Summary
В данной статье мы опишем построение базовой трехмерной (3D) системы моделирования кишечной клеточной линии и протокола встраивания парафина для световой микроскопической оценки фиксированных кишечных эквивалентов. Окрашивание выбранных белков позволяет анализировать несколько визуальных параметров из одного эксперимента для потенциального использования в доклинических скрининговых исследованиях лекарственных средств.
Abstract
Отмечается рост использования моделей кишечника in vivo и in vitro для изучения патофизиологии воспалительных заболеваний кишечника, для фармакологического скрининга потенциально полезных веществ и для исследований токсичности потенциально вредных пищевых компонентов. Актуально то, что в настоящее время существует потребность в разработке клеточных моделей in vitro для замены моделей на животных. Здесь представлен протокол для базовой, «здоровой» трехмерной (3D) эквивалентной модели кишечника с использованием клеточных линий, обладающий двойным преимуществом, обеспечивающим как экспериментальную простоту (стандартизированная и легко воспроизводимая система), так и физиологическую сложность (энтероциты Caco-2 с поддерживающим иммунным компонентом моноцитов U937 и фибробластов L929). Протокол также включает в себя введение парафина для световой микроскопической оценки фиксированных кишечных эквивалентов, тем самым обеспечивая преимущество анализа нескольких визуальных параметров в одном эксперименте. Окрашенные гематоксилином и эозином (H&E) срезы, показывающие столбчатые клетки Caco-2, образующие плотный и регулярный монослой в контрольных процедурах, используются для проверки эффективности модели в качестве экспериментальной системы. Используя глютен в качестве провоспалительного компонента пищи, параметры, анализируемые из срезов, включают уменьшение толщины монослоя, а также разрушение и отслоение от нижележащего матрикса (H&E), снижение экспрессии белка плотного соединения, как показано при окклюдиновом окрашивании (количественно поддающееся статистической оценке), и иммунную активацию мигрирующих клеток U937, о чем свидетельствует окрашивание кластера дифференцировки 14 (CD14) и дифференцировка, связанная с CD11b, в макрофаги. Как показано при использовании липополисахарида для моделирования воспаления кишечника, дополнительными параметрами, которые могут быть измерены, являются повышенное окрашивание слизи и экспрессия цитокинов (таких как мидкин), которые могут быть извлечены из среды до фиксации. Базовая трехмерная (3D) модель слизистой оболочки кишечника и фиксированные срезы могут быть рекомендованы для исследований воспалительного статуса и целостности барьера с возможностью анализа нескольких визуальных количественных параметров.
Introduction
Эпителиальный барьер кишечника, внутренняя оболочка толщиной в одну клетку, содержащая различные типы эпителиальных клеток, представляет собой первый физический защитный барьер или интерфейс между внешней и внутренней средой тела 1,2. Энтероциты столбчатого типа представляют собой наиболее распространенный тип эпителиальных клеток. Они отвечают за поддержание целостности эпителиального барьера за счет взаимодействия между несколькими компонентами барьера, включая плотные соединения (ТЖ), играя значительную роль в уплотнении барьера 1,3. Структура TJ состоит из внутриклеточных белков бляшек, таких как zonula occludens (ZO) и цингулин, взаимодействующих с трансмембранными белками, включая окклюдины, клаудины и молекулы соединительной адгезии (JAM), которые образуют структуру, подобную молнии, плотно связывающую соседние клетки 3,4. Трансмембранные белки регулируют пассивную параклеточную диффузию мелких соединений и исключают токсичные крупные молекулы.
Потенциально токсичные пищевые соединения и пищевые загрязнители стимулируют воспалительную продукцию цитокинов, которые нарушают проницаемость эпителия, активируя иммунные клетки и вызывая хроническое воспаление тканей кишечника 5,6,7. Напротив, сообщалось, что различные антиоксидантные и противовоспалительные фитохимические вещества снижают экспрессию воспалительных цитокинов и улучшают целостность кишечного барьера TJ за счет восстановления экспрессии и сборки белка TJ 4,6,8. Таким образом, регуляция целостности эпителиального барьера как полезными, так и вредными соединениями привела к увеличению использования моделей как in vivo, так и in vitro, направленных на имитацию кишечного барьера для фармацевтического скрининга и исследований токсичности. Это особенно актуально с учетом растущего интереса к пониманию патофизиологии кишечных заболеваний кишечника (ВЗК), некротизирующего энтероколита и рака, которые могут быть смоделированы на экспериментальных моделях 8,9,10.
Существует спрос на разработку клеточных моделей in vitro для достижения цели «3R» в испытаниях на животных. К ним относятся альтернативы использованию животных, сокращение числа используемых животных и совершенствование методов смягчения дистресса 11,12,13. Более того, молекулярные, клеточные и физиологические механизмы, лежащие в основе человеческих и мышиных моделей (грызуны являются наиболее широко используемыми видами), различны, что приводит к спорам относительно эффективности мышиных моделей в качестве предикторов в человеческих реакциях12,13. Многочисленные преимущества моделей человеческих клеточных линий in vitro включают эксперименты с ограничением мишеней, прямое наблюдение и непрерывный анализ13.
Монослои одноклеточного типа в двумерных (2D) культурах послужили мощными моделями. Однако они не могут точно воспроизвести физиологическую сложность человеческих тканей 8,13,14. В результате, системы 3D-культивирования разрабатываются с постоянно растущими улучшениями для повторения физиологической сложности как здоровых, так и больных тканей кишечника в качестве инструментария для оценки риска следующего поколения13,14. Эти модели включают в себя 3D-каркасы Transwell с различными клеточными линиями, органоидными культурами и микрофлюидными устройствами (кишечник на чипе), использующими как клеточные линии, так и органоиды (полученные как из здоровых, так и из больных тканей)8,13,14.
