色偶联），可以对闭塞蛋白蛋白进行可视化和定量。与暴露于麸质蛋白24小时的肠粘膜相比，对照组的闭塞蛋白含量明显更高（图2A，C）。
由免疫成分（以 U937 单核细胞为代表）组成的肠道当量也是研究促炎诱导剂对单核细胞活化、迁移和分化为巨噬细胞的影响的理想选择。再次使用从高麸质含量的小麦来源中提取的 40 μg/mL 总小麦蛋白，从快速红色偶联 CD14 染色中可以明显看出固有层中 U937 单核细胞的促炎激活（图 3A）。 通过单核细胞和巨噬细胞上这种红色染色膜糖蛋白的表达增加来检测激活。异硫氰酸荧光素 （FITC） 也检测到 CD14 蛋白增加，该荧光素在免疫荧光下染成绿色。从靠近 Caco-2 单层的活化 U937 细胞的存在中证明了迁移。在单层破裂的地方，U937细胞被证明已经进入Caco-2细胞单层（图3A）。对照组没有CD14染色单核细胞迁移的证据（图3A）。单核细胞分化为巨噬细胞可从标记CD11b中识别出来。 在红色发色剂或FITC的对照组中，CD11b染色均不明显（图3B）。相反，在暴露于麸质的组织中，在富含ECM的固有层和破裂的Caco-2单层中都观察到CD11b巨噬细胞（图3B）。
使用LPS模拟肠道炎症，在这里我们表明也可以使用该模型系统分别研究Caco-2细胞在未处理的对照和LPS处理中产生的酸性粘蛋白和粘多糖（图4A）。使用阿尔新蓝和PAS染色，将酸性粘液分别染成亮蓝色，将中性粘蛋白分别染成紫红色。粘液染色的程度同样可以量化，并且在 1 ng/mL LPS 攻击下被显着诱导（图 4B）。此外，在固定之前，可以去除培养基以研究促炎细胞因子的产生。尽管可以测量许多排泄性细胞因子，但在这种特殊情况下，选择了中间因子（MDK）。MDK 是由转录因子、活化 B 细胞核因子 kappa-轻链增强子 （NF-κB） 通路诱导的内源性炎症标志物，也与肠道细胞炎症性疾病有关15。在LPS挑战下，与对照组相比，MDK被显著诱导（图5）。
图 1：未经处理的对照 3D 肠道当量。 苏木精和伊红 （H&E） 对未经处理的对照 3D 肠道当量（Caco-2 /U937/L929 共培养物）染色 24 小时，以验证基本 3D 肠粘膜模型的功效用于实验目的。（A） 将可接受的实验模型与不可接受的模型进行比较，显示 （B） 10 天后上皮生长过度和层错乱，（C） 上皮厚度过多和杂乱无章，（D） 畸形，以及 （E） 没有上皮细胞层。每个图像中的比例尺等于 50 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：处理过的 3D 肠道当量。 （A） 苏木精和伊红 （H&E） 染色，以及 3D 肠道当量（Caco-2 /U937/L929 共培养物）的封闭素表达，暴露 24 小时至 40 μg/mL 总蛋白从含有高麸质的现代小麦混合物中与对照组 （CTRL） 相比。每个图像中的比例尺等于 50 μm。 （B） Caco-2 细胞厚度的定量和 （C） 封闭红染色剂。显著性差异由单因素方差（ANOVA）确定，表示为*** 0.0001
改编7。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：CD14 和 CD11B 染色。24 小时后，暴露于未添加蛋白质（对照 [CTRL]）或 40 μg/mL 总蛋白的 3D 肠道当量（Caco-2/U937/L929 共培养物）中 U937 单核细胞和 CD11B U937 分化巨噬细胞的 CD14 染色含有含高麸质的现代小麦混合物。对于CD14和CD11b染色，使用固红作为显色剂，并用曙红对细胞核进行复染。每个图像中的比例尺等于 20 μm。 CD14 和 CD11b 用异硫氰酸荧光素（绿色）染色也显示在免疫荧光下。用 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 对细胞核进行复染。每个图像中的比例尺等于 50 μm。箭头表示存在单核细胞（CD14阳性细胞）和巨噬细胞（CD11b阳性细胞）。该图经 Truzzi 等人许可改编7。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：苏木精和伊红 （H&E） 染色，以及阿尔新蓝/高碘酸-希夫染色 （PAS） 染色的粘液表达。 （A） 在暴露于 1 ng/mL 脂多糖的未经处理的等效和重建的肠粘膜模型系统中 24 小时后，碱性 3D 肠道当量（Caco-2 /U937/L929 共培养物）中的 Caco-2 细胞。每个图像中的比例尺等于 50 μm。 （B） 通过单因素方差 （ANOVA） 确定粘液表达的定量，显着性报告为 **** P < 0.0001。黑点表示重复次数。该图经 Truzzi 等人许可改编16。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：中间因子表达式。 在暴露于 1ng/mL 脂多糖的未处理对照 （CTRL） 和肠粘膜模型系统中 24 小时后，3D 肠道当量培养基（Caco-2 /U937/L929 共培养物）中 Midkine 表达。通过单因素方差 （ANOVA） 确定中间因子表达的定量，显著性报告为 **** P < 0.0001。该图经 Truzzi 等人许可改编16。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：表示肠道当量的构建和实验使用的示意图，以及组织切片参数的固定和显微镜分析。 该示意图总结了肠道当量的构造以及可以对这些模型进行的可能的实验处理。从单个实验中生成多个组织切片可以分析肠粘膜的许多结构和免疫方面，如 图1、 图2、 图3和 图4所示。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