Трехмерный протокол «здоровой ткани» кишечного эквивалента, представленный в настоящем исследовании, был основан на нахождении баланса между физиологической сложностью и экспериментальной простотой13. Модель представляет собой 3D-каркас Transwell, состоящий из трех клеточных линий (энтероциты [линия Caco-2 золотого стандарта аденокарциномы толстой кишки] с поддерживающим иммунным компонентом [моноциты U937 и фибробласты L929]), представляющие собой стандартизированную и легко воспроизводимую систему, применимую для предварительного скрининга интересующих пищевых молекул на целостность эпителиального барьера кишечника и иммунный ответ. Протокол включает введение парафина для световой микроскопической оценки целостности эпителиального барьера с использованием фиксированных кишечных эквивалентов. Преимущество данного подхода заключается в том, что в рамках одного эксперимента можно окрасить множество участков внедренных тканей по нескольким параметрам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка базовой 3D реконструированной модели слизистой оболочки кишечника
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура должна проводиться в стерильном ламинарном колпаке. Все этапы процедуры, связанные с использованием клеточного инкубатора, означают, что культуры инкубируются при 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 5%CO2 (если иное не указано в протоколе).
- Предварительная подготовка клеточных линий, используемых в кишечной модельной системе
- Высейте клетки фибробластов мыши L929 в концентрации 5 x 10,5 в 5 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) Dulbecco, содержащей 2 мМ L-глютамина, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина (Pen-Streptomycin) в колбе F25 и культивируйте ее в инкубаторе за 4 дня до создания кишечных моделей. Через 48 ч удалите средство с помощью пипетки. Затем добавляют свежую среду (5 мл) и продолжают инкубировать клетки в течение 48 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием ячейки должны сливаться на 80%. - Высевают клетки Caco-2 (концентрация 2 х10,6) в 10 мл среды DMEM (с 10% FBS и 1% Pen-Strep) в колбу с клетками F75 и культивируют в инкубаторе за 4 дня до построения модели слизистой оболочки кишечника. Через 48 ч сменить среду, как описано в шаге 1.1.1, и далее инкубировать в течение 48 ч до слияния 80%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны находиться в активной фазе пролиферации: не слишком разреженные и не слишком сливающиеся. Рекомендуется слияние 50-60%. Клетки не следует сеять за день до создания модели, потому что это может замедлить пролиферативную способность клеток, которые затем не приживутся идеально в реконструированной 3D-модели. - Добавьте клетки U937, растущие в суспензии (концентрация 1 x 106), в 10 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (содержащей 2 мМ L-глютамина, 1% пирувата натрия, 10% FBS и 1% стрептококка Pen) в колбу с клетками F75 за 2 дня до установки модели и поместите в инкубатор на 48 ч.
- Высейте клетки фибробластов мыши L929 в концентрации 5 x 10,5 в 5 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) Dulbecco, содержащей 2 мМ L-глютамина, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина (Pen-Streptomycin) в колбе F25 и культивируйте ее в инкубаторе за 4 дня до создания кишечных моделей. Через 48 ч удалите средство с помощью пипетки. Затем добавляют свежую среду (5 мл) и продолжают инкубировать клетки в течение 48 ч.
- Подготовка вкладышей в планшеты для совместной культуры Transwell
- Выберите 24-луночный планшет со вставками с фильтрами 0,4 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтр 0,4 мкм является стандартным выбором в исследованиях переноса лекарственных средств. Размеры фильтров 3 мкм и 8 мкм не рекомендуются для предотвращения возможных потерь клеток, встроенных в коллаген. - С помощью пипетки увлажните фильтры Transwell (далее именуемые мембранными вставками) 500 мкл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) под и над фильтрующей вставкой.
- Закройте многолуночную тарелку и поместите ее в инкубатор минимум на 2 часа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мембранные вставки могут оставаться в HBSS до 24 часов. Эту операцию можно выполнить за день до построения модели. Важно, чтобы мембранные вставки были полностью гидратированы, а фильтр не пересыхал, так как это может затруднить правильное прилипание образца. - Выньте пластины из инкубатора через 2 ч (или 24 ч). Осторожно аспирируйте HBSS сверху и снизу мембранных вкладышей с помощью пипетки и дайте ему высохнуть в течение 10 минут.
- Выберите 24-луночный планшет со вставками с фильтрами 0,4 мкм.
- Подготовка собственной бесклеточной коллагеновой пластинки базовой системы 3D модели кишечника (ДЕНЬ 1)
- Приготовьте бесклеточный раствор коллагена в стерильной пробирке на льду объемом 50 мл, содержащий следующие компоненты в DMEM: 10% фетальная бычья сыворотка (FBS), 200 мМ L-глютамин, 1% бикарбонат натрия и 1,35 мг/мл коллаген из крысиного хвоста 1 типа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эти компоненты необходимо держать на льду и добавлять в DMEM с охлажденными наконечниками для пипеток. Коллаген крысиного хвоста 1-го типа должен добавляться в последнюю очередь, так как он полимеризуется с повышением температуры и pH. Количество приготовленного бесклеточного коллагенового раствора будет зависеть от количества необходимых кишечных эквивалентов. - Добавьте 250 мкл раствора в каждую пластину-вкладыш (над мембранным фильтром) для количества выбранных кишечных эквивалентов и накройте многолуночный планшет крышкой. Дайте раствору коллагена полимеризоваться при комнатной температуре (RT) под ламинарным колпаком.
ПРИМЕЧАНИЕ: Помимо перехода в более твердую фазу, полимеризация также проявляется в изменении цвета с желтого на розовый. Полимеризация обычно завершается в течение 10-15 минут.
- Приготовьте бесклеточный раствор коллагена в стерильной пробирке на льду объемом 50 мл, содержащий следующие компоненты в DMEM: 10% фетальная бычья сыворотка (FBS), 200 мМ L-глютамин, 1% бикарбонат натрия и 1,35 мг/мл коллаген из крысиного хвоста 1 типа.
- Подготовка, подсчет клеток и добавление клеток фибробластов (L929) и моноцитов (U937) в модельную систему (ДЕНЬ 1)
- Извлеките культуру клеток L929 (шаг 1.1.1) из инкубатора. С помощью вакуумного насоса аспирируйте среду, замените ее 5 мл стерильного фосфатного буферного раствора (PBS; без Ca и Mg) и промойте клетки.
- Аспирируйте PBS с помощью вакуумного насоса. Добавьте 2 мл предварительно приготовленного раствора трипсина-ЭДТА (0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА в ПБС) и поместите в инкубатор на 3-5 мин.
- Используйте инвертированный микроскоп (например, Eclipse Ts2, Nikon), чтобы установить, отделяются ли клетки от поверхности адгезии. Если это происходит, немедленно добавьте 2 мл DMEM (содержащего 10% FBS), чтобы заблокировать реакцию трипсина и промыть клетки.
- Перелейте клеточный раствор в стерильную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 645 x g в течение 5 мин. С помощью вакуумного насоса отсасывайте надосадочную жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не потревожить гранулу. Эффект DMEM был протестирован на клетках L929 и U937 и не оказал неблагоприятного влияния на рост. - Добавьте 1 мл DMEM в гранулу и поднимите клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны быть однородно взвешены в растворе. - Удалите 20 мкл клеток в DMEM и добавьте 20 мкл раствора трипанового синего. Удалите 20 мкл смеси и оцените плотность клеток под микроскопом с помощью камеры для подсчета клеток.
- Извлеките клеточную культуру U937 (шаг 1.1.3) из инкубатора. Центрифугируйте клеточный раствор при 645 x g в течение 5 мин. С помощью вакуумного насоса отсасывайте надосадочную жидкость, чтобы не повредить гранулу.
- Суспендировать клетки в 1 мл RPMI. Как и в случае с ячейками L929, убедитесь, что клетки однородно взвешены в растворе.
- Аналогичным образом установите плотность ячеек, как указано в шаге 1.4.6.
- Приготовьте раствор коллагена, как описано в шаге 1.3.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество раствора, которое должно быть приготовлено, должно учитывать 450 мкл для каждой пластины (или модели). - Приготовьте раствор DMEM, содержащий 50 000 клеток L929 и 15 000 клеток U937 соответственно в объеме 50 мкл для каждой модели кишечного эквивалента, которую необходимо построить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек является критическим фактором. Слишком большое количество клеток обоих типов привело бы к тому, что собственная пластинка была бы чрезмерно заполнена клетками, которые не были бы должным образом организованы. Меньшее количество фибробластов (которые генерируют коллаген) приведет к менее компактной собственной пластинке, в то время как слишком малое количество моноцитов будет препятствовать иммунному ответу на стимулы. При условии правильного подсчета ячеек в каждой аликвоте объемом 50 мкл общий объем 600 мкл может быть приготовлен для 12 фильтрующих вставок, присутствующих в каждой 24-луночной пластине. - Добавьте каждые 50 мкл аликвоты, содержащие клетки, к 450 мкл раствора коллагена на этапе 1.4.10. Тщательно перемешайте.
- Наложите на предварительно покрытую бесклеточную коллагеновую пластинку с 500 мкл коллагенсодержащего клеточного раствора для каждой модели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно быстро добавлять объемы к каждой вставке, поэтому рекомендуется ограничить количество реконструированных моделей слизистой оболочки кишечника до 12 или менее за один раз. - Закройте тарелку и поместите в инкубатор на 2 ч, чтобы раствор схватился.
- Подготовка, подсчет клеток и добавление эпителиальных клеток Caco-2 в модель кишечника (ДЕНЬ 1)
- Извлеките культуру клеток Caco-2 (шаг 1.1.2) из инкубатора. Повторите процедуры, описанные в шаге 1.4.1, используя 10 мл PBS для предварительного полоскания. Затем добавляют 5 мл заранее приготовленного раствора трипсина-ЭДТА (0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА в ПБС, не содержащих Ca- и Mg) и помещают в инкубатор на 5-8 мин.
- Повторите шаги 1.4.3 (но с использованием 5 мл DMEM для блокирования реакции трипсина) по 1.4.6 для подсчета клеток с помощью камеры подсчета клеток.
- Приготовьте раствор DMEM, содержащий 150 000 клеток Caco-2 в 50 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество используемых ячеек является критическим моментом. Превышение 150 000 клеток может привести к компактному дезорганизованному эпителиальному слою, в то время как при слишком малом количестве (менее 100 000) клетки борются за рост и не покрывают должным образом базальную мембрану, создавая прерывистый эпителиальный слой кишечника. Убедитесь, что клетки надежно подвешены. Наконечник пипетки объемом 200 мкл можно использовать для обеспечения однородного распределения. Учитывая, что в любой момент времени может быть построено 12 моделей, можно приготовить клеточный раствор на 600 мкл. - По истечении 2 ч, требуемых на этапе 1.4.14, добавьте 50 мкл клеток Caco-2, взвешенных в DMEM, в середину каждой базальной мембраны. Закройте крышку многолуночной пластины.