这里介绍的基本重建肠粘膜模型系统（图6）结合了生理复杂性（含有Caco-2单层的生理上更相关的3D细胞培养物，以及含有成纤维细胞和单核细胞的富含ECM的固有层支持物）和实验简单性（使用商业人类细胞系产生标准化且易于重复的系统）13.因此，该模型系统被认为是小鼠模型的合适替代品，旨在评估潜在药物/食品成分对肠道屏障完整性的影响。在这方面，以前的文章证实了当前细胞培养模型在测试潜在有益化合物（加上剂量依赖性）以及有害食品成分方面的功效7,16,17。此外，LPS或替代的促炎试剂（2,4,6-三硝基苯磺酸或右旋糖酐硫酸钠）可以添加到目前的肠粘膜模型中，以模拟IBD症状。通过这样做，有可能从结构方面以及细胞因子的表达来研究肠道疾病的病因，例如促炎性MDK，这是IBD15的标志物。这种基本模型系统也具有针对更广泛人群的最终药物筛选潜力。尽管模型系统在生理上比二维模型更复杂13,14，但再现复杂人体生理学的局限性包括缺乏微流体系统（持续供应营养物质的流体灌注和去除废物以及机械刺激）8,14 和微生物组（评估肠道疾病中的宿主-微生物组相互作用）8，14.
使用本基本3D肠粘膜模型与石蜡包埋相结合进行上皮屏障完整性的光学显微镜评估的优点是，可以从单个实验中制作多个组织切片，从而允许分析许多参数。跨上皮电阻 （TEER）3 是评估肠道屏障完整性的常用方法，已与大分子通透性研究 3,18 以及广泛报道的 TJ 蛋白表达蛋白质印迹评估研究结合使用。 蛋白质印迹评估提供了对蛋白质表达总体变化的定量见解，而 TEER 可作为屏障完整性的定量测量。相反，显微评估为定性可视化和评估局部蛋白质变化和相互作用提供了有价值的工具18。
对具有免疫成分的模型进行显微评估可以可视化免疫反应，例如单核细胞分化为巨噬细胞以及活化的单核细胞在ECM中的迁移，如CD14和CD11b染色所示。可以通过对单个组织切片进行免疫组化和/或免疫荧光染色进行鉴定，如 图 3 中所示的 CD14 和 CD11b。免疫组化允许对整个重建的肠粘膜组织进行结构可视化。此外，还可以识别细胞中的细胞核和细胞质。相比之下，共聚焦免疫荧光不允许将组织视为一个整体（仅看到感兴趣的标志物和DAPI染色的细胞核）。但是，它提供了一个非常干净的图像，其中消除了背景颜色。这样做的优点是，它可以更精确地证明标记物的阳性或阴性，从而计算颜色强度的任何差异（例如，在一个细胞中表达的标记物比在另一个细胞中表达得更多）。潜在的 CD14 单核细胞从固有层内迁移到 Caco-2 单层的程度也可以从不同时间点拍摄的多个重复图像中估计出来。尽管如此，从CD14和CD11b染色细胞的存在中可以明显看出炎症的证据。
大多数实验室使用 20–40 μg 总蛋白范围进行蛋白质印迹19。许多间隙连接蛋白（闭合蛋白、claudin、连蛋白和 E-caderin）的定量可以通过对单个组织切片进行免疫组织化学和/或荧光染色，分别需要显着更少的蛋白质。同时，从同一实验中，也可以从H&E染色细胞的模式、形状和结构中可视化上皮层响应化合物的完整性。
用于染色粘液产生、TJ 蛋白和免疫反应产生的蛋白质的基本 3D 重建肠粘膜的功效取决于克服关键步骤，特别是在模型系统的构建和组织固定期间。 关于模型构建，分别使用正确的汇合点和接种正确数量的Caco-2细胞（由方案中的注释表示）是基础。过多的细胞或不正确的汇合会导致上皮层变厚且杂乱无章。相反，太少的细胞会导致上皮层形成减少或缺乏。在接种过程中，同样重要的是 ECM 中 L929 和 U937 细胞的正确细胞汇合和数量，以及在制备过程中正确处理胶原蛋白。过多的细胞或胶原蛋白的快速聚合会导致致密和畸形的ECM，进而影响上述上皮细胞的结构。同样，胶原形成的 L929 细胞太少会导致 ECM 的一致性不正确，而 U937 单核细胞太少则不利于免疫反应。同样重要的是，细胞在5天后用于实验，因为长时间的孵育会导致细胞过度生长，从而导致上皮层致密。此外，鉴于目前的设计缺乏微流体系统，并且代表了静态肠道细胞模型，为了有利于分子的释放以及细胞的生长和刺激，每天更换培养基非常重要。关于固定方案，清除阶段至关重要，并且鉴于组织在石蜡中变得透明所需的时间可能会有所不同，因此在此阶段必须密切观察每个肠粘膜系统。在整个固定过程中，必须小心处理这些模型，以免损坏它们。
总之，如果严格遵守基本 3D 肠道当量的构建和固定中的关键点，这些模型可以为药物筛选和毒性研究中的多个参数的评估提供大量组织切片。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