- Инкубируют под стерильным ламинарным колпаком в течение 10 мин. Затем переложить в инкубатор на 30 мин.
- Приготовьте раствор DMEM, содержащий 10% FBS и 1% Pen/Strep.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте достаточное количество раствора, чтобы использовать объем 1 мл на модель. - Добавьте 500 мкл среды над реконструированной моделью и 500 мкл под фильтр.
ПРИМЕЧАНИЕ: При добавлении среды над фильтром необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать отделения или напряжения ячеек. - Закройте систему многолуночных планшетов и поместите ее в инкубатор.
- Подготовка/формирование и использование модели (ДЕНЬ 2 - ДЕНЬ 6)
- ДЕНЬ 2: Осторожно удалите раствор как над восстановленной моделью, так и под фильтром с помощью пипетки. Замените свежим 500 мкл свежего DMEM (10% FBS и 1% Pen/Strep) над и под фильтром соответственно.
- ДЕНЬ 3: Повторите, как описано выше, в шаге 1.6.1.
- ДЕНЬ 4: Повторите, как описано выше, в шаге 1.6.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта модель кишечника представляет собой статическую клеточную модель; Поэтому, чтобы способствовать высвобождению молекул, росту и стимуляции клеток, очень важно, чтобы среда менялась каждый день. - ДЕНЬ 5: К этому моменту модель полностью сформирована/разработана. Используйте эти модели для дальнейших исследований.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лучшее время для использования модели - 5 дней. Хотя клетки могут храниться в инкубаторе в течение более длительных периодов времени, чем больше времени проходит, тем больше вероятность того, что эпителиальные клетки могут расти неконтролируемым образом, что приведет к неорганизованному и компактному слою, который трудно использовать. - Через 5 дней инкубируйте модели либо с токсичными (глютен или липополисахарид [ЛПС]), либо с полезными компонентами (полифенолы), представляющими интерес. Добавьте их в верхнюю часть реконструированной модели, подвешенной в среде DMEM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящая концентрация каждого интересующего компонента должна быть рассчитана и взвешена в среде DMEM. Необработанные контрольные группы, содержащие только DMEM-среду, должны быть настроены для сравнения с экспериментальными моделями. - Инкубируют контрольную и экспериментальную модели в течение 24 ч в инкубаторе.
- ДЕНЬ 6: Удалите средство над и под фильтром с помощью пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среда может быть сохранена для последующих иммуноферментных анализов (ИФА) для измерения высвобождения воспалительных цитокинов. Для этого среду необходимо добавлять в стерильные флаконы и хранить при температуре -20°С для дальнейшего анализа.
2. Парафиновое введение реконструированных моделей слизистой оболочки кишечника
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура должна проводиться под химическим вытяжным шкафом. Каждый шаг и соответствующее распределение времени должны строго соблюдаться. По этой причине важно, чтобы все реагенты были подготовлены заранее.
- Установите парафиновый аппарат на 58 °C, чтобы он был готов к использованию.
- Перенесите мембранные вкладыши в чистые лунки с помощью плоскогубцев в стерильную 24-луночную пластину.
- Добавьте 500 мкл 37% буферного формалина в PBS над фильтром и 1 мл под фильтром. Закройте крышку и оставьте под химическим вытяжным шкафом на 2 часа при RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать 4% буферизованный формалин в течение 1 ч. - Удалите формалин и добавьте раствор HBSS как выше, так и ниже фильтра. Затем снимите HBSS.
- Отделите собственную пластинку от мембранной вставки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки слизистой оболочки кишечника обычно очень легко отделяются от мембранной вставки, так как они не прикреплены к последней. Кроме того, два отсека образца (апикальный и базальный) остаются прикрепленными, сохраняя 3D-структуру. Если по какой-то причине они не легко отделяются, важно использовать стерильное одноразовое лезвие скальпеля для удаления слизистой оболочки кишечника из мембранной вставки. Мембранную вставку можно разрезать, тем самым отделив ее от пластика. Будьте осторожны и никогда не прикасайтесь к образцу скальпелем. Мотив для удаления мембранной вставки из клеток, внедренных в коллаген, заключается в том, что этот фильтр может отслоиться на последующих этапах фиксации или внедрения парафина, что делает сравнения между моделями слизистой оболочки кишечника непропорциональными. Кроме того, мембранные вставки внутри закладной секции имеют различную консистенцию, что может мешать секционированию. - Поместите стаканы объемом 100 мл под химический вытяжной шкаф, каждый из которых правильно промаркирован, чтобы включить одну реконструированную модельную систему слизистой оболочки кишечника, которую исследуют. Добавьте 25 мл 35% ETOH в каждый стакан, а затем добавьте реконструированную слизистую оболочку кишечника. Выдерживать 10 мин.
- Замените 35% этанол 25 мл 50% этанола и инкубируйте в течение 10 минут.
- Замените 50% этанол 25 мл 70% этанола и инкубируйте в течение 10 минут.
- Замените 70% этанол 25 мл 80% этанола и инкубируйте в течение 10 минут.
- Замените 80% этанол 25 мл 95% этанола и инкубируйте в течение 10 минут.
- Замените 95% этанол 25 мл 100% этанола и инкубируйте в течение 10 минут.
- Замените 100% этанол другим 25 мл 100% этанола и инкубируйте в течение 10 минут.