感谢翁贝托·韦罗内西基金会（Umberto Veronesi Foundation）为研究人员工作提供奖学金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue/PAS kit | ScyTek Laboratories, Inc. | APS-1, APS-2 | kit for immunohistochemical staining |
| Blue Trypan solution | Thermo Fisher | 15250061 | cell count analyses |
| Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells | ATCC | ATCC HTB-37 | cell line |
| Citro-Histo-Clear Limonene based | Histoline laboratories | R0050CITRO | reagent for paraffin embedding |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO | 11965092 | cell colture reagent |
| Embedding Center | Histoline laboratories | TEC2900 | instrument for paraffin embedding |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | A5256701 | cell colture reagent |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 12350039 | cell colture reagent |
| Human Midkine ELISA kit | Cohesion Biosciences | CEK1270 | kit ELISA |
| Inverted microscope | Eclipse Ts2, Nikon | MFA34100 | microscope |
| L929 mouse fibroblasts | ATCC | ATCC ®-CCL1 | cell line |
| LC3-II | Novus Biologicals | NB910-40752SuperNovusPack | antibody |
| L-Glutamine | GIBCO | A2916801 | cell colture reagent |
| Occludin | Novus Biologicals | NBP1-87402 | antibody |
| Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C | Histoline laboratories | R0040 PLUS | instrument for paraffin embedding |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| rat tail collagen type I | GIBCO | A1048301 | cell colture reagent |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) | GIBCO | 21870076 | cell colture reagent |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360070 | cell colture reagent |
| Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher | TF-CACC2FL | cell counting instrument |
| Transwell | Costar Corning | 3413 | plastic for cell colture |
| Trypsin | GIBCO | 15090046 | cell colture reagent |
| U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line | ATCC | ATCC CRL-1593.2 | cell line |
| UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit | ScyTek Laboratories, Inc. | AMH080 | kit for immunohistochemical staining |
References
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