- Поместите стаканы объемом 100 мл под вытяжной шкаф, каждый из которых имеет правильную маркировку, чтобы включить одну исследуемую модель. Добавьте 50 мл ксилола или гистологического очистителя на 10-20 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать Histo-Clear (гистологический очиститель), так как он повышает чистоту и яркость ацидофильных пятен. Время очищения может варьироваться от одного реконструированного образца слизистой оболочки кишечника к другому и должно проверяться на прозрачность внешнего вида каждые 2-3 минуты. - Как только образцы станут прозрачными, поместите их в кассетный держатель из металлической ткани, который затем погружают в жидкий парафин внутри нагретой машины на 45 минут.
- Замените парафин и оставьте образцы внутри нагретой машины еще на 45 минут.
- Снимите держатель кассеты для салфеток и положите на лед, чтобы он остыл. Когда охлажденные блоки образцов отделяются от металлического держателя, их можно дополнительно охладить при комнатной температуре.
- Храните блоки в RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если цель состоит в том, чтобы подготовить секции немедленно, то блоки можно поместить при температуре 4 ° C, чтобы они хорошо охладились при использовании. - Отрежьте срезы размером 4 мкм с помощью микротома.
- Срезанные срезы поместите на горки и высушите их в духовке при температуре 37 ° C в течение 24 часов.
- Слайды готовы к использованию. Хранят их в РТ до тех пор, пока не будет выполнено либо гистологическое окрашивание H&E, либо окрашивание по иммунно-гистохимической реакции (тип антиген-антитело).
- Для иммуногистохимического окрашивания выберите интересующие антитела (либо для исследования белков TJ, таких как окклюдин, либо для активации, миграции и дифференцировки моноцитов) и определите экспрессию (с помощью окрашивания) с помощью коммерческих наборов.
- Точно так же измерьте слизь с помощью набора для окрашивания алкиановой синей и периодической кислоты-Шиффа (PAS).
- Количественно определите окрашенные белки TJ, такие как окклюдин, путем вычисления процента положительных пикселей на микрофотографиях, взятых с микроскопа.
- Проанализируйте изображения ячеек с помощью программного обеспечения для анализа изображений (например, программного обеспечения ImageJ2 [Wayne Rasband, версия 2.9.0/1.53t]).
- Чтобы выполнить анализ пикселей, обработайте цифровые изображения до 300 пикселей/дюйм и преобразуйте их в 8 бит. Затем обработайте бинарные изображения с помощью плагина Color Deconvolution , чтобы проанализировать окрашивание интересующего белка, в данном случае перманентное красное окрашивание окклюдина.
- Сохраните выбранное изображение в формате tiff и подвергните его процедуре «очистки» для устранения артефактов с помощью графического редактора (например, Adobe PhotoshopCC [версия 20.0.4]).
- После этого измерьте все поля интереса с помощью приложения Analyze Particle of ImageJ2 и сообщите данные в виде количества пикселей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый эксперимент должен выполняться в трех экземплярах с тремя внутренними полями репликации, анализируемыми для каждой репликации. Для количественного определения слизи тот же принцип измерения пикселей может быть применен к изображениям, полученным из нейтральных муцинов, окрашенных в пурпурный цвет, и кислотной слизи, окрашенной в ярко-синий цвет, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Первым важным аспектом является определение приемлемости базового 3D слизистой оболочки кишечного эквивалента для экспериментальных целей. Это делается с помощью наиболее широко используемых красителей в гистологических и гистопатологических лабораториях, а именно гематоксилина (окрашивает ядерный материал в темно-сине-фиолетовый цвет) и эозина (окрашивает цитоплазматический материал различными оттенками розового). Окрашивание H&E сначала выполняется на необработанном контроле, который культивируется в тех же условиях и в те же сроки, что и экспериментальная обработка. Визуализируя рисунок, форму и структуру клеток, можно сделать вывод, что успех этой системы клеток кишечника определяется тем, что клетки Caco-2 через 5 дней образуют плотный и регулярный монослой над собственной пластинкой, богатой внеклеточным матриксом (ECM) (рис. 1A). Примеры модельных систем, которые будут признаны неприемлемыми для дальнейшего анализа, включают системы, демонстрирующие чрезмерный рост с дезорганизованными эпителиальными слоями, как показано через 10 дней (рис. 1B). Еще одним примером является слишком толстый и неорганизованный эпителиальный слой (рис. 1C), вызванный либо засеванием избыточных клеток Caco-2, либо чрезмерной инкубацией. Мальформация (рис. 1D), связанная либо с посевом клеток, которые не находились в активной фазе пролиферации, либо с проблемами при подготовке собственной пластинки или во время фиксации парафином (клетки отслоились/разрушились), также является примером неприемлемой реконструированной слизистой оболочки кишечника. Столь же неприемлемым является отсутствие формирования эпителиального слоя (рис. 1E), что свидетельствует о засеивании слишком малого количества клеток Caco-2 или проблемах с получением собственной пластинки. Используя приемлемые 3D-эквиваленты кишечника, из которых может быть сгенерировано несколько срезов, затем можно исследовать различные параметры в рамках одного эксперимента.
Из различных параметров, которые могут быть проанализированы, можно визуализировать целостность барьера в ответ на провоспалительные индукторы, а белки TJ окрасить и количественно оценить и сравнить с необработанными контрольными модельными системами. Здесь мы демонстрируем провоспалительное действие 40 мкг/мл общего белка пшеницы из источника твердых сортов пшеницы с высоким содержанием клейковины7 как на целостность клеток, так и на содержание белка окклюдина TJ (рис. 2A). Используя гистологическое окрашивание H&E, контрольная модельная система показывает, что столбчатые клетки Caco-2 образуют плотный и регулярный монослой. Напротив, было показано, что эффект образца белка, содержащего глютен, вызывает разрушение монослоя с более неспецифическим окрашиванием эозином (рис. 2A). Кроме того, толщина эпителиального слоя может быть измерена, и показано, что она значительно уменьшается после воздействия провоспалительного глютена (рис. 2A, B). Используя антитело к окклюдину (конъюгированное с окрашиванием красным хромогеном), белок окклюдина может быть визуализирован и количественно определен. В контрольной группе было отмечено значительно более высокое содержание белка окклюдина по сравнению со слизистой оболочкой кишечника, подвергавшейся воздействию белка глютена в течение 24 ч (рис. 2А, В).
Кишечные эквиваленты, состоящие из иммунного компонента (представленного моноцитами U937), также идеально подходят для изучения влияния провоспалительных индукторов на активацию, миграцию и дифференцировку моноцитов в макрофаги. Опять же, при использовании 40 мкг/мл общего белка пшеницы, извлеченного из источника пшеницы с высоким содержанием глютена, провоспалительная активация моноцитов U937 в собственной пластинке была очевидна при быстром окрашивании CD14 с красной связью (рис. 3A). Активация обнаруживается по повышенной экспрессии этого окрашенного красным мембранного гликопротеина на моноцитах и макрофагах. Повышенный уровень белка CD14 также был обнаружен при применении флуоресцеина изотиоцианата (FITC), который окрашивается в зеленый цвет при иммунофлуоресценции. О миграции свидетельствовало наличие активированных клеток U937 вблизи монослоя Caco-2. Было показано, что там, где монослой разорвался, клетки U937 проникли внутрь монослоя клеток Caco-2 (рис. 3A). Доказательств CD14-окрашенной миграции моноцитов в контрольной группе не было (рис. 3А). Дифференцировка моноцитов в макрофаги идентифицируется по маркеру CD11b. В контрольной группе с красным хромогеном или FITC окраска CD11b не наблюдалась (рис. 3B). Вместо этого в тканях, подвергшихся воздействию глютена, макрофаги CD11b наблюдались как в собственной пластинке, богатой ECM, так и в разорванном монослое Caco-2 (рис. 3B).
Используя ЛПС для моделирования воспаления кишечника, мы показываем, что эту модельную систему также можно использовать для исследования кислого муцина и мукополисахаридов, продуцируемых клетками Caco-2 в контрольной группе без лечения и при лечении ЛПС соответственно (рис. 4А). С помощью альциановой синей и PAS-окрашивания кислая слизь окрашивается в ярко-синий цвет, а нейтральные муцины окрашиваются в пурпурно-пурпурный цвет соответственно. Степень окрашивания слизи также может быть количественно оценена, и показано, что она в значительной степени индуцируется при 1 нг/мл ЛПС (рис. 4B). Кроме того, перед фиксацией среда может быть удалена для исследования продукции провоспалительных цитокинов. Несмотря на то, что можно измерить многочисленные экскреторные цитокины, в данном конкретном случае был выбран мидкин (MDK). МДК является эндогенным маркером воспаления, индуцированным транскрипционным фактором, ядерным фактором каппа-усилителем легкой цепи активированного В-клеточного пути (NF-κB), а также ассоциирован с воспалительными заболеваниями клеток кишечника15. При испытании ЛПС МДК значительно индуцирован по сравнению с контролем (рис. 5).
Рисунок 1: Необработанные контрольные 3D кишечные эквиваленты. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) необработанных контрольных 3D-эквивалентов кишечника (кокультуры Caco-2/U937/L929) в течение 24 ч в качестве проверки эффективности базовой 3D-модели слизистой оболочки кишечника в экспериментальных целях. (A) Приемлемая экспериментальная модель сравнивается с неприемлемыми моделями, демонстрирующими чрезмерный (B) рост эпителия и дезорганизованные слои через 10 дней, (C) чрезмерную толщину и дезорганизацию эпителия, (D) пороки развития и (E) отсутствие слоя эпителиальных клеток. Масштабная линейка на каждом изображении равна 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Обработанные 3D кишечные эквиваленты. (A) Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и окклюдиновая экспрессия 3D-эквивалентов кишечника (кокультуры Caco-2 / U937 / L929) подвергались воздействию в течение 24 ч до 40 мкг/мл общего белка из современной смеси пшеницы с высоким содержанием глютена, по сравнению с контролем (CTRL). Масштабная линейка на каждом изображении равна 50 мкм. (B) Количественная оценка толщины клеток Caco-2 и (C) окклюдиновое красное хромогенное окрашивание. Значимые различия определяли методом односторонней дисперсии (ANOVA) и представляли в виде *** 0,0001< P < 0,001. Черные точки обозначают количество репликаций. Этот рисунок был адаптирован с разрешения Truzzi et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Окрашивание CD14 и CD11B. Окрашивание CD14 моноцитов U937 и дифференцированных макрофагов CD11B U937 в 3D-эквивалентах кишечника (кокультуры Caco-2/U937/L929) при воздействии без добавления белка (контроль [CTRL]) или общего белка 40 мкг/мл из современной пшеничной смеси с высоким содержанием глютена, через 24 ч. Для окрашивания CD14 и CD11b в качестве хромогена использовали быстрый красный цвет, а ядра окрашивали эозином. Масштабная линейка на каждом изображении равна 20 мкм. Окрашивание CD14 и CD11b флуоресцеина изотиоцианатом (зеленый) также было показано при иммунофлуоресценции. Ядра окрашивали 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI). Масштабная линейка на каждом изображении равна 50 мкм. Стрелки указывают на наличие моноцитов (CD14-положительных клеток) и макрофагов (CD11b-положительных клеток). Этот рисунок был адаптирован с разрешения Truzzi et al.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E), а также экспрессия слизи при окрашивании альциановым синим/периодическим кислотно-шиффовым окрашиванием (PAS). (A) Клетки Caco-2 в основных 3D-эквивалентах кишечника (кокультуры Caco-2/U937/L929) через 24 ч в необработанных эквивалентных и реконструированных модельных системах слизистой оболочки кишечника, подвергшихся воздействию липополисахарида в дозе 1 нг/мл. Масштабная линейка на каждом изображении равна 50 мкм. (B) Количественную оценку экспрессии слизи определяли методом односторонней дисперсии (ANOVA) со значением **** P < 0,0001. Черные точки обозначают количество репликаций. Этот рисунок был адаптирован с разрешения Truzzi et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Выражение Мидкина. Экспрессия Midkine в среде 3D-эквивалентов кишечника (кокультуры Caco-2 /U937/L929) через 24 ч в необработанной контрольной (CTRL) и слизистой системах слизистой оболочки кишечника при воздействии 1 нг/мл липополисахарида. Количественную оценку экспрессии мидкинов определяли методом односторонней дисперсии (ANOVA) со значением **** P < 0,0001. Этот рисунок был адаптирован с разрешения Truzzi et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Принципиальная схема, представляющая конструкцию и экспериментальное использование кишечных эквивалентов, а также фиксацию и микроскопический анализ параметров срезов тканей. На схематической диаграмме обобщена конструкция кишечных эквивалентов и возможные экспериментальные методы лечения, которые могут быть применены к этим моделям. Получение нескольких срезов тканей в рамках одного эксперимента позволяет проводить анализ многочисленных структурных и иммунных аспектов слизистой оболочки кишечника, как показано на рисунках 1, 2, 3 и 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленная здесь базовая реконструированная система моделирования слизистой оболочки кишечника (рис. 6) сочетает в себе физиологическую сложность (более физиологически релевантные 3D-клеточные культуры, содержащие монослой Caco-2 с богатой ECM опорой из собственной пластинки, содержащей фибробласты и моноциты) с экспериментальной простотой (использование коммерческих клеточных линий человека для создания стандартизированной и легко воспроизводимой системы)13. Таким образом, эта модельная система считается подходящей альтернативой мышиным моделям, направленным на оценку влияния потенциальных лекарственных препаратов/пищевых компонентов на целостность кишечного барьера. В связи с этим в предыдущих статьях обоснована эффективность данной модели клеточных культур при тестировании как потенциально полезных соединений (плюс дозозависимость), так и вредных пищевых компонентов 7,16,17. Кроме того, ЛПС или альтернативные провоспалительные реагенты (2,4,6-тринитробензолсульфоновая кислота или декстран сульфат натрия) могут быть добавлены к существующей модели слизистой оболочки кишечника для моделирования симптомов ВЗК. Таким образом, потенциально возможно изучение этиологии кишечных заболеваний со структурной точки зрения, а также с точки зрения экспрессии цитокинов, таких как провоспалительный МДК, который является маркером ВЗК15. Эта базовая модельная система также имеет потенциал для скрининга наркотиков для более широких слоев населения. Несмотря на то, что модельная система физиологически более сложна, чем 2D-модели 13,14, ограничения в воспроизведении сложной физиологии человека включают отсутствие как микрофлюидной системы (флюидная перфузия непрерывного поступления питательных веществ и удаления продуктов жизнедеятельности, а также механических раздражителей)8,14 так и микробиома (оценка взаимодействия микробиома хозяина при заболеваниях кишечника)8, 14. См.
Преимущество использования существующей базовой 3D-модели слизистой оболочки кишечника в сочетании с введением парафина для световой микроскопической оценки целостности эпителиального барьера заключается в том, что в одном эксперименте можно сделать несколько срезов ткани, что позволяет анализировать множество параметров. Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER)3 является широко используемым методом для оценки целостности кишечного барьера и используется в сочетании с исследованиями проницаемости макромолекул 3,18, а также широко освещаемыми исследованиями по вестерн-блоттингу экспрессии белка TJ. Вестерн-блоттинг дает количественное представление об общих изменениях экспрессии белка, а TEER служит количественной мерой целостности барьера. Напротив, микроскопическая оценка предоставляет ценный инструмент для качественной визуализации и оценки локальных изменений и взаимодействий белков18.
Микроскопическая оценка модели с иммунным компонентом позволяет визуализировать иммунные реакции, такие как дифференцировка моноцитов в макрофаги и миграция активированных моноцитов в ВКМ, как показано на примере окраски CD14 и CD11b. Идентификация может быть проведена с помощью иммуногистохимии и/или иммунофлуоресцентного окрашивания отдельных срезов тканей, как показано для CD14 и CD11b на рисунке 3. Иммуногистохимия позволяет структурно визуализировать реконструированную ткань слизистой оболочки кишечника в целом. Причем в клетках можно идентифицировать как ядра, так и цитоплазму. Напротив, конфокальная иммунофлуоресценция не позволяет увидеть ткань как единое целое (только интересующие маркеры и DAPI-окрашенные ядра). Тем не менее, он обеспечивает очень чистое изображение, в котором цвет фона отсутствует. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет с большей точностью определять положительную или отрицательную реакцию маркеров и, таким образом, вычислять любые различия в интенсивности цвета (например, маркер, который более выражен в одной ячейке, чем в другой). Потенциально степень миграции моноцитов CD14 из собственной пластинки в монослой Caco-2 также может быть оценена по многочисленным реплицированным изображениям, сделанным в различные моменты времени. Тем не менее, признаки воспаления были очевидны в присутствии клеток, окрашенных как CD14, так и CD11b.
Диапазон 20–40 мкг общего белка используется большинством лабораторий для вестерн-блоттинга19. Количественное определение многочисленных белков щелевого перехода (окклюдина, клаудина, зонулина и Е-кадерина) может быть выполнено путем иммуногистохимического и/или флуоресцентного окрашивания отдельных срезов ткани, что требует соответственно значительно меньшего количества белка. В то же время, из того же эксперимента, целостность эпителиального слоя в ответ на соединения также может быть визуализирована по рисунку, форме и структуре клеток с окрашиванием H&E.
Эффективность базовой 3D-реконструкции слизистой оболочки кишечника для использования в окрашивании производства слизи, белков TJ и белков, продуцируемых в результате иммунных ответов, зависит от преодоления критических этапов, особенно при построении модельной системы и во время фиксации тканей. Что касается построения модели, то использование правильного слияния и засеивания правильного количества клеток Caco-2 (указанных в примечаниях в протоколе) соответственно является основополагающим. Слишком большое количество клеток или неправильное слияние приведет к толстому и дезорганизованному эпителиальному слою. Вместо этого слишком малое количество клеток приведет либо к уменьшению, либо к отсутствию образования эпителиального слоя. Не менее важным при посеве является правильное слияние клеток и количество клеток L929 и U937 в ECM, а также правильное обращение с коллагеном во время приготовления. Избыток клеток или быстрая полимеризация коллагена могут привести к компактной и неправильной форме ECM, что, в свою очередь, повлияет на структуру эпителиальных клеток выше. Аналогичным образом, слишком малое количество коллагенобразующих клеток L929 приведет к неправильной консистенции ECM, в то время как слишком малое количество моноцитов U937 не будет способствовать иммунному ответу. Также важно, чтобы клетки использовались для экспериментов через 5 дней, так как длительная инкубация приведет к чрезмерному росту клеток, что приведет к компактному эпителиальному слою. Более того, учитывая, что в представленной конструкции отсутствует микрофлюидная система и она представляет собой статическую клеточную модель кишечника, чтобы способствовать высвобождению молекул, росту и стимуляции клеток, очень важно, чтобы среда менялась каждый день. Что касается протокола фиксации, то фаза очищения имеет решающее значение, и, учитывая, что время, необходимое для того, чтобы ткани стали прозрачными в парафине, может варьироваться, каждая система слизистой оболочки кишечника должна тщательно наблюдаться во время этой фазы. На протяжении всей процедуры фиксации необходимо соблюдать осторожность при обращении с этими моделями, чтобы не повредить их.
В заключение, при условии строгого соблюдения критических точек в построении и фиксации основных 3D-эквивалентов кишечника, модели могут обеспечить многочисленные срезы тканей для оценки нескольких параметров в фармацевтических скрининговых исследованиях и исследованиях токсичности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Спасибо Фонду Умберто Веронези за стипендию, поддерживающую исследовательскую работу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcian Blue/PAS kit | ScyTek Laboratories, Inc. | APS-1, APS-2 | kit for immunohistochemical staining |
| Blue Trypan solution | Thermo Fisher | 15250061 | cell count analyses |
| Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells | ATCC | ATCC HTB-37 | cell line |
| Citro-Histo-Clear Limonene based | Histoline laboratories | R0050CITRO | reagent for paraffin embedding |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO | 11965092 | cell colture reagent |
| Embedding Center | Histoline laboratories | TEC2900 | instrument for paraffin embedding |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO | A5256701 | cell colture reagent |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 12350039 | cell colture reagent |
| Human Midkine ELISA kit | Cohesion Biosciences | CEK1270 | kit ELISA |
| Inverted microscope | Eclipse Ts2, Nikon | MFA34100 | microscope |
| L929 mouse fibroblasts | ATCC | ATCC ®-CCL1 | cell line |
| LC3-II | Novus Biologicals | NB910-40752SuperNovusPack | antibody |
| L-Glutamine | GIBCO | A2916801 | cell colture reagent |
| Occludin | Novus Biologicals | NBP1-87402 | antibody |
| Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C | Histoline laboratories | R0040 PLUS | instrument for paraffin embedding |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070063 | cell colture reagent |
| rat tail collagen type I | GIBCO | A1048301 | cell colture reagent |
| Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) | GIBCO | 21870076 | cell colture reagent |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360070 | cell colture reagent |
| Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher | TF-CACC2FL | cell counting instrument |
| Transwell | Costar Corning | 3413 | plastic for cell colture |
| Trypsin | GIBCO | 15090046 | cell colture reagent |
| U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line | ATCC | ATCC CRL-1593.2 | cell line |
| UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit | ScyTek Laboratories, Inc. | AMH080 | kit for immunohistochemical staining |
References
- Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (1909).
- Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).
- Suzuki, T. Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions. Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).
- Guibourdenche, M., et al. Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium. Toxics. 9 (6), 135 (2021).
- Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes. Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).
- Truzzi, F., et al. Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).
- Fedi, A., et al. In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review. Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell & Bioscience. 12 (1), 155 (2022).
- Russell, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. Available online. , http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (2023).
- Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
- Jung, S. M., Kim, S. In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases. Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).
- Nitsche, K. S., Müller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review. Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).
- Kekilli, M., et al. Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease. Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).
- Truzzi, F., et al. Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).
- Truzzi, F., et al. Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models. Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).
- Buckley, A. G., et al. Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells. Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